王若男，錢 程，鄭 鵬，李方凱，王 洲，王 暉，錢森和*

（1.安徽工程大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院，安徽 蕪湖 241000；2.安徽師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，安徽 蕪湖 241000）

黃精（Polygonatum sibiricum）為百合科黃精屬多年生草本植物，在我國(guó)資源豐富，主要分布在安徽、云南、貴州、湖南和四川等地[1]。黃精是藥食同源中的食材，主要藥用部位為其塊莖，近年來，學(xué)者們運(yùn)用現(xiàn)代生物學(xué)手段及中醫(yī)研究方法對(duì)其有效成分、藥理作用及機(jī)制等進(jìn)行了大量研究，并取得了一定的成果[2-3]。黃精中含有的多糖、低聚糖、甾體皂苷、多酚、黃酮、氨基酸和微量元素等成分具有清熱解暑、改善記憶力、抗癡呆、抗衰老、抗氧化、降血糖血脂和免疫調(diào)節(jié)等多種生理功能[4-5]。

黃精功能活性研究往往基于黃精活性成分提取基礎(chǔ)之上，目前，黃精活性成分的提取主要有水提醇沉法、超聲波輔助提取法和閃式提取法等。每種方法的提取效果各不相同，水提醇沉法方便簡(jiǎn)單，但提取率較低，耗時(shí)較長(zhǎng)[6]；超聲波提取法具有節(jié)省溶劑使用量，提高有效成分的產(chǎn)率，縮短提取時(shí)間等特點(diǎn)，但會(huì)破壞植物細(xì)胞，使活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)遭到破壞[7]；閃式提取法具有盡可能保留和利用植物中的有效化學(xué)成分，使植物體內(nèi)有效成分不被熱損害、溶劑使用量相對(duì)較小、提取時(shí)間短和提取率高等特點(diǎn)，但對(duì)技術(shù)要求比較高[8]。微生物發(fā)酵法是一種生物轉(zhuǎn)化法，在很多活性成分的研究中均有應(yīng)用[9]。發(fā)酵提取法主要是利用微生物產(chǎn)生的酶類降解植物的細(xì)胞壁，使植物細(xì)胞內(nèi)的活性物質(zhì)成分得以釋放，從而達(dá)到高效提取植物活性物質(zhì)的目的；同時(shí)，在發(fā)酵過程中可以有效降解植物中的有毒成分或?qū)⑵滢D(zhuǎn)化為低毒物質(zhì)[10-11]；另外，常選擇微生物發(fā)酵方式來實(shí)現(xiàn)一些活性先導(dǎo)化合物的合成，主要是利用微生物生長(zhǎng)過程中的次級(jí)代謝產(chǎn)生的酶對(duì)底物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，從而產(chǎn)生新的化合物，提高產(chǎn)物的活性[12]。在一些發(fā)酵過程中，采用混菌發(fā)酵模式，利用不同微生物之間的相互協(xié)同和互補(bǔ)作用，從而提高產(chǎn)物提取率或產(chǎn)物轉(zhuǎn)化效率[13]。本研究選用乳酸菌和酵母菌混合菌種發(fā)酵黃精塊莖，以發(fā)酵產(chǎn)物的DPPH自由基清除率為檢測(cè)指標(biāo)，優(yōu)化黃精的發(fā)酵工藝條件；并對(duì)黃精提取物中主要活性成分與抗氧化活性的關(guān)系進(jìn)行了初步研究，以期為黃精功能性產(chǎn)品開發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞頭黃精塊莖：安徽鳳巢生物科技有限公司提供；嗜酸乳酸菌（Lactobacillus acidophilus）CICC6075：中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心；酵母菌（Saccharomyces）：本實(shí)驗(yàn)室自篩保存菌種。

2,2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS）、1,1-二 苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、蛋白胨、葡萄糖、無水乙醇、過氧化氫、濃硫酸、水楊酸：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；福林-酚：上海康朗生物科技有限公司；乙酸鈉、硫酸鎂、過硫酸鉀、硫酸亞鐵、6%苯酚：上海南翔試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)所用試劑皆為分析純或生化試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

TG-16臺(tái)式低速離心機(jī)：湖南湘儀有限公司；HH-1A 恒溫磁力攪拌器：上海眾越儀器有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；ZQZY-70BF振蕩培養(yǎng)箱：上海知楚儀器有限公司；Multiskan FC全自動(dòng)酶標(biāo)儀：美國(guó)賽默飛世爾科技公司；YM-50Z立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海三申醫(yī)療器械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黃精發(fā)酵液和水提液的制備

