劉元媛，王 歡，周 平，劉海林

(1.重慶兩江新區(qū)第一人民醫(yī)院藥劑科，重慶 401147； 2.重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，重慶 400010)

胃癌的發(fā)生率在惡性腫瘤中居第4位[1]。胃癌的發(fā)生和發(fā)展是遺傳、壞境和表觀遺傳等多種因素作用的過程，與抑癌基因的失活、原癌基因的激活以及多種分子水平和基因水平的變化密切相關(guān)[2-3]。對于胃癌的治療通常以手術(shù)和輔助放化療為主，但對于晚期侵襲和轉(zhuǎn)移的患者治療效果不佳。人參皂苷Rh2和Rg3是人參抗腫瘤的主要活性成分[4]。相關(guān)研究結(jié)果表明，人參皂苷Rh2和Rg3可以誘導(dǎo)細(xì)胞分化，阻滯細(xì)胞周期，抑制轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)凋亡，調(diào)節(jié)免疫功能等[5]。程序性死亡蛋白配體1(PD-L1)為腫瘤免疫逃逸機(jī)制的核心調(diào)控分子，在適應(yīng)性免疫抵抗中發(fā)揮著重要作用[6]。慢性感染引發(fā)T細(xì)胞持續(xù)性活化可促使PD-L1大量表達(dá)，影響T細(xì)胞的增殖能力和殺傷活性，導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞耗竭[7]。因此，本研究選取人參皂苷Rh2和Rg3為研究對象，初步探討其對胃癌細(xì)胞系MGC-803增殖和侵襲的影響，并探討可能的發(fā)生機(jī)制。

1 材料

1.1 實驗細(xì)胞

胃癌細(xì)胞系MGC-803(中國科學(xué)院上海細(xì)胞典藏庫)。

1.2 儀器

CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo Scientific公司)；高速冷凍離心機(jī)(德國 Eppendorff 公司)；蛋白質(zhì)印跡電泳儀、電泳槽(美國Bio-Rad公司)；-80 ℃低溫冰箱(美國Thertno Scientific公司)；Transwell小室(美國Corning公司)。

1.3 藥品與試劑

人參皂苷Rh2和人參皂苷Rg3(吉林大學(xué)有機(jī)化學(xué)教研室，質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98%，批號：201808-1)；PD-L1載體質(zhì)粒(美國Merck Millipore公司，批號：NAF1321)；RMPIA 1640培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Gibco公司，批號：J17008、181221)；蛋白裂解液RIPA(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：9224)；胎牛血清(吉瑪基因公司，批號：A115121)；Trizol試劑(上海生工生物工程有限公司，批號：180519)；顯色液、BCA試劑(美國TaKaRa公司，批號：190215、190127)；RNA提取試劑盒(廣州拓科達(dá)生物科技有限公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(廣州威佳科技有限公司，貨號：556129)；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒(美國Invirogen公司)；Annexin V-FTIC/PI試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。

2 方法

2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)及分組處理

于450 mL的RMPIA 1640培養(yǎng)基中加入濃度為10%的胎牛血清50 mL、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素5 mL，把胃癌細(xì)胞MGC-803加入培養(yǎng)基中，在5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度保持在37 ℃。處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化處理，以3 000 r/min離心(離心半徑10 cm)5 min，然后去上清液，培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后置于培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，24 h以后更換液體。

將胃癌細(xì)胞MGC-803分為對照組、Rh2+Rg3組和Rh2+Rg3+PD-L1組。未經(jīng)過人參皂苷Rh2和Rg3處理的MGC-803細(xì)胞設(shè)為對照組。確定藥物對細(xì)胞的半抑制濃度(IC50)，Rh2+Rg3組給予40 μg/mL混合有Rh2和Rg3的培養(yǎng)基，培養(yǎng)細(xì)胞24 h。將轉(zhuǎn)染PD-L1載體質(zhì)粒以3×103的密度經(jīng)過質(zhì)量濃度為40 μg/mL的人參皂苷Rh2和Rg3處理的MGC-803細(xì)胞設(shè)為Rh2+Rg3+PD-L1組，具體轉(zhuǎn)染操作參照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒的操作說明書。

