張程超， 蔡伊娜， 彭池方， 王正武

(江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室1，無錫 214122)(江南大學(xué)食品學(xué)院2，無錫 214122)(深圳海關(guān)食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心3，深圳 518045)(上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院4，上海 200240)

微藻油富含二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid，DHA)和二十碳五烯酸(EPA)等ω-3 多不飽和脂肪酸。這些脂肪酸不僅對人體大腦發(fā)育、提高記憶力、預(yù)防心血管疾病以及抗炎等領(lǐng)域有很好的生理作用[1,2]，而且對嬰幼兒視網(wǎng)膜以及認(rèn)知能力的形成非常重要[3]；這推動(dòng)了微藻油產(chǎn)品已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品、保健品、醫(yī)藥和飼料行業(yè)中。由于DHA等ω-3 多不飽和脂肪酸分子中雙鍵數(shù)目較多，在加工、運(yùn)輸和貯藏過程中容易氧化，尤其是因加熱造成的脂肪酸氧化生成氫過氧化物，然后會(huì)進(jìn)一步氧化生成醛、酮、酸等小分子化合物，產(chǎn)生哈喇味，嚴(yán)重影響油脂品質(zhì)[3,4]。采用乳化或微膠囊包埋微藻油是提高其應(yīng)用穩(wěn)定性的重要途徑[5]，目前國內(nèi)外已有大量這方面的研究工作報(bào)道。例如，He等[6]用Surfactin作為表面活性劑制備藻油乳狀液的方法，并進(jìn)行模擬消化實(shí)驗(yàn)研究乳狀液對藻油的保護(hù)效果，為藻油乳狀液在食品中的實(shí)際應(yīng)用打下基礎(chǔ)，但是該乳液體系的高溫穩(wěn)定性尚未評(píng)估。袁博[7]采用復(fù)凝聚法對藻油進(jìn)行包埋，冷凍干燥得到微膠囊產(chǎn)品。通過控制包埋體系的zeta-電位、濁度和微膠囊的形態(tài)優(yōu)化了復(fù)凝聚過程，同時(shí)研究了藻油微膠囊的氧化穩(wěn)定性，但是僅評(píng)價(jià)了最高60 ℃下的熱穩(wěn)定性。

多層納米乳液是由多層(而非單層)界面層包含油滴的納米乳液。多層乳液可完全由食品級(jí)原料(如表面活性劑、蛋白質(zhì)、多糖、磷脂)形成[8]，其加工操作是食品工業(yè)常見的單元操作(如均質(zhì)與混合)。通過控制多層乳液納米層狀結(jié)構(gòu)的組成和性質(zhì)，可顯著提升納米乳滴在環(huán)境壓力下的穩(wěn)定性[9]，如高酸堿、高鹽、加熱、凍融等。目前，采用雙層乳液包埋β-胡蘿卜素[10]、姜黃素[11]、葉黃素[12]、魚油[13]、橙皮苷[14]等物質(zhì)的研究報(bào)道較多，但包埋藻油的研究較少。本研究選用阿拉伯膠和乳清分離蛋白通過層層自組裝實(shí)現(xiàn)了DHA藻油的包埋，并系統(tǒng)評(píng)估了所制備雙層納米乳液的穩(wěn)定性；以期能夠得到在貯藏和加工過程，尤其在高溫下的高穩(wěn)定性藻油產(chǎn)品，為藻油在更多種類食品體系中的應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳清分離蛋白(食品級(jí))；阿拉伯膠(食品級(jí))；DHA藻油；其他實(shí)驗(yàn)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FJ-200高速分散均質(zhì)機(jī)，JHG-54-P100高壓均質(zhì)機(jī)，納米粒度與zeta電位儀，氣相色譜儀Agilent 7820A，流變儀DISCOVERY DHR-3。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 DHA藻油單層納米乳液的制備

制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%～2.5%的WPI溶液，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.02%的苯甲酸鈉作為防腐劑，在25 ℃下以1 000 r/min的轉(zhuǎn)速磁力攪拌30 min，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%的油相，使用高速剪切機(jī)以12 000r/min的轉(zhuǎn)速高速剪切3 min，得到粗乳液，再使用高壓均質(zhì)機(jī)進(jìn)行二次高壓均質(zhì)，一級(jí)50 MPa，二級(jí)5 MPa，循環(huán)3次，形成由乳清分離蛋白包埋的DHA藻油單層納米乳液WPI-e。