將黃精塊莖切片于50 ℃條件下干燥至質(zhì)量恒定，粉碎過80目篩，按不同比例加去離子水配制成黃精水溶液，加入2%的葡萄糖和1%的胰蛋白胨，115 ℃條件下滅菌30 min后接入一定量的乳酸菌和酵母菌，在一定條件下進(jìn)行發(fā)酵。黃精水提液的提取條件除不添加培養(yǎng)基與菌種發(fā)酵外，其他條件同發(fā)酵法。

1.3.2 黃精發(fā)酵液制備工藝條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

混合菌種接種量1%、混合菌種比例（乳酸菌∶酵母菌）1∶1、料液比1∶30（g∶mL）、發(fā)酵溫度37 ℃、發(fā)酵時(shí)間36 h，在其他條件不變的情況下考察混合菌種接種量（1%、2%、3%、4%、5%，V/V）；混合菌種比例（乳酸菌∶酵母菌=1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1，V/V）；料液比（1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60（g∶mL））；發(fā)酵溫度（29 ℃、33 ℃、37 ℃、41 ℃、45 ℃）；發(fā)酵時(shí)間（12 h、24 h、36 h、48 h、60 h）對(duì)發(fā)酵液中的DPPH自由基清除率的影響，所有的單因素試驗(yàn)均進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)。

1.3.3 黃精發(fā)酵液制備條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選擇對(duì)黃精發(fā)酵液DPPH自由基清除率影響較大的混合菌種接種量（A）、料液比（B）和混合菌種比例（C）為自變量，黃精發(fā)酵液DPPH自由基清除率（Y）為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)Box-Behnken 3因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)見表1。

表1 制備工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface tests for preparation technology optimization

1.3.4 測(cè)定方法

DPPH自由基清除能力測(cè)定：參照參考文獻(xiàn)[14]的方法略作修改。取100 mL棕色容量瓶，用無水乙醇溶液現(xiàn)配0.1 mmol/L的DPPH溶液，避光保存。將樣品與DPPH溶液等體積混合，避光反應(yīng)30 min后，測(cè)定波長(zhǎng)517 nm處的吸光度值，記為A1；以體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇與DPPH等體積混合為空白組，記為A0；以樣品溶液與體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇等體積混合為對(duì)照組，記為A2。樣品的DPPH自由基清除率按照下式計(jì)算：

ABTS+自由基清除測(cè)定：參照參考文獻(xiàn)[15]的方法略作修改。將7 mmol/L ABTS+母液與等體積的2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液混合后，用無水乙醇將ABTS+母液稀釋，使其在734 nm處的吸光值在0.70左右，備用；然后將樣品與等體積的ABTS+溶液反應(yīng)6 min后測(cè)定波長(zhǎng)734 nm處的吸光度值，記為A1；以蒸餾水作為空白對(duì)照，記為A0。樣品的ABTS+自由基清除率按照下式計(jì)算：

羥基自由基清除能力：參照參考文獻(xiàn)[16]的方法略作修改。將1 mL樣品溶液與等體積的9 mmol/L乙醇-水楊酸溶液、9 mmol/L FeSO4溶液和8.8 mmol/L H2O2溶液混合，37 ℃反應(yīng)15 min，測(cè)定波長(zhǎng)510 nm處的吸光度值，記為A2；以蒸餾水代替樣品作為空白組，記為A1；以蒸餾水代替H2O2作為對(duì)照組，記為A3。樣品的羥基自由基清除率按照下式計(jì)算：

黃精多糖的測(cè)定：參照參考文獻(xiàn)[17-18]的方法；黃精多酚的測(cè)定：參照參考文獻(xiàn)[19]的方法；黃精黃酮的測(cè)定：參照參考文獻(xiàn)[20]的方法。

1.3.5 數(shù)據(jù)整理與統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，采用Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)與回歸分析，Origin 2018對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃精發(fā)酵液制備條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.1.1 混合菌種接種量對(duì)黃精發(fā)酵液DPPH自由基清除率的影響

