李 曄，章宇寧，邢麗楠，李 棟，趙小曼，劉青山，閆 磊

（1.北京電子科技職業(yè)學(xué)院 生物工程學(xué)院，北京 100176；2.無(wú)錫百泰克生物技術(shù)有限公司，江蘇 無(wú)錫 271000）

細(xì)胞游離脫氧核糖核酸（cell-free deoxyribonucleic acid，cfDNA）是血液中雙鏈DNA的組成部分之一，通過(guò)細(xì)胞凋亡或壞死釋放到血液中，通常是長(zhǎng)度為150～200個(gè)堿基對(duì)的雙鏈片段[1]，可從血漿中分離出來(lái)，它被發(fā)現(xiàn)存在于血液中距今已有50多年的歷史[2-3]。然而直到1977年，LEON S等[4-7]證明癌癥患者cfDNA水平的升高，才意識(shí)到cfDNA在臨床醫(yī)學(xué)中的重要性。研究發(fā)現(xiàn)，健康血漿樣本中只有極少量的cfDNA（約5～30 ng/mL），外周血cfDNA水平的增加與許多臨床疾病發(fā)生有關(guān)，在遺傳診斷領(lǐng)域，通過(guò)采集孕婦外周血、提取血液中細(xì)胞游離脫氧核糖核酸（cfDNA）并進(jìn)一步分離出游離的胎兒脫氧核糖核酸，結(jié)合下一代測(cè)序技術(shù)（next generation sequencing，NGS）和相關(guān)生物信息分析，對(duì)胎兒的遺傳信息進(jìn)行分析達(dá)到無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷的目的，因此可應(yīng)用于孕婦的無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)[8-9]。除了腫瘤學(xué)和胚胎學(xué)外，cfDNA檢測(cè)也成為糖尿病[10-12]、心腦血管疾病[13-15]、器官移植受體的術(shù)后排異評(píng)估等[16-17]其他疾病診斷和治療的研究熱點(diǎn)[18-19]。所以，全世界的許多實(shí)驗(yàn)室正在研究cfDNA用于非侵入性診斷和預(yù)后。如母體血液中存在的胎兒cfDNA現(xiàn)在已用于非侵入性產(chǎn)前診斷，并且正在逐步探索使用源自腫瘤的cfDNA作為替代標(biāo)記物進(jìn)行臨床研究[20]?；颊哐獫{中cfDNA的分析正在為非小細(xì)胞肺癌患者的早期臨床診斷、基因突變檢測(cè)以及預(yù)后的預(yù)測(cè)、耐藥性監(jiān)測(cè)等方面提供參考，并有望成為重要的液體生物標(biāo)志物和指導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌精準(zhǔn)治療模式中的新方法[21-22]。然而，在孕婦和癌癥患者體內(nèi)，胎兒或腫瘤源性的cfDNA在總cfDNA占比不足10%[23-25]。越來(lái)越多的證據(jù)支持其準(zhǔn)確定量在多種臨床應(yīng)用中的重要意義，如監(jiān)測(cè)腫瘤的克隆進(jìn)化，治療反應(yīng)和長(zhǎng)期疾病監(jiān)測(cè)[26-29]。準(zhǔn)確定量低發(fā)生率的靶標(biāo)cfDNA意味著從采血后的樣本保存和運(yùn)輸過(guò)程中，要盡可能的減少白細(xì)胞的基因組釋放到血液中，這樣才能準(zhǔn)確反映特定cfDNA在血液中的占比?；蚪MDNA（genomic DNA，gDNA）的釋放將會(huì)阻礙下游的檢測(cè)應(yīng)用[30]。其次，要最大限度的防止cfDNA在血液中的降解。防止gDNA釋放到血漿中的一種方法是在采血后立即處理血液[31]。這可能會(huì)限制使用cfDNA的診斷范圍，尤其是在缺少分離血漿的設(shè)備和缺乏運(yùn)輸前低溫儲(chǔ)存的偏遠(yuǎn)地區(qū)。另一種方法是采用特殊的采血管，其中的化學(xué)添加劑能夠穩(wěn)定細(xì)胞的狀態(tài)，從而使樣本能夠在室溫條件下進(jìn)行短時(shí)間存放?，F(xiàn)有采血管主要分為兩類，一類是僅含有抗凝劑成分，如乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、肝素、枸櫞酸鈉等成分，雖可以防止血液凝集，但并沒(méi)有抑制細(xì)胞破裂的作用，因此只能在采血后短時(shí)間內(nèi)（6～48 h）分離血漿，提取游離核酸，能夠保證其不被降解，gDNA干擾較小。由于沒(méi)有防止細(xì)胞破裂的保護(hù)劑，并且要求分離血漿時(shí)間較為苛刻，因此此種方法不適用于邊遠(yuǎn)地區(qū)的血液采樣和運(yùn)輸。另一類采血管包含了抗凝劑以及細(xì)胞穩(wěn)定劑，其中含有甲醛成分，雖然甲醛能夠在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)固定細(xì)胞不破裂，保護(hù)血液不變質(zhì)，但游離的甲醛會(huì)導(dǎo)致DNA與蛋白質(zhì)之間、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間、DNA與DNA之間的交聯(lián)，同時(shí)有可能使核酸甲基化和磷酸二酯鍵斷裂，從而影響提取和檢測(cè)效果。