2.2 細(xì)胞計數(shù)試劑盒8(CCK-8)法檢測胃癌細(xì)胞MGC-803的增殖情況

采用CCK-8法檢測胃癌細(xì)胞MGC-803的增殖情況，觀察Rh2+Rg3和PD-L1對胃癌細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)作用。加入40 μg/mL的人參皂苷Rh2和Rg3或者PD-L1載體質(zhì)粒以3×103的密度轉(zhuǎn)染細(xì)胞，接種在96孔板上，并在37 ℃和5%CO2中孵育。每隔24 h，向每個孔中加入CCK-8溶液，至第5日結(jié)束，并使用酶標(biāo)儀測定450 nm波長下的細(xì)胞數(shù)。最終，生成5 d的細(xì)胞生長曲線。

2.3 定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測胃癌細(xì)胞MGC-803中PD-L1 mRNA表達(dá)

各組的胃癌細(xì)胞MGC-803轉(zhuǎn)染 48 h后，進(jìn)行收集，采用Trizol法從細(xì)胞中提取總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒從上述RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA，最后利用由武漢巴菲爾公司合成PD-L1引物和GAPDH引物在應(yīng)用生物系統(tǒng)7500實時PCR系統(tǒng)上進(jìn)行PCR實驗，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性4 min，90 ℃變性20 s，45 ℃退火20 s，60 ℃延伸20 s，共設(shè)置45個循環(huán)。PD-L1引物序列：5′-ACCGGTTTACTGTCGCAT-3′(正向)和3′-CCTCTGCTCTGT GGGC-5′(反向)；GAPDH引物序列：5′-GATGAACTCCCA CAGTGC-3′(正向)和5′-TCTGAGAGGC AGGGATG-3′(反向)，按照試劑盒的使用說明書進(jìn)行嚴(yán)格操作，采用ABI 7500實時PCR進(jìn)行測量，采用2-ΔΔCt法計算PD-L1的相對表達(dá)量，以GAPDH為內(nèi)參。

2.4 蛋白質(zhì)印跡法檢測胃癌細(xì)胞MGC-803中PD-L1蛋白表達(dá)

各組的胃癌細(xì)胞MGC-803轉(zhuǎn)染 48 h后，進(jìn)行收集，通過加入RIPA裂解緩沖液進(jìn)行裂解，用10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。轉(zhuǎn)膜完全后拿出PVDF膜，5%脫脂奶粉中封閉1 h，PD-L1(1∶500稀釋)一抗孵育，4 ℃冰箱中放置一夜，HRP二抗(1∶5 000稀釋)避光孵育1 h，TBST洗3次，滴加ECL發(fā)光液，凝膠成像儀拍照顯影。

2.5 Annexin-V檢測胃癌細(xì)胞MGC-803的凋亡情況

將各組的胃癌細(xì)胞MGC-803接種于6孔板中72 h后，進(jìn)行細(xì)胞收集，洗涂、固定和透化，按照Annexin V-FTIC/PI試劑盒說明書的操作步驟進(jìn)行細(xì)胞染色，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測，用FlowJo軟件處理數(shù)據(jù)。

2.6 克隆形成實驗

將各組的胃癌細(xì)胞MGC-803接種于瓊脂覆蓋的培養(yǎng)基的96孔板上，細(xì)胞在37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，12 d后，使用Leica CTR MIC顯微鏡捕獲每個孔中胃癌細(xì)胞的克隆圖像，并使用Image J 1.49軟件量化克隆數(shù)量。

2.7 Transwell檢測胃癌細(xì)胞MGC-803的遷移情況

將Transwell小室取出，棄液體，PBS漂洗5 min，再用4%多聚甲醛固定15 min，在胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，將100 μL細(xì)胞(1×105/mL)接種至24孔板中，然后放入含有20% FBS的RPMI-1640 600 μL，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細(xì)胞或未侵襲的細(xì)胞，遷移的細(xì)胞或入侵細(xì)胞用70%甲醛溶液固定30 min，并使用0.1%的結(jié)晶紫染色20 min，使用顯微鏡捕獲每個孔中遷移的細(xì)胞的圖像。

2.8 Transwell檢測胃癌細(xì)胞MGC-803的侵襲情況

Matrigel膠稀釋，取50 μL加入Transwell上室內(nèi)，37 ℃培養(yǎng)箱中過夜，將Matrigel膠吸出，PBS沖洗，將各組的胃癌細(xì)胞MGC-803以1×104/mL接種于上室，孵育24 h，加入無血清培養(yǎng)液，下室加入含20%FBS培養(yǎng)液，孵育48 h，去除Transwell小室內(nèi)的培養(yǎng)液，PBS沖洗，4%多聚甲醛固定，1%結(jié)晶紫染色侵襲的細(xì)胞，室溫下放置20 min后，PBS沖洗，選取5個視野，倒置顯微鏡下觀察，比較侵襲的細(xì)胞數(shù)目。

