張二豪，楊 雪，張 鑫，尹 秀，祿亞洲*

（西藏農(nóng)牧學(xué)院 食品科學(xué)學(xué)院，西藏 林芝 860000）

藏東南地區(qū)位于青藏高原東南部，其特殊的地理位置和氣候環(huán)境，適合果樹種植，素有“西藏江南”和“水果之鄉(xiāng)”之稱[1]。蘋果（Malus pumila）屬薔薇科（Rosaceae）蘋果屬（Malus），多年生落葉喬木植物，其性涼味甘，酸甜可口且營養(yǎng)豐富，具有很高的營養(yǎng)價值和保健功效。水果表皮含豐富的微生物資源，其表皮微生物群落結(jié)構(gòu)組成對釀造果酒和果醋的品質(zhì)具有一定的影響[2]。由于地理環(huán)境和水果基質(zhì)的差異，分離適合釀造果酒和果醋的本土酵母菌成為人們研究的熱點[3-5]。根際土壤微生物作為果園生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，對植物生長起著至關(guān)重要的作用，其微生物組成及代謝在植物根際養(yǎng)分循環(huán)和能量代謝中發(fā)揮著重要作用，因此，根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)組成是衡量土壤質(zhì)量的重要指標[6-8]。綜上所述，研究水果表皮及根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)組成對開發(fā)利用本土益生微生物資源和改善果樹根際微生態(tài)具有重要意義。

水果表皮及根際土壤微生物與其生長環(huán)境和土壤質(zhì)地息息相關(guān)。中國作為世界上蘋果生產(chǎn)和消費大國，蘋果種植區(qū)域廣泛，氣候類型和土壤質(zhì)地多樣，致使其微生物資源豐富多樣。目前，有關(guān)蘋果的研究主要集中在蘋果酒和蘋果醋加工工藝、營養(yǎng)價值及蘋果連作土壤微生物等方面[9-12]，而有關(guān)藏東南產(chǎn)區(qū)蘋果表皮及根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)組成的研究尚未見報道。

目前用于微生物多樣性分析的方法主要包括傳統(tǒng)純培養(yǎng)法和非培養(yǎng)法。由于純培養(yǎng)法無法分離非可培養(yǎng)微生物的缺點，非培養(yǎng)法得到廣泛的應(yīng)用。高通量測序技術(shù)作為非培養(yǎng)的一種，由于其準確性、高通量大、能夠反映其真實環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)組成的優(yōu)點，因此被廣泛用于環(huán)境微生物檢測[13-15]。本實驗以西藏林芝蘋果表皮及其根際土壤微生物為材料，基于高通量測序技術(shù)對蘋果表皮及根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)組成進行分析，并對兩個樣品中的優(yōu)勢細菌屬和優(yōu)勢真菌屬進行了關(guān)聯(lián)性分析，以期為本土蘋果表皮微生物資源的開發(fā)和利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選用藏東南產(chǎn)區(qū)蘋果（N：29°40′07.39″，E：94°20′21.23″；海拔：2 991 m）為實驗材料，采用“五點采樣法”，手帶無菌手套，使用經(jīng)體積分數(shù)75%的酒精消毒后的剪刀采集5棵果樹的新鮮無病害的蘋果果實（采集時間為2019年10月），置于無菌采樣袋中混合后，放入低溫采樣箱并帶回實驗室，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

隨機選取5棵健康蘋果樹，利用“抖根法”采集根際土壤樣品，并置于無菌采樣袋中，放入低溫采樣箱并帶回實驗室，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

每組設(shè)3個重復(fù)，分別記為蘋果表皮樣品（A）和根際土壤樣品（AS）。

TransStart FastPfu脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）聚合酶（2.5 U/μL）：北京全式金生物技術(shù)股份有限公司；瓊脂糖（分析純）：美國Invitrogen公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

NanoDrop2000微量分光光度計：美國Thermo公司；DYCP-32C型瓊脂糖水平電泳儀：北京六一儀器廠；Eppendorf 5424R 高速冷凍離心機：德國Eppendorf公司；Bio-Rad T100聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀、凝膠回收試劑盒：美國Bio-Rad公司；Illumina Misq測序平臺：美國Illumina公司；植物基因組DNA提取試劑盒、TIANamp Soil DNA Kit 107試劑盒：北京天根生化科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 提取基因組DNA及PCR擴增