合適的接種量對(duì)微生物發(fā)酵具有重要的意義，因?yàn)榘l(fā)酵菌株初期的生長(zhǎng)會(huì)受到接種量高低的影響，若接種量過低，將會(huì)導(dǎo)致菌株生長(zhǎng)緩慢，容易造成雜菌污染；若接種量過高，培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗過快而不利于發(fā)酵的進(jìn)行[21]?；旌暇N接種量對(duì)黃精發(fā)酵液DPPH自由基清除率的影響見圖1。由圖1可知，黃精發(fā)酵液的DPPH自由基清除率隨接種量的增加呈先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)接種量為2%時(shí)，黃精發(fā)酵液的DPPH自由基清除率最高，為63.54%；繼續(xù)增加接種量，黃精發(fā)酵液的DPPH自由基清除率反而下降，可能是因?yàn)榻臃N量超過一定程度微生物生長(zhǎng)受到抑制，多糖、多酚等一些活性物質(zhì)得率不高[22]。故選擇最適黃精發(fā)酵的混合菌種接種量為2%。

圖1 混合菌種接種量對(duì)黃精發(fā)酵液DPPH自由基清除率的影響Fig. 1 Effect of mixed strains inoculum on DPPH radical scavenging rate of Polygonatum sibiricum fermentation broth

2.1.2 混合菌種菌種比例對(duì)黃精發(fā)酵液DPPH自由基清除率的影響

采用酵母菌和乳酸菌進(jìn)行組合發(fā)酵，主要是利用不同菌種在不同發(fā)酵階段的互補(bǔ)作用，酵母菌在發(fā)酵初期會(huì)消耗氧氣，這為乳酸菌創(chuàng)造了適宜生長(zhǎng)的無氧條件；當(dāng)培養(yǎng)基中氧氣量低于乳酸菌發(fā)酵臨界氧氣量時(shí)，乳酸菌開始產(chǎn)酸，并抑制其他微生物的生長(zhǎng)；乳酸菌和酵母菌的這種互補(bǔ)關(guān)系，使得這兩種菌種組合發(fā)酵的效果優(yōu)于單獨(dú)作用的效果[23]?；旌暇N比例對(duì)黃精發(fā)酵液DPPH自由基清除率的影響見圖2。由圖2可知，隨著乳酸菌與酵母菌比例的變化，黃精發(fā)酵液DPPH自由基清除率逐漸升高，當(dāng)菌種比例為2∶1時(shí)，DPPH自由基清除率最高，為65.43%；隨著酵母菌比例的降低發(fā)酵液DPPH自由基清除率在逐漸上升，酵母菌的比例過大會(huì)產(chǎn)生菌群優(yōu)勢(shì)，抑制乳酸菌的生長(zhǎng)。當(dāng)乳酸菌的比例逐漸增大時(shí)，在酵母菌所創(chuàng)造的無氧條件下能夠快速進(jìn)入到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，保持較好的生物活性。如果乳酸菌濃度過大會(huì)快速消耗營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而導(dǎo)致后期營(yíng)養(yǎng)不足，可能會(huì)消耗黃精所釋放出來的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[24]。故將黃精發(fā)酵的菌種最佳比例選擇為乳酸菌∶酵母菌為2∶1。

圖2 菌種比例對(duì)黃精發(fā)酵液DPPH自由基清除率的影響Fig. 2 Effect of strains ratio on DPPH radical scavenging rate of Polygonatum sibiricum fermentation broth

2.1.3 料液比對(duì)黃精發(fā)酵液DPPH自由基清除率的影響

料液比對(duì)發(fā)酵的結(jié)果也有著一定的影響。發(fā)酵液的料液比對(duì)黃精發(fā)酵液DPPH自由基清除率的影響見圖3。

圖3 料液比對(duì)黃精發(fā)酵液DPPH自由基清除率的影響Fig. 3 Effect of solid-liquid ratio on DPPH radical scavenging rate of Polygonatum sibiricum fermentation broth

由圖3可知，當(dāng)料液比在1∶20～1∶50（g∶mL）的范圍內(nèi)，黃精發(fā)酵液的DPPH自由基清除率隨著料液比的增大而增大；當(dāng)料液比為1∶50（g∶mL）時(shí)，發(fā)酵液的DPPH自由基清除率最高，為73.12%；隨著料液比比例的變化出現(xiàn)了先逐漸上升后緩慢上升再下降的趨勢(shì)。應(yīng)該是在1∶40（g∶mL）時(shí)黃精多糖及一些物質(zhì)的析出出現(xiàn)了飽和狀態(tài)，再增大比例活性物質(zhì)溶出率也在上升，到達(dá)工藝上限[25]。故選擇黃精發(fā)酵液的最適料液比為1∶50（g∶mL）。