為了解決上述問(wèn)題，本研究研制了一種新型游離核酸保護(hù)劑，分別在不同溫度和模擬運(yùn)輸條件下，提取游離核酸，檢測(cè)游離核酸濃度，并對(duì)其進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RT-FQPCR）檢測(cè)，以驗(yàn)證保護(hù)劑對(duì)防止血液白細(xì)胞破裂的效果，以期用于血液游離核酸的長(zhǎng)期保存。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

血液（血液捐贈(zèng)志愿者來(lái)自無(wú)錫百泰克生物技術(shù)有限公司，均身體健康，并簽署知情同意書(shū)）；EDTA-2Na采血管：江蘇康捷醫(yī)療器械有限公司；Streck游離核酸采血管：美國(guó)Streck公司；新型游離核酸保護(hù)劑：江蘇無(wú)錫百泰克生物技術(shù)有限公司（目錄號(hào)ST2001）；Humanβ-actin質(zhì)粒：上海捷瑞生物工程有限公司；Qubit抗雙鏈DNA抗體（dsDNA）HS Assay kit（Q32851）：英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司；引物、Taqman探針：生工生物工程（上海）股份有限公司；QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit（Cat.No.55114）：德國(guó)Qiagen公司；Premix ExTaqTM（Code No.RR390A）：寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CFX96 熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國(guó)Bio-Rad公司；Qubit 2.0熒光計(jì)：英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司。

1.3 方法

1.3.1 血液采集和保存條件

采用標(biāo)準(zhǔn)真空穿刺技術(shù)采集外周血，分別保存于EDTA-2Na采血管、Streck游離核酸采血管和含有新型游離核酸保護(hù)劑的采血管，每種采血管均采集4管血液，上下顛倒混勻15次后立即等分4份至無(wú)抗凝劑促凝劑玻璃采血管中，每管2 mL，分別保存于4 ℃、25 ℃、37 ℃三種恒溫環(huán)境中和模擬運(yùn)輸條件220 r/min、25 ℃搖床中。

1.3.2 血漿分離

分別在0、3 d、7 d、14 d分離血漿。血漿分離前，采血管上下輕柔顛倒混勻10次，室溫800 g離心20 min，小心轉(zhuǎn)移血漿至1.5 mL離心管，室溫16 000 r/min離心10 min，緩慢吸取上清轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL離心管，-80 ℃保存至游離核酸提取。

1.3.3 游離核酸提取

將血漿樣品在室溫下解凍，4 ℃，16 000 g離心5 min以去除沉淀蛋白。使用QlAvac 24 Plus真空管，按照試劑盒使用說(shuō)明，使用QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit從1.0 mL血漿中提取游離核酸。其中對(duì)某些步驟進(jìn)行了優(yōu)化：1、沒(méi)有將carrier 核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）添加到Buffer ACL中，因?yàn)閏arrier RNA的加入會(huì)使Qubit定量的背景值偏高；2、加入ProteinaseK60℃水浴時(shí)間從30min延長(zhǎng)至60min，以使被保護(hù)劑交聯(lián)的細(xì)胞充分復(fù)性。