使用植物基因組DNA提取試劑盒和TIANamp Soil DNA Kit 107試劑盒提取蘋果表皮樣品[16]和根際土壤樣品[17]總DNA，用分光光度法和瓊脂糖凝膠電泳檢測所提基因組DNA的濃度和質(zhì)量。細菌PCR擴增16S rDNA的V3-V4區(qū)，引物為341F：5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′與806R：5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′。真菌PCR擴增內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）區(qū)域，引物為ITS3F：5′-GATGAAGAACGYAGYRAA-3′和ITS4R：5′-TCCTCCGCYYATTGATATGC-3′，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測純化后，送至上海美吉生物科技有限公司測序。

1.3.2 數(shù)據(jù)分析及處理

經(jīng)過濾排除干擾數(shù)據(jù)后獲得的高質(zhì)量數(shù)據(jù)拼接成Tags序列，對齊和去除引物，按照97%的一致性聚類成為操作分類單元（operational taxonomic units，OTUs），將OTUs與美國國家生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）數(shù)據(jù)庫比對并對OTU進行物種注釋[18]，為了得到每個OTU對應(yīng)的物種分類信息，采用RDP classifier貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學(xué)分析，并分別在各分類學(xué)水平：Domain（域）、kingdom（界）、Phylum（門）、Class（綱）、Order（目）、Family（科）、Genus（屬）統(tǒng)計各樣本的群落結(jié)構(gòu)組成。利用QIIME軟件進行Alpha多樣性分析，計算Simpson指數(shù)、Shannon指數(shù)、Ace指數(shù)、Chao 1指數(shù)和覆蓋度等[19]。R3.0軟件進行其他數(shù)據(jù)分析[20-21]。

使用群落柱狀圖表示樣品中優(yōu)勢細菌門、真菌門、細菌屬和真菌屬的群落構(gòu)成及樣品中的平均相對含量，使用genescloud平臺（https：//www.genescloud.cn）繪制關(guān)聯(lián)熱圖，采用熱圖對優(yōu)勢真菌屬和細菌屬間相關(guān)性進行可視化處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘋果表皮微生物及根際土壤微生物序列及多樣性分析

蘋果表皮和根際土壤樣品分別獲得細菌有效序列41345條和30 487條，真菌有效序列72 751條和70 483條（見表1）。經(jīng)質(zhì)控過濾和去除嵌合體，有效序列在97%的相似度水平進行聚類，并進行Alpha多樣性分析，結(jié)果見表1。由表1可知，蘋果表皮和根際土壤樣品分別獲得554個、1 717個細菌OTUs和612個、1 371個真菌OTUs。各樣品文庫的覆蓋度均在99%以上，說明高通量測序數(shù)據(jù)能基本反映各樣品的真實信息。根際土壤樣品Shannon、Ace和Chao 1指數(shù)均高于蘋果果實表皮樣品，且Simpson指數(shù)均低于蘋果果實表皮樣品，表明根際土壤樣品中微生物多樣性和豐富度均高于蘋果果實表皮樣品，此結(jié)果與表2一致。細菌群落的Shannon、Ace和Chao 1指數(shù)高于真菌群落，且Simpson指數(shù)低于真菌群落，表明相同樣品中細菌群落多樣性和豐富度均高于真菌群落，此結(jié)果與表2一致。

表1 蘋果果實表皮及根際土壤樣品微生物群落多樣性分析Table 1 Diversity analysis of microbial community in apple fruit epidermis and rhizoshpere soil samples

表2 樣品不同分類單元數(shù)量統(tǒng)計Table 2 Quantity statistics of different taxon of samples

2.2 蘋果表皮微生物及根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)組成

蘋果表皮及根際土壤細菌群落組成在門分類水平結(jié)果見圖1A。由圖1A可知，蘋果表皮樣品中共鑒定出4個門（相對豐度≥1.00%），依次為放線菌門（Actinobacteriota）（34.57%）、變形菌門（Proteobacteria）（28.07%）、厚壁菌門（Firmicutes）（23.65%）、擬桿菌門（Bacteroidota）（11.63%）。根際土壤樣品中共鑒定出10個門（相對豐度≥1.00%），依次為放線菌門（Actinobacteriota）（38.63%）、變形菌門（Proteobac teria）（23.64%）、酸桿菌門（Acidobacteriota）（10.16%）、綠彎菌門（Chloroflexi）（7.81%）、厚壁菌門（Firmicutes）（4.06%）、擬桿菌門（Bacteroidota）（3.94%）、藍藻門（Cyanobacteria）（3.40%）、Gemmatimonadota（2.55%）、粘球菌門（Myxococcota）（2.31%）和Patescibacteria（1.23%）。