2.9 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 各組胃癌細(xì)胞MGC-803增殖能力情況

第1日，三組胃癌細(xì)胞MGC-803的增殖能力無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；第2—3日，Rh2+Rg3組的細(xì)胞增殖能力明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；第4—5日，Rh2+Rg3組的細(xì)胞增殖能力明顯低于對照組，Rh2+Rg3+PD-L1的細(xì)胞增殖能力明顯高于Rh2+Rg3組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

3.2 各組胃癌細(xì)胞MGC-803中PD-L1的表達(dá)情況

Rh2+Rg3組胃癌細(xì)胞MGC-803中PD-L1 mRNA和蛋白的表達(dá)明顯低于對照組，Rh2+Rg3+PD-L1組的PD-L1 mRNA和蛋白的表達(dá)明顯高于Rh2+Rg3組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1、圖2。

表1 人參皂苷Rh2+Rg3對胃癌細(xì)胞MGC-803中PD-L1表達(dá)的影響Tab 1 Effect of ginsenoside Rh2+Rg3 on the expression of PD-L1 in gastric cancer cell

與對照組相比，*P<0.05vs. the control group, *P<0.05圖1 人參皂苷Rh2+Rg3通過抑制PD-L1對胃癌細(xì)胞MGC-803增殖能力的影響(n=9)Fig 1 Effect of ginsenoside Rh2+Rg3 on the proliferation capacity of gastric cancer cell MGC-803 by inhibiting PD-L1 (n=9)

A.PD-L1 mRNA；B.PD-L1蛋白；與對照組相比，*P<0.05；與Rh2+Rg3組相比，#P<0.05A.PD-L1 mRNA；B.PD-L1 protein；vs. the control group, *P<0.05; vs. the Rh2+Rg3 group, #P<0.05圖2 人參皂苷Rh2+Rg3對胃癌細(xì)胞MGC-803中PD-L1表達(dá)的影響Fig 2 Effect of ginsenoside Rh2+Rg3 on the expression of PD-L1 in gastric cancer cell MGC-803

3.3 各組胃癌細(xì)胞MGC-803的凋亡情況

Rh2+Rg3組胃癌細(xì)胞MGC-803的凋亡率明顯高于對照組，Rh2+Rg3+PD-L1組的細(xì)胞凋亡率明顯低于Rh2+Rg3組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2、圖3。

表2 人參皂苷Rh2+Rg3通過抑制PD-L1對胃癌細(xì)胞MGC-803凋亡的影響Tab 2 Effects of ginsenoside Rh2+Rg3 on the apoptosis of gastric cancer cell MGC-803 by inhibiting PD-L1

A.對照組；B.Rh2+Rg3組；C.Rh2+Rg3+PD-L1組A. control group; B. Rh2+Rg3 group; C. Rh2+Rg3+PD-L1 group圖3 人參皂苷Rh2+Rg3通過抑制PD-L1對胃癌細(xì)胞MGC-803凋亡的影響Fig 3 Effect of ginsenoside Rh2+Rg3 on the apoptosis of gastric cancer cell MGC-803 by inhibiting PD-L1

3.4 各組胃癌細(xì)胞MGC-803克隆形成情況

Rh2+Rg3組胃癌細(xì)胞MGC-803克隆數(shù)量明顯低于對照組，Rh2+Rg3+PD-L1組的細(xì)胞克隆數(shù)量明顯高于Rh2+Rg3組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3、圖4。

表3 人參皂苷Rh2+Rg3通過抑制PD-L1對胃癌細(xì)胞MGC-803克隆形成的影響Tab 3 Effect of ginsenoside Rh2+Rg3 on clone formation of gastric cancer cell MGC-803 by inhibiting PD-L1

A.對照組；B.Rh2+Rg3組；C.Rh2+Rg3+PD-L1組A. control group; B. Rh2+Rg3 group; C. Rh2+Rg3+PD-L1 group圖4 人參皂苷Rh2+Rg3通過抑制PD-L1對胃癌細(xì)胞MGC-803克隆形成的影響Fig 4 Effects of ginsenoside Rh2+Rg3 on clone formation of gastric cancer cell MGC-803 by inhibiting PD-L1

3.5 各組胃癌細(xì)胞MGC-803的遷移和侵襲情況

Rh2+Rg3組胃癌細(xì)胞MGC-803的遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)明顯低于對照組，Rh2+Rg3+ PD-L1組的遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)明顯高于Rh2+Rg3組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表4、圖5。