1.3.4 Qubit定量

采用Qubit 2.0，Qubit dsDNA HS Assay kit試劑對(duì)血漿游離核酸定量，取1 μL提取的游離核酸，加入199 μL混合液，選擇“dsDNA：high sensitivity”模式。分別放入Standard 1和Standard 2校準(zhǔn)，而后測(cè)定游離核酸濃度。

1.3.5 引物與探針

本實(shí)驗(yàn)采用Taqman探針?lè)椒?，通過(guò)Genebank檢索Humanβ-actin序列，采用primer premier 5設(shè)計(jì)熒光定量引物及探針。探針及引物序列詳見(jiàn)表1。

表1 Human β-actin引物、探針序列Table 1 Primers and probe sequences of Human β-actin

1.3.6 標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒構(gòu)建

人工合成200bpHumanβ-actin基因片段，插入pGH載體中，轉(zhuǎn)入大腸桿菌MC1022中，過(guò)夜搖菌培養(yǎng)，使用BioTeke Plasmid extraction kit提取pGH-β-actin質(zhì)粒，測(cè)序鑒定。

1.3.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線

提取質(zhì)粒用ND5000超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)得核酸濃度為175.77 ng/μL，根據(jù)其分子質(zhì)量和濃度計(jì)算得到pGH-β-actin的分子濃度為5.20×1010copies/μL。將質(zhì)粒10倍梯度稀釋，獲得1×107、1×106、1×105、1×104、1×103拷貝數(shù)質(zhì)粒，擴(kuò)增檢測(cè)試劑的線性范圍和標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

1.3.8 絕對(duì)熒光定量反應(yīng)體系

20 μL反應(yīng)體系中含有2×Premix ExTaqTM10 μL、正/反向引物（10 mmol/L）各1 μL、探針（10 mmol/L）0.5 μL，質(zhì)?；蛱崛〉挠坞x核酸2.5 μL，ddH2O 5 μL。使用CFX96熒光定量PCR儀進(jìn)行反應(yīng)，條件為50 ℃5 min，95 ℃5 min，95 ℃10 s，60 ℃30 s，循環(huán)40次（此步采集熒光信號(hào)）。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程

在本研究中使用pGH-β-actin質(zhì)粒，采用5'FAM標(biāo)記的探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，在此條件下獲得的標(biāo)準(zhǔn)方程為y=-3.3356x+39.746，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明此熒光定量體系在102～109copies的模板條件下進(jìn)行定量，具有良好的線性關(guān)系。

2.2 血漿分離現(xiàn)象

含有3種保護(hù)血液成分的采血管，在25 ℃條件下分別在保存第0、3 d、7 d、14 d對(duì)其保存的血液進(jìn)行血漿分離，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，從血漿的顏色可以直觀的觀察到保護(hù)劑對(duì)血液的穩(wěn)定效果。在保存的第0～3天內(nèi)，三種保護(hù)劑分離出的血漿均呈現(xiàn)正常的淡黃色。保存至第7天時(shí)，只含有EDTA-2Na抗凝成分的血漿已經(jīng)出現(xiàn)了明顯紅褐色，說(shuō)明紅細(xì)胞出現(xiàn)破裂，大量的血紅素和血紅蛋白釋放到血漿中。保存至第14天時(shí)，只含有EDTA-2Na抗凝成分的血漿溶血現(xiàn)象進(jìn)一步加劇，與此同時(shí)，Streck游離核酸保存管中的血液分離出的血漿也出現(xiàn)了明顯的溶血現(xiàn)象。表明使用了新型保護(hù)劑的血漿溶血現(xiàn)象相較于Streck保存管中的樣本更輕微。

圖1 不同保存管在25 ℃條件下血漿分離效果Fig. 1 Plasma separation effect of different blood storage tube preserved at 25 ℃