圖1 蘋果表皮及根際土壤微生物在門分類水平上的細菌（A）和真菌（B）群落組成Fig. 1 Bacterial (A) and fungal (B) community composition of apple pericarp and rhizosphere soil microorganisms at phylum levels

蘋果表皮及根際土壤真菌群落組成在門分類水平結(jié)果見圖1B。由圖1B可知，蘋果表皮樣品中共鑒定出2個門（相對豐度≥1.00%），分別為子囊菌門（Ascomycota）（87.40%）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）（12.05%）。根際土壤樣品中共鑒定出5個門類（相對豐度≥1.00%），其中能夠準確分類的門有4個，分別為子囊菌門（Ascomycota）（75.98%）、被孢霉門（Mortierellomycota）（9.66%）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）（8.01%）和壺菌門（Chytridiomycota）（1.01%）。

在屬分類水平上細菌群落組成見圖2A。由圖2A可知，在相對豐度≥2.00%條件下，蘋果表皮共有14個屬，其優(yōu)勢屬為節(jié)桿菌屬（Arthrobacter），其相對豐度為13.06%，其次是金黃桿菌屬（Chryseobacterium）（10.39%）、芽孢桿菌屬（Bacillus）（6.55%）、馬賽菌屬（Massilia）（6.35%）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）（5.67%）、微小桿菌屬（Exiguobacterium）（5.60%）、寒冷桿菌屬（Frigoribacterium）（5.42%）、甲基桿菌屬（Methylobacterium-Methylorubrum）（5.29%）、假單胞菌屬（Pseudomonas）（3.42%）、假節(jié)菌屬（Pseudarthrobacter）（3.41%）、短小桿菌屬（Curtobacterium）（2.92%）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）（2.79%）、泛菌屬（Pantoea）（2.70%）和Erwiniaceae_unclassified（2.22%）。如圖2A所示，在相對豐度≥2.00%條件下，根際土壤樣品共有7個屬，分別為節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）（5.53%）、Vicinamibacterales_norank（2.42%）、分支桿菌屬（Mycobacterium）（2.33%）、慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）（2.28%）、小單孢菌屬（Micromonospora）（2.26%）、類諾卡氏菌屬（Nocardioides）（2.19%）和Vicinamibacteraceae_norank（2.01%），其中節(jié)桿菌屬為優(yōu)勢屬。復(fù)墾土壤中節(jié)桿菌屬和鞘氨醇單胞菌屬是優(yōu)勢菌屬[22]，這與本研究結(jié)果一致。慢生根瘤菌屬具有固氮和促進植物生長的作用[23]。假單孢菌屬普遍分布于植物中，對植物生長、生物防治和養(yǎng)分利用等方面具有有益作用[24-27]。綜上所述，蘋果表皮及根際土壤富含與植物生長和病害防治相關(guān)的微生物。

在屬分類水平上真菌群落組成見圖2B。由圖2B可知，在相對豐度≥2.00%條件下，蘋果表皮真菌共有10個屬，分別為外囊菌屬（Taphrina）（41.07%）、枝孢霉屬（Cladosporium）（8.70%）、錐梗孢屬（Dissoconium）（8.57%）、附球霉屬（Epicoccum）（6.33%）、線黑粉酵母屬（Filobasidium）（6.11%）、維希尼克氏酵母菌屬（Vishniacozyma）（3.69%）、球腔菌屬（Mycosphaerella）（3.75%）、蒜孢屬（Rachicladosporium）（3.03%）、Didymellaceae_unclassified（2.81%）和Ascomycota_unclassified（2.33%），其中外囊菌屬是優(yōu)勢屬。如圖2B所示，在相對豐度≥2.00%條件下，根際土壤樣品中真菌共有15個屬，分別為被孢霉屬（Mortierella）（7.62%）、附球霉屬（Epicoccum）（5.76%）、Onygenales_unclassified（5.59%）、赤霉菌屬（Gibberella）（5.54%）、Fungi_unclassified（5.11%）、Didymellaceae_unclassified（4.35%）、Helotiales_un-classified（3.90%）、Ascomycota_unclassified（3.88%）、外瓶柄霉屬（Exophiala）（3.41%）、Pleosporales_unclassified（2.98%）、Didymosphaeriacesa_unclassified（2.87%）、Sordariomycetes_unclassified（2.60%）、光黑殼屬（Preussia）（2.33%）、土赤殼屬（llyonectria）（2.29%）和枝孢霉屬（Cladosporium）（2.00%），其中被孢霉屬是根際土壤樣品的優(yōu)勢真菌屬。枝狀枝孢菌（Cladosporium cladosporioides）、鏈格孢菌（Alternariaspp.）、鐮孢菌（Fusariumspp.）和青霉菌（Penicilliumspp.）是蘋果果皮和果心中分離頻率較高的真菌[28]，這與本研究結(jié)果一致，同時有研究表明，枝孢霉屬（Cladosporium）在植物中扮演著重要角色[29-30]。結(jié)合前人研究[31-32]，推測被孢霉屬（Mortierella）是蘋果根際土壤中重要的益生菌屬。