2.1.4 發(fā)酵溫度對(duì)黃精發(fā)酵液DPPH自由基清除率的影響

溫度是影響微生物生長(zhǎng)與發(fā)酵的一個(gè)重要因素，乳酸菌的發(fā)酵溫度一般在40 ℃左右，酵母菌的發(fā)酵溫度在40～42 ℃[26]。發(fā)酵溫度對(duì)黃精發(fā)酵液DPPH自由基清除率的影響見圖4。

圖4 發(fā)酵溫度對(duì)黃精發(fā)酵液DPPH自由基清除率的影響Fig. 4 Effect of fermentation temperature on DPPH radical scavenging rate of Polygonatum sibiricum fermentation broth

由圖4可知，當(dāng)發(fā)酵溫度為41 ℃時(shí)，黃精發(fā)酵液的DPPH自由基清除率最高，為72.11%；可能是因?yàn)槿樗峋c酵母菌在稍低溫度下活力不強(qiáng)，在41 ℃時(shí)溫度比較適宜。但溫度稍高時(shí)菌種的活力不會(huì)有太大影響，但會(huì)使黃精活性物質(zhì)在此溫度下浸出[27]。因此，選擇黃精發(fā)酵液的最適發(fā)酵溫度為41 ℃。

2.1.5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)黃精發(fā)酵液DPPH自由基清除率的影響

發(fā)酵時(shí)間對(duì)黃精發(fā)酵液DPPH自由基清除率的影響見圖5。

圖5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)黃精發(fā)酵液DPPH自由基清除率的影響Fig. 5 Effect of fermentation time on DPPH radical scavenging rate of Polygonatum sibiricum fermentation broth

由圖5可知，在一定的時(shí)間范圍內(nèi)，黃精發(fā)酵液的DPPH自由基清除率隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而增高，可能是由于隨著發(fā)酵過程的不斷進(jìn)行，發(fā)酵液中的小分子如酚類物質(zhì)逐漸增多，而DPPH自由基容易與小分子酚類物質(zhì)給出的H+發(fā)生共振雜化反應(yīng)，生成穩(wěn)定產(chǎn)物，從而提高黃精發(fā)酵液的抗氧化活性。在發(fā)酵時(shí)間為24 h時(shí)黃精發(fā)酵液的DPPH自由基清除率最高，為81.23%。但當(dāng)發(fā)酵時(shí)間超過24 h后，黃精發(fā)酵液的DPPH反而降低，其原因可能是發(fā)酵過程中產(chǎn)生的有關(guān)酶類降解了酚類物質(zhì)，從而使黃精發(fā)酵液的DPPH自由基清除率逐漸降低[28]；因此，選擇最適發(fā)酵時(shí)間為24 h。

2.2 黃精發(fā)酵液制備工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

表2 黃精發(fā)酵液制備工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of response surface tests for preparation technology optimization of Polygonatum sibiricum fermentation broth

由表3可知，模型的P值＜0.05，失擬項(xiàng)P值＞0.05，說明此模型顯著，且模型不失擬；另外，決定系數(shù)R2=0.937 0，調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.8235，表明該模型具有較好的擬合度。根據(jù)擬合得到DPPH自由基清除率（Y）與混合菌種接種量（A）、混合菌種比例（B）和料液比（C）的二次多元回歸方程為：Y=86.64+2.27A+1.18B+9.06C+2.52AB-21.13AC+16.60BC-12.93A2-26.69B2-11.26C2。該回歸方程在一定程度上可預(yù)測(cè)DPPH自由基清除率隨各因素的變化。同時(shí)，由表3方差分析還可以看出，一次項(xiàng)C和交互項(xiàng)BC對(duì)結(jié)果影響達(dá)到了顯著水平（P＜0.05），交互項(xiàng)AC和二次項(xiàng)B2對(duì)結(jié)果影響達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）；并由各因素F值得大小可知，各因素的主效應(yīng)關(guān)系為C（料液比）＞A（混合菌種接種量）＞B（混合菌種比例）。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

2.2.2 各因素交互作用的分析

由圖6可知，接種量（A）與菌種比例（B）的交互作用的響應(yīng)面圖較為平坦，說明接種量與菌種比例的交互作用不明顯，對(duì)黃精發(fā)酵液DPPH自由基清除率的影響較?。稽S精發(fā)酵液的DPPH自由基清除能力隨接種量和料液比（C）的升高而升高，表明料液比與接種量之間具有較強(qiáng)的交互作用；黃精發(fā)酵液DPPH自由基清除率隨著菌種比例與料液比的升高均呈現(xiàn)先增加后減少趨勢(shì)，表明菌種比例與料液比之間同樣具有較強(qiáng)的交互作用。根據(jù)模型擬合，得到最佳接種量為2.09%，菌種比例為2.03∶1，料液比為1∶46.2（g∶mL），在此條件下黃精發(fā)酵液的DPPH自由基清除率的理論值達(dá)到86.76%。