1.3.2 DHA藻油雙層納米乳液的制備

制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%～3%的GA溶液形成水相，將GA水相和藻油單層納米乳液的pH調(diào)節(jié)至4.0[15]，兩者按照一定的體積比混合，最后用高壓均質(zhì)機(jī)進(jìn)行2次高壓均質(zhì)，一級(jí)50 MPa，二級(jí)5 MPa，形成內(nèi)層為WPI外層為GA的雙層納米乳液WPI-e /GA。

1.3.3 納米乳液顆粒粒徑、粒徑分布指數(shù)以及Zeta電位的測定

使用納米粒度及ZETA電位儀測定藻油納米乳液的粒徑、粒徑分布指數(shù)及Zeta電位[16]，儀器參數(shù)設(shè)置為：固定角度90°，背散射光角度為173°，相對折射率為1.590，吸收率為0.001，在25 ℃的溫度下測試，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.3.4 DHA藻油中不飽和脂肪酸的測定

油脂中不飽和脂肪酸含量測定參考國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.168—2016[17]。

1.3.5 乳液的穩(wěn)定性測試

1.3.5.1 乳液的熱穩(wěn)定性

分別取10 mL不同的單、雙層藻油乳液加到試管中，然后對其進(jìn)行避光恒溫加熱，溫度分別設(shè)定成40～90 ℃，在加熱1 h之后立即取樣，用水冷待其冷卻完畢，測定乳液的PDI、粒徑和Zeta電位，每個(gè)樣品重復(fù)3次。同時(shí)，在40、60、80、90 ℃處理之后測試每個(gè)樣品經(jīng)過熱處理其DHA的含量。

分別取不同的單、雙層藻油乳液10 mL加入到密封好的耐高溫試管，分別設(shè)置油浴鍋的溫度120、150 ℃對其加熱20 min立即取出冷卻到室溫，測定乳液的PDI、粒徑和Zeta電位同時(shí)測試每個(gè)樣品熱處理之后的DHA含量。每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.3.5.2 乳液的凍融穩(wěn)定性

分別取5 mL乳液加入到10 mL離心管中，并置于-20 ℃的溫度下冷凍0～12 h。冷凍完畢之后將離心管取出在37 ℃恒溫水浴鍋中解凍1 h，測定其PDI、粒徑和Zeta電位。每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.3.5.3 乳液對鹽的耐受性

使用0.1～0.5 mol/L的NaCl溶液分別將藻油乳液稀釋100倍，充氮?dú)庠? ℃冰箱中避光保存1 h之后取樣，立即測定乳液的粒徑、PDI、Zeta-電位。

1.3.5.4 乳液對酸堿的耐受性

取15 mL藻油乳液加入到50 mL離心管中，用1 mol/L的HCl或者1 mol/L的NaOH將乳液pH調(diào)整為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，充氮?dú)庠? ℃下保存1 h后立即取樣，測定其粒徑、PDI和電位。

1.3.4.5 乳液的貯藏穩(wěn)定性

將樣品在常溫下封口保存7周后，每周取1次樣測定其粒徑，PDI和Zeta-電位。

2 結(jié)果與分析

2.1 納米乳液的制備

粒徑，粒徑分布和電位是乳液的重要表征手段，乳滴的粒徑越小，乳液的布朗運(yùn)動(dòng)越弱，從而越穩(wěn)定；乳液的粒徑分布越均勻，其性質(zhì)均一性越好[18]；液滴之間的靜電排斥作用力越大越不容易絮凝成大液滴，乳液的乳滴的Zeta電位絕對值一般大于20 mV時(shí)其穩(wěn)定性較好[19]。

同時(shí)在制備納米乳液的過程中需要控制好乳化劑和油相的含量，才能制備出穩(wěn)定的乳狀液。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)油相質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于1.5%時(shí)，采用WPI蛋白乳化難以得到充分乳化的乳液，因此，本研究乳化體系設(shè)定油相質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%。并且，選用WPI蛋白和阿拉伯膠多糖作為制備雙層納米乳液時(shí)，初步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，WPI蛋白為內(nèi)層多糖為外層可制備得到肉眼可見穩(wěn)定的乳液，而采用多糖為內(nèi)層WPI蛋白為外層乳化油相，難以得到穩(wěn)定的納米乳液。因此，后續(xù)進(jìn)一步對WPI蛋白為內(nèi)層多糖為外層制備DHA藻油乳液時(shí)的條件開展了詳細(xì)分析。