2.3 優(yōu)勢菌屬的關(guān)聯(lián)性分析

2.3.1 蘋果表皮和根際土壤樣品中優(yōu)勢細菌屬的關(guān)聯(lián)分析

對蘋果表皮和根際土壤樣品中相對豐度≥2.00%的細菌屬進行關(guān)聯(lián)性分析（不包括未注釋到明確分類地位的細菌屬），結(jié)果見圖3。由圖3可知，蘋果表皮中的寒冷桿菌屬（Frigoribacterium）和鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）與根際土壤樣品中的慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）和小單孢菌屬（Micromonospora）呈顯著性正相關(guān)（P＜0.05），而與節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）、分支桿菌屬（Mycobacterium）和類諾卡氏菌屬（Nocardioides）呈顯著性負相關(guān)（P＜0.05）。與此相反，蘋果表皮中的假單胞菌屬（Pseudomonas）與根際土壤樣品中的節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）、分支桿菌屬（Mycobacterium）和類諾卡氏菌屬（Nocardioides）呈顯著性正相關(guān)（P＜0.05），而與根際土壤樣品中的慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）和小單孢菌屬（Micromonospora）呈顯著性負相關(guān)（P＜0.05）。由此可見，根際土壤優(yōu)勢細菌屬與蘋果表皮優(yōu)勢細菌屬的相對豐度相互影響。

圖3 蘋果表皮和根際土壤樣品中優(yōu)勢細菌屬的關(guān)聯(lián)分析Fig. 3 Correlation analysis of dominant bacterial genera in apple pericarp and rhizosphere soil samples

2.3.2 蘋果表皮和根際土壤樣品中優(yōu)勢真菌屬的關(guān)聯(lián)分析

在相對豐度≥2.00%條件下，對蘋果表皮和根際土壤樣品中的真菌屬進行關(guān)聯(lián)性分析（不包括未注釋到明確分類地位的真菌屬），結(jié)果見圖4。由圖4可知，蘋果表皮中的線黑粉酵母屬（Filobasidium）和維希尼克氏酵母菌屬（Vishniacozyma）分別與根際土壤樣品中的赤霉菌屬（Gib-berella）和枝孢霉屬（Cladosporium）呈顯著性正相關(guān)（P＜0.05），而上述兩個酵母屬與根際土壤中其他優(yōu)勢均屬呈正向或負向相關(guān)，但無差異顯著性（P＞0.05）。蘋果表皮樣品中的錐梗孢屬（Dissoconium）與根際土壤樣品中的被孢霉屬（Mortierella）和土赤殼屬（llyonectria）呈顯著性正相關(guān)（P＜0.05），而與根際土壤樣品中的附球霉屬（Epicoccum）呈顯著性負相關(guān)（P＜0.05）。根際土壤樣品中的枝孢霉屬（Cladosporium）與蘋果表皮樣品中的外囊菌屬（Taphrina）呈顯著性正相關(guān)（P＜0.05），而與蘋果表皮樣品中的附球霉屬（Epicoccum）、枝孢霉屬（Cladosporium）、球腔菌屬（Mycosphaerella）、蒜孢屬（Rachicladosporium）均呈顯著性負相關(guān)（P＜0.05）。由此可見蘋果表皮真菌的分布及豐度與土壤真菌息息相關(guān)，相互影響，具體的互作機理有待進一步研究。

圖4 蘋果表皮和根際土壤樣品中優(yōu)勢真菌屬的關(guān)聯(lián)分析Fig. 4 Correlation analysis of dominant fungi genera in apple pericarp and rhizosphere soil samples