圖5 人參皂苷Rh2+Rg3通過抑制PD-L1對胃癌細(xì)胞MGC-803遷移和侵襲的影響Fig 5 Effects of ginsenoside Rh2+Rg3 on the migration and invasion of gastric cancer cell MGC-803 by inhibiting PD-L1

表4 人參皂苷Rh2+Rg3通過抑制PD-L1對胃癌細(xì)胞MGC-803遷移和侵襲的影響Tab 4 Effects of ginsenoside Rh2+Rg3 on the migration and invasion of gastric cancer cell MGC-803 by inhibiting

4 討論

人參皂苷Rh2和Rg3是人參抗腫瘤的活性成分。相關(guān)研究結(jié)果表明，人參皂苷Rh2和Rg3可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞分化和腫瘤細(xì)胞的凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥，抑制腫瘤血管的形成[8]。人參皂苷Rh2和Rg3已被闡明在腫瘤的發(fā)生中發(fā)揮著主要作用[9]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rh2和Rg3抑制了胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)了胃癌細(xì)胞凋亡，而大量PD-L1的加入則減弱了上述作用，表明人參皂苷Rh2和Rg3在胃癌中起抑癌作用，而PD-L1為腫瘤啟動因子。人參皂苷Rh2、Rg3和PD-L1相互作用的研究，為了解人參皂苷Rh2、Rg3和PD-L1在胃癌中的作用機(jī)制提供了新的視角。

人參皂苷Rg3屬于二醇皂苷，是人參中稀有的皂苷，具有抗炎、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫能力和抑制血管生成等作用[10]。其與人參皂苷Rh2共同作用，可增強(qiáng)藥效。根據(jù)本研究結(jié)果，人參皂苷Rh2和Rg3可能是胃癌患者治療藥物的潛在候選。PD-L1在維持正常機(jī)體保護(hù)性免疫和免疫耐受的平衡中起著至關(guān)重要的作用，PD-L1的表達(dá)上調(diào)是通過細(xì)胞內(nèi)多種信號傳導(dǎo)途徑進(jìn)行調(diào)節(jié)的，在腫瘤微環(huán)境免疫效應(yīng)發(fā)揮著調(diào)控作用。在腫瘤微環(huán)境中，PD-L1表達(dá)上調(diào)，從而激活程序性死亡蛋白-1(PD-1)/PD-L1通路，介導(dǎo)腫瘤的免疫逃逸。PD-1/PD-L1是免疫抑制效應(yīng)的調(diào)控因子，在胃癌方面已得到應(yīng)用[11]。本研究以人參皂苷Rh2和Rg3為研究對象，發(fā)現(xiàn)其能夠抑制胃癌MGC-803細(xì)胞中PD-L1 mRNA和蛋白的表達(dá)。本研究通過PD-L1載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人參皂苷Rh2和Rg3處理的胃癌MGC-803細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)PD-L1能夠促進(jìn)胃癌MGC-803細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)克隆形成，抑制MGC-803細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果說明PD-L1是腫瘤的啟動因子，進(jìn)一步證實了PD-L1對腫瘤具有促進(jìn)作用。有研究結(jié)果表明，PD-L1抗體可以抑制免疫細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞之間的相互作用，從而維護(hù)免疫細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性[12-13]。本研究中，人參皂苷Rh2和Rg3能夠明顯降低胃癌MGC-803細(xì)胞中PD-L1 mRNA和蛋白的表達(dá)，即人參皂苷Rh2和Rg3能夠顯著抑制腫瘤的啟動因子，阻止腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。相關(guān)研究結(jié)果表明，人參皂苷Rh2和Rg3能對喉鱗癌、胃癌和肝癌等多種腫瘤細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤作用[14-15]。雖然目前化療仍是主要手段，但化療對正常細(xì)胞也會造成一定的影響。而人參皂苷Rh2和Rg3屬于天然藥物，不僅具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，還能夠起到抗腫瘤信號通路的作用[16-17]。有研究結(jié)果認(rèn)為，PD-L1與胃癌的發(fā)生有關(guān)，可能是胃癌患者臨床診斷、免疫治療和預(yù)后的有效靶點[18]。特別值得一提的是，PD-L1單克隆抗體的臨床試驗已經(jīng)順利進(jìn)行，并表現(xiàn)出良好的抗腫瘤活性[19-20]。本研究還證實了PD-L1的腫瘤促進(jìn)作用。

綜上所述，人參皂苷Rh2和Rg3通過調(diào)節(jié)PD-L1的表達(dá)，抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。提示PD-L1可能是胃癌患者診斷、治療和預(yù)后的潛在靶點。