2.3 游離核酸定量

運(yùn)用Qubit定量技術(shù)對(duì)保存于不同保護(hù)劑、不同溫度條件下的血液中游離核酸進(jìn)行定量，結(jié)果見(jiàn)圖2。同時(shí)采用絕對(duì)熒光定量的方法，對(duì)提取的游離核酸中Humanβ-actin拷貝數(shù)進(jìn)行定量，結(jié)果見(jiàn)圖3。

由圖2可知，在4～37 ℃保存溫度范圍，隨著溫度的升高，只含有EDTA-2Na抗凝成分的采血管，紅細(xì)胞及白細(xì)胞破裂加劇，以第0天提取的游離核酸為對(duì)照，在4 ℃、25 ℃、37 ℃保存3 d游離核酸的拷貝數(shù)分別提高5.0、7.6、37.5倍，保存至第7天，分別提高75.6、86.9、1366.9倍。同時(shí)發(fā)現(xiàn)低溫條件可以一定程度上抑制細(xì)胞的破裂和基因組的釋放。Streck游離核酸保存管保存的血液，在4 ℃、25 ℃、37 ℃保存溫度條件下，保存至第7天的游離核酸質(zhì)量濃度分別是第0天濃度的3.2、4.6、6.9倍，保存至14 d的分別是第0天時(shí)的65.9、98.9、76.2倍，結(jié)果表明，Streck游離核酸保存管能在4～37 ℃保存7 d內(nèi)，維持血細(xì)胞的形態(tài)和游離核酸的質(zhì)量濃度，第14天時(shí)，基因組雖然有釋放，但相比于只含有EDTA-2Na的保存管，保護(hù)能力大大增強(qiáng)。而加入新型保護(hù)劑的實(shí)驗(yàn)組，在4～37 ℃條件下，保存至第14天的游離核酸質(zhì)量濃度為第0天的1.7、1.5、1.9倍。

圖2 3種保存管4 ℃（A）、25 ℃（B）及37 ℃（C）保存血液Qubit定量Fig. 2 Qubit quantification of three storage tubes preserved at 4 ℃(A),25 ℃(B) and 37 ℃(C)

由圖3核酸定量數(shù)據(jù)表明，在4 ℃、25 ℃和37 ℃的保存條件下，分別以第0天，3天，7天和14天為檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)，檢測(cè)血液樣品中的Humanβ-actin拷貝數(shù)，可見(jiàn)隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)EDTA-2Na保存的血液核酸濃度均出現(xiàn)了明顯的升高；Streck游離核酸保存管保存的血液，在0～7天時(shí)，保存效果穩(wěn)定，但在第14天時(shí)，均出現(xiàn)了核酸濃度明顯上升的現(xiàn)象。而采用新型保護(hù)劑保存的血液，保存至第14天，游離核酸濃度均未出現(xiàn)明顯增高趨勢(shì)。將三個(gè)圖對(duì)比發(fā)現(xiàn)：相同的保存天數(shù)，由于溫度的不同會(huì)導(dǎo)致核酸濃度的變化，隨著溫度的升高，核酸濃度越高，EDTA-2Na保存的血液核酸濃度在保存至第14天時(shí)，已經(jīng)超出了Qubit檢測(cè)范圍。采用新型保護(hù)劑保存的血液，隨著溫度的上升，游離核酸濃度均未出現(xiàn)明顯增高趨勢(shì)。因此，新型的游離核酸保護(hù)劑能夠在14 d內(nèi)維持白細(xì)胞、紅細(xì)胞的形態(tài)穩(wěn)定，有效抑制基因組釋放和溶血現(xiàn)象。

圖3 3種保存管4 ℃（A）、25℃（B）及37 ℃（C）保存血液Human β-actin real-time PCRFig. 3 Real-time PCR of Human β-actin of three storage tubes preserved at 4 ℃(A),25 ℃(B) and 37 ℃(C)