2.1.1 不同WPI濃度對單層納米乳液的影響

由圖1可知，隨著乳清分離蛋白濃度的增加，DHA藻油單層納米乳液的粒徑和PDI隨著WPI的濃度升高而下降并在蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到1.5%后趨于穩(wěn)定，此時(shí)粒徑為262 nm，PDI為0.182，在低蛋白濃度時(shí)，油脂不能被很好的包埋，有一部分油脂破乳之后聚集在一起粒徑增大，而增加乳化劑含量之后乳清分離蛋白顆粒緊密排列在藻油表面，更好地包封住油脂且不發(fā)生絮凝[20]，使粒徑降低。但是從圖1看出由于只用了蛋白作為單層乳化劑，液滴所帶電荷隨著其含量上升略有升高，但數(shù)值仍然較小低于20。Li等[21]用乳清分離蛋白制備百里香精油納米乳液時(shí)，得到了和本實(shí)驗(yàn)相似的結(jié)果。

圖1 WPI濃度對單層乳液粒徑、PDI和Zeta-電位的影響

2.1.2 阿拉伯膠濃度和內(nèi)外層乳化劑比例對雙層乳液的影響

將WPI質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%時(shí)制備的單層乳液進(jìn)一步采用阿拉伯膠乳化，并控制多糖蛋白體積比為7∶3。如圖2所示，隨著GA質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高，乳液的粒徑和PDI均逐漸降低，并在2.5%之后趨于穩(wěn)定。當(dāng)GA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%時(shí)，乳液的粒徑為565 nm，顯著高于單層乳液的粒徑262 nm。這是由于GA為陰離子多糖，當(dāng)其沒有完全包覆油滴外的WPI蛋白分子時(shí)，納米粒子之間會(huì)存在其與WPI分子暴露基團(tuán)之間的靜電相互作用；較低的Zeta電位(-19.5 mV)也可證明這一點(diǎn)。當(dāng)GA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%時(shí)，乳液的粒徑為354 nm，其相對單層乳液粒徑的增加(93 nm)可主要?dú)w因于GA分子在WPI分子外的堆積。此時(shí)Zeta電位也顯著增加(-25 mV)，也暗示GA分子已將包裹油滴的WPI蛋白分子充分包覆[22,23]。

圖2 不同阿拉伯膠濃度對雙層乳液粒徑、PDI和電位的影響

2.2 兩種乳液在不同條件下的穩(wěn)定性比較

食品在企業(yè)生產(chǎn)或者日常使用中常常會(huì)經(jīng)歷一些加工過程，比如高溫、鹽離子的添加、凍融、改變酸堿性等，而由于藻油DHA含有不飽和雙鍵，在這些條件下很容易氧化降解變質(zhì)，因此各種藻油傳輸系統(tǒng)需要抵抗食品加工和貯藏帶來的壓力。為了方便比較，在做乳液穩(wěn)定性評(píng)估時(shí)，兩種乳液體系的pH均為4.0。

2.2.1 兩種納米乳液室溫貯藏穩(wěn)定性

將兩種乳液在常溫下貯藏7周后，測試了其粒徑、Zeta電位的變化、以及DHA保留率，以評(píng)估其理化穩(wěn)定性。如圖3所示。隨著貯藏時(shí)間的延長，在常溫下儲(chǔ)藏7周后，雙層乳液的粒徑和PDI分別從354 nm和0.22緩慢增加至525 nm和0.67，而單層乳液的粒徑大幅增加到1 150 nm，PDI增加到0.98，增幅均顯著高于雙層乳液。雙層乳液的電位較高，并且基本保持不變，有利于納米顆粒的穩(wěn)定，并減少絮凝；而單層納米乳液的電位較低，液滴之間的靜電排斥作用力較小，乳液中的納米粒子之間更容易慢慢靠近聚集形成更大顆粒，并誘導(dǎo)油脂破乳。隨著貯藏時(shí)間的延長，雙層納米乳液的DHA仍保留了81.44%，而單層納米乳液的DHA仍保留率下降至70.62%。這也證實(shí)了雙層乳化劑對藻油的氧化保護(hù)作用明顯高于單層乳化劑[24]。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與Tang等[25]的研究相一致。

圖3 儲(chǔ)藏時(shí)間對不同乳液理化性質(zhì)的影響

2.2.2 乳液的熱穩(wěn)定性

將兩種乳液在40～90 ℃下加熱1 h后，分析其變化。結(jié)果可見，隨著溫度的升高雙層乳液的乳滴粒徑和PDI未發(fā)生明顯變化，而單層納米乳液在70 ℃時(shí)粒徑已經(jīng)達(dá)到了1 286 nm(圖4a)，且隨著溫度上升，其粒徑仍不斷增加。經(jīng)90 ℃熱處理后，雙層乳液中DHA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)相比較未被加熱處理過的樣品分別減少了39.2%和7.7%，在120 ℃和150 ℃加熱20 min之后，兩種乳液的粒徑都因?yàn)楦邷囟黾樱珼HA保留率分別為60.3%、56.4%和85.2%、81.8%(圖4b)。這是因?yàn)闊崽幚硎沟脝螌蛹{米乳液中蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)展開破壞了保護(hù)膜[26]，而雙層納米乳液中GA將WPI蛋白分膜充分包覆，且膜層較厚，因此能夠顯著削弱高溫的影響。