圖6 混合菌種接種量、混合菌種比例、料液比交互作用對(duì)黃精發(fā)酵液DPPH自由基清除率影響的響應(yīng)曲面及等高線Fig. 6 Response surface plots and contour lines of the effects of interaction between mixed strains inoculum,mixed strains ratio and solid-liquid ratio on DPPH radical scavenging rate of Polygonatum sibiricum fermentation broth

2.2.3 最佳發(fā)酵條件的驗(yàn)證

為方便實(shí)際操作，修改黃精發(fā)酵液制備條件為混合菌種接種量2%，菌種比例2∶1，料液比1∶46（g∶mL），發(fā)酵溫度41 ℃，發(fā)酵時(shí)間24 h。在此優(yōu)化工藝條件下得到實(shí)際的黃精發(fā)酵液DPPH自由基清除率實(shí)際值為91.10%，與預(yù)測(cè)值接近。由此可見該模型較為可靠，具有一定的實(shí)用價(jià)值。

2.3 黃精發(fā)酵液和水提液抗氧化活性與主要活性成分分析

為了比較黃精發(fā)酵液與水提液抗氧化活性大小，對(duì)黃精發(fā)酵液和水提液的DPPH、ABTS+、羥基自由基清除率進(jìn)行了測(cè)定，以1 mg/mL抗壞血酸作為陽性對(duì)照，結(jié)果見表4。對(duì)黃精發(fā)酵液和水提液的多糖、多酚和黃酮得率進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果見表5。抗氧化活性與活性成分相關(guān)性結(jié)果見表6。

表4 黃精發(fā)酵液與水提液抗氧化活性比較Table 4 Comparison of antioxidant activities between fermentation broth and water extract of Polygonatum sibiricum

表5 水提法和發(fā)酵法的黃精多糖、多酚和黃酮得率比較Table 5 Comparison of Polygonatum sibiricum polysaccharide,polyphenols and flavonoids contents in water extraction and fermentation method

由表4可知，黃精發(fā)酵液的DPPH、ABTS+自由基清除率均顯著高于黃精水提液（P＜0.05），而兩者之間的羥基自由基清除率差異不顯著（P＞0.05），表明黃精經(jīng)過微生物發(fā)酵后可以顯著提高其DPPH和ABTS+自由基的清除率。

由表5可知，黃精發(fā)酵液的多糖得率極顯著高于水提液（P＜0.01），多酚和黃酮得率均顯著高于水提液（P＜0.05）。可能是因?yàn)槲⑸锇l(fā)酵過程中產(chǎn)生的相關(guān)酶類能夠降解細(xì)胞壁成分，從而使得多糖、多酚和黃酮類物質(zhì)向胞外釋放[29-30]。

由表6可知，ABTS+自由基清除率與多糖含量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與多酚含量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與黃酮含量正相關(guān)，但相關(guān)不顯著（P＞0.05）；DPPH自由基清除率與多糖含量顯著正相關(guān)（P＜0.05），與多酚和黃酮含量極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；羥基自由基清除率與多糖、多酚和黃酮含量具有一定的正相關(guān)性，但相關(guān)性不顯著。

表6 黃精多糖、多酚和黃酮含量與抗氧化活性的相關(guān)性Table 6 Correlation between Polygonatum sibiricum polysaccharide,polyphenol and flavone contents and antioxidant activity

3 結(jié)論

以DPPH自由基清除率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，以乳酸菌和酵母菌為菌種，對(duì)黃精液態(tài)發(fā)酵工藝進(jìn)行了優(yōu)化，得到最佳發(fā)酵條件為接種量2%、乳酸菌∶酵母菌2∶1、發(fā)酵時(shí)間24 h、發(fā)酵溫度41 ℃和料液比1∶46（g∶mL）；在此條件下，黃精發(fā)酵液DPPH自由基的實(shí)際清除率為91.10%。黃精多糖和多酚含量與ABTS+自由基清除率和DPPH自由基清除率呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），黃酮含量與羥基自由基清除率呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），表明多糖、多酚和黃酮對(duì)黃精抗氧化活性有著重要影響；微生物發(fā)酵法可以提高多糖、多酚和黃酮的得率，從而使得發(fā)酵法的抗氧化活性顯著高于水提法。