25 ℃，220 r/min模擬運(yùn)輸條件下，三種保護(hù)劑的保存效果分別見(jiàn)圖4、圖5。由圖4和圖5可知，EDTA-2Na保存的血液在第3天已經(jīng)發(fā)生明顯的基因組釋放，第7～14天，釋放量加劇。新型保護(hù)劑和Streck保存管在保存至第14天時(shí)，游離核酸量分別提高至初始條件的3.4倍和42倍，說(shuō)明新型保護(hù)劑在模擬運(yùn)輸條件下，更能有效的抑制基因組釋放。

圖4 模擬運(yùn)輸條件下3種保存管保存血液Qubit定量Fig. 4 Qubit quantification of three storage tubes under simulating transportation circumstance

圖5 模擬運(yùn)輸條件下3種保存管保存血液Human β-actin real-time PCR結(jié)果Fig. 5 Real-time PCR result for Human β-actin of three storage tubes under simulating transportation circumstance

3 討論

外周血中游離核酸用于腫瘤診斷由來(lái)已久，但因技術(shù)限制和認(rèn)知局限等種種原因一直未受到重視。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，游離核酸在腫瘤診治中的價(jià)值成為研究的熱點(diǎn)。人們研究發(fā)現(xiàn)血漿游離DNA變化能夠反映腫瘤的生物學(xué)特性和臨床特征，有望成為新一代血漿腫瘤標(biāo)志物，用于腫瘤的診斷和預(yù)后監(jiān)測(cè)。

常規(guī)條件下，含有常用抗凝劑的新鮮血液采集、儲(chǔ)存和運(yùn)輸過(guò)程中，血液中有核細(xì)胞容易破碎并釋放出細(xì)胞基因組DNA及其他成分，導(dǎo)致血漿中游離DNA成分受到污染，或者受到核酸酶介導(dǎo)的降解等影響，這些情況會(huì)嚴(yán)重影響以上的各項(xiàng)檢測(cè)應(yīng)用。本研究研制的新型保護(hù)劑，在抗凝劑的基礎(chǔ)上，添加穩(wěn)定血液的成分，能夠在4～37 ℃條件下穩(wěn)定維持血細(xì)胞的狀態(tài)，防止gDNA的釋放。結(jié)果表明，在4～37 ℃保存溫度范圍，隨著溫度的升高和保存時(shí)間的延長(zhǎng)，EDTANa2保存的血液核酸濃度均出現(xiàn)了明顯的升高，并且溫度越高，核酸濃度越高，在保存至14天時(shí)，已經(jīng)超出了Qubit檢測(cè)范圍。Streck游離核酸保存管保存的血液在4種保存條件下，在0～7 d時(shí)，保存效果穩(wěn)定，但在第14天時(shí)，均出現(xiàn)了核酸濃度明顯上升的現(xiàn)象。采用新型保護(hù)劑保存的血液，在4種保存條件下，保存至14 d，游離核酸濃度均未出現(xiàn)明顯增高趨勢(shì)，模擬運(yùn)輸條件下的保存結(jié)果與溫度結(jié)果一致。Humanβ-actin絕對(duì)定量結(jié)果與Qubit定量結(jié)果一致。因此新型的游離核酸保護(hù)劑能夠在14 d內(nèi)維持白細(xì)胞、紅細(xì)胞的形態(tài)穩(wěn)定，有效抑制基因組釋放和溶血現(xiàn)象，提高了提取的游離核酸純度，為下游游離核酸的數(shù)據(jù)分析提高了靈敏度，降低了背景gDNA的干擾。

4 結(jié)論

綜上所述，新型的游離核酸保護(hù)劑，能夠在4～37 ℃條件下穩(wěn)定血液中的血細(xì)胞形態(tài)，防止gDNA的釋放，同時(shí)在振動(dòng)條件下，也能有效防止細(xì)胞破裂，因此，以此種保護(hù)劑為添加劑，可以大大拓寬以游離核酸為研究樣本的采樣區(qū)域，非常適合于樣本庫(kù)中血液樣本的采集運(yùn)輸，同時(shí)也為腫瘤的液態(tài)活檢應(yīng)用提供了良好的工具。