圖4 熱處理對不同乳液理化性質(zhì)的影響

2.2.3 乳液的凍融穩(wěn)定性

由圖5可知，隨著冷凍時(shí)間的延長，兩種乳液的粒徑和PDI均不斷增大。冷凍2 h以后，兩種乳液的粒徑已有顯著增加，分別達(dá)到557.3 nm和524.1 nm；但是單層乳液的粒徑已經(jīng)大于雙層乳液。冷凍12 h之后，單層乳液的粒徑和PDI增加至1 461 nm和1，雙層納米乳液增長至1 116 nm和0.92。這可歸因于單層乳化劑形成的保護(hù)膜易被冷凍時(shí)產(chǎn)生的晶破壞，而由雙層乳化劑形成的保護(hù)膜更厚，因而更能抵抗冰晶的破壞[27]。

圖5 冷凍-解凍后不同乳液粒徑的變化

2.2.4 乳液對酸堿的耐受性

食品加工過程中通常會(huì)加入食品添加劑，這會(huì)改變體系的酸堿性，因此乳液對酸堿的耐受性也是其在食品體系中應(yīng)用的重要考量因素。如圖6所示，在pH 2～8范圍內(nèi)，單層乳液體系的粒徑pH=5時(shí)突然升高，粒徑躍升到1 546 nm，PDI為1；而雙層乳液的粒徑在pH值2.0到8.0范圍，一直保持穩(wěn)定，除了pH=2時(shí)其粒徑躍升為818 nm。出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因主要是pH的變化改變了乳液體系的電位。由圖7b可知，單層乳液的電位在pH為5時(shí)絕對值接近0，此時(shí)接近乳清分離蛋白的等電點(diǎn)[28]。

圖6 pH對不同乳液粒徑和電位的影響

而雙層乳液在酸性條件下的粒徑增大是因?yàn)榇藭r(shí)電位絕對值較低，靜電斥力不夠造成液滴聚集成大顆粒；此結(jié)果與Saman等[29]的研究結(jié)果一致。

2.2.5 鹽濃度對乳液穩(wěn)定性的影響

液態(tài)食品體系中通常會(huì)存在一些鹽離子，可能對納米乳液的狀態(tài)產(chǎn)生影響。本研究選用不同濃度的NaCl添加到兩種納米乳液中，分析了其對乳液物理穩(wěn)定性的影響。如圖7所示，隨著Na+濃度上升，單層乳液的粒徑增尤其明顯并開始出現(xiàn)分層現(xiàn)象，相比之下雙層乳液粒徑隨著金屬離子的濃度從0.1～0.5 mol/L，只增加了100 nm，PDI的變化也呈同樣的趨勢，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因是金屬離子產(chǎn)生的靜電屏蔽效應(yīng)[30]，由圖7b可知兩種乳液的電位絕對值都隨著離子濃度的上升而降低，帶正電的Na+會(huì)中和液滴表面帶的負(fù)電。而雙層乳液較厚的界面膜對靜電屏蔽作用的抵抗力會(huì)提高，所以雙層乳液能產(chǎn)生比單層乳液更好的鹽離子耐受性。

圖7 NaCl濃度對不同乳液粒徑和電位的影響

3 結(jié)論

本研究基于層層自組裝和高壓均質(zhì)制備了一種藻油雙層納米乳液。其制備的最佳工藝參數(shù)為：高壓均質(zhì)壓力50 MPa，均質(zhì)次數(shù)3次，內(nèi)層用乳清分離蛋白作為乳化劑，最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%，外層為阿拉伯膠最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%，藻油質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%，此時(shí)的藻油納米乳液粒徑為354 nm，PDI為0.22，Zeta-電位為-25 mV。該納米乳液對熱、凍融、鹽和酸堿均顯示出具有較高的耐受性，且長期貯藏穩(wěn)定較好。本研究可為DHA藻油高穩(wěn)定性產(chǎn)品的開發(fā)及其在食品加工中的應(yīng)用提供技術(shù)參考。