2.3.3 蘋果表皮真菌與細菌間的關(guān)聯(lián)性分析

在相對豐度≥2.00%條件下，對蘋果表皮樣品中的真菌屬和細菌屬進行關(guān)聯(lián)性分析（不包括未注釋到明確分類地位的真菌屬和細菌屬），結(jié)果見圖5。由圖5可知，蘋果表皮真菌屬中的枝孢霉屬（Cladosporium）、附球霉屬（Epicoccum）、球腔菌屬（Mycosphaerella）、蒜孢屬（Rachicladosporium）與蘋果表皮細菌屬中的節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）、芽孢桿菌屬（Bacillus）和葡萄球菌屬（Staphylococcus）均呈顯著性正相關(guān)（P＜0.05），而與蘋果表皮細菌屬中的金黃桿菌屬（Chryseobacterium）、馬賽菌屬（Massilia）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、短小桿菌屬（Curtobacterium）和泛菌屬（Pantoea）均呈顯著性負相關(guān)（P＜0.05）。與此相反，蘋果表皮真菌屬中的維希尼克氏酵母菌屬（Vishniacozyma）和外囊菌屬（Taphrina）與蘋果表皮細菌屬中的節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）、芽孢桿菌屬（Bacillus）和葡萄球菌屬（Staphylococcus）呈顯著性負相關(guān)（P＜0.05），而與蘋果表皮細菌屬中的金黃桿菌屬（Chryseobacterium）、馬賽菌屬（Massilia）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、短小桿菌屬（Curtobac terium）和泛菌屬（Pantoea）呈顯著性正相關(guān)（P＜0.05）。蘋果表皮真菌屬中的錐梗孢屬（Dissoconium）與蘋果表皮細菌屬中的假節(jié)菌屬（Pseudarthrobacter）呈顯著性負相關(guān)（P＜0.05），而與蘋果表皮細菌屬中的寒冷桿菌屬（Frigoribacterium）和鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）呈顯著性負相關(guān)（P＜0.05）。蘋果表皮真菌屬中的線黑粉酵母屬（Filobasidium）與蘋果表皮細菌屬中的微小桿菌屬（Exiguobacterium）呈顯著性負相關(guān)（P＜0.05）。蘋果表皮真菌屬中的線黑粉酵母屬（Filobasidium）的相對豐度受蘋果表皮中的微小桿菌屬（Exiguobacterium）的負向調(diào)控，而蘋果表皮生防細菌屬假單胞菌屬（Pseudomonas）對蘋果表皮維希尼克氏酵母菌屬Vishniacozyma的相對豐度呈正向調(diào)節(jié)，由此可見蘋果表皮真菌與蘋果表皮細菌之間存在共生和互作關(guān)系。

圖5 蘋果表皮樣品中優(yōu)勢真菌屬與細菌屬的關(guān)聯(lián)分析Fig. 5 Correlation analysis of dominant fungi and bacteria in apple pericarp samples

3 結(jié)論

本實驗利用高通量測序技術(shù)對藏東南產(chǎn)區(qū)蘋果果實表皮及其根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)組成進行研究。果實表皮和根際土壤樣品分別獲得554個、1 717個細菌OTUs和612個、1 371個真菌OTUs，且根際土壤樣品中微生物物種多樣性和豐富度均高于蘋果果實表皮樣品，更具有優(yōu)勢。細菌群落結(jié)構(gòu)分析表明，蘋果果實表皮樣品中優(yōu)勢屬為節(jié)桿菌屬（Arthrobacter），其次為金黃桿菌屬（Chryseobacterium）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、寒冷桿菌屬（Frigoribacterium）、假單胞菌屬（Pseudomonas）和鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）等。根際土壤樣品中細菌群落組成主要以節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）、分支桿菌屬（Mycobacterium）、慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）、小單孢菌屬（Micromonospora）等菌屬為優(yōu)勢屬。真菌群落結(jié)構(gòu)分析表明，蘋果表皮中的主要優(yōu)勢屬為外囊菌屬（Taphrina），根際土壤樣品中的主要優(yōu)勢屬為被孢霉屬（Mortierella）通過細菌和真菌關(guān)聯(lián)性分析，發(fā)現(xiàn)蘋果表皮真菌線黑粉酵母屬（Filobasidium）與蘋果表皮細菌微小桿菌屬（Exiguobacterium）呈負相關(guān)，而蘋果表皮生防細菌屬假單胞菌屬（Pseudomonas）與蘋果表酵母屬維希尼克氏酵母菌屬（Vishniacozyma）呈正相關(guān)。蘋果表皮的部分優(yōu)勢菌屬的相對豐度受根際土壤中的部分優(yōu)勢屬正向或負向的影響且影響顯著，同時蘋果表皮真菌與蘋果表皮細菌之間存在共生和互作關(guān)系，具體的共生和互作機理有待進一步研究。