謝丹丹 耿楠 李晶磊 趙思雨 李拓 趙峻嘹 付國兵 沈潛

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome, PCOS)是一種以高雄激素血癥、無排卵或排卵、肥胖、痤瘡、多毛等為典型臨床特征的婦科內(nèi)分泌疾病。PCOS多發(fā)于生育期女性，是導(dǎo)致育齡期婦女不孕的最常見原因之一。據(jù)相關(guān)臨床報道，本病發(fā)病率為6%～15%[1]，且患者產(chǎn)科疾病、心血管疾病、心理疾病以及遠(yuǎn)期并發(fā)癥的風(fēng)險增加，嚴(yán)重危害女性健康和生活質(zhì)量[2-3]。研究表明，慢性低度炎癥反應(yīng)是PCOS發(fā)生發(fā)展的重要原因[4]。目前中醫(yī)治療PCOS療效確切，其中推拿療法是我國中醫(yī)傳統(tǒng)特色外治手法[5]，已有臨床研究[6, 7]證實中醫(yī)腹部推拿能明顯改善PCOS患者的癥狀及炎癥反應(yīng)。振腹法是作用于腹部神闕穴的一種特色手法，基于以上前提，本文旨在探討振腹法對PCOS大鼠體質(zhì)量、性激素水平以及相關(guān)炎癥因子水平的影響，從而為臨床研究提供科學(xué)證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級SD大鼠24只，雌性，6周齡，體質(zhì)量(180±20) g，24只購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證編號：SCXK(京)20166-0006，按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、模型組、二甲雙胍組、振腹組，每組6只。屏障環(huán)境下室內(nèi)溫度(23±1)℃，濕度(45±5)%，日光燈光照，普通清潔級鼠飼料飼養(yǎng)，自由飲水。

1.2 實驗藥物

來曲唑：0.25 mg/片×10片/盒，生產(chǎn)批號：200308KB，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司。二甲雙胍：0.5 g/片×20片/盒，生產(chǎn)批號：A890259，中美上海施寶貴制藥有限公司。1%羧甲基纖維素鈉溶液(Coolaber，批號：C9230)。堿性美藍(lán)染液(泰科美生物科技有限公司)。

1.3 主要試劑及儀器

促黃體生成素測定試劑盒(武漢云克隆科技股份有限公司，CEA441Ra)、促卵泡激素測定試劑盒(武漢云克隆科技股份有限公司，CEA830Ra)、血清雄激素測定試劑盒(武漢云克隆科技股份有限公司，CEA458Ge)、血清雌激素測定試劑盒(武漢云克隆科技股份有限公司，CEA461Ge)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)測定試劑盒(武漢云克隆科技股份有限公司，KSA133Ra01)、白介素-6(interleukin-6, IL-6)檢測試劑盒(武漢云克隆科技股份有限公司，SEA079Ra)；電子天平、移液槍、離心機(jī)(恒諾儀器 AXTGL16M)、切片機(jī)(Leica RM2235)、石蠟包埋機(jī)(Leica G1150H)、I-Sanger生信云平臺(hTTps://www.i-sanger.com/)、酶標(biāo)儀(Thermo, MULTISKAN MK3)。

1.4 PCOS大鼠模型的建立

選擇芳香花酶抑制劑造模法[8]，來曲唑8 mL/(kg·d), 0.125 mg/mL溶于1%羧甲基纖維素鈉中，模型組及振腹組大鼠連續(xù)灌服21天；空白組灌服等濃度等體積羧甲基纖維素溶液21天。

模型建立成功的評定標(biāo)準(zhǔn)[8]：(1)陰道涂片觀察大鼠動情周期的改變。從造模第7天起直至造模第21天(3個動情周期)，每日上午8:00～9:00，用生理鹽水浸潤的小棉簽在大鼠陰道內(nèi)順時針旋轉(zhuǎn)1圈后抽出，將大鼠陰道分泌物逆時針旋轉(zhuǎn)均勻涂抹于載玻片上，95%酒精脫水、固定后，用美蘭染色5分鐘,顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。造模成功評價：涂片中細(xì)胞持續(xù)1周以白細(xì)胞為主，未見陰道角化細(xì)胞，提示大鼠動情周期失常，且處于動情間期、無排卵。(2)血清睪酮檢測，造模第21天晚7點(diǎn)禁食12小時，次日早上每組大鼠各隨機(jī)取1只大鼠眼眶后靜脈叢采血，分離血清用于ELISA法檢測血清睪酮水平。造模成功評價：模型組、二甲雙胍組、振腹組大鼠血清睪酮較空白組均顯著升高(P<0.05)。符合以上2項，可確定造模成功。造模過程中無大鼠死亡。

1.5 干預(yù)方法

1.5.1 二甲雙胍組 予二甲雙胍溶于4 mL/(kg·d)的1%羧甲基纖維素鈉溶液灌服：根據(jù)第九版教材《婦產(chǎn)科學(xué)》，二甲雙胍治療PCOS常用劑量為每次口服500 mg，每日3次[9]；按照《醫(yī)學(xué)實驗動物學(xué)》中人與動物藥物劑量換算方法[10]，換算后大鼠給藥劑量為43 mg/(kg·d)，第22天起給藥，連續(xù)給藥15天。

1.5.2 振腹組 操作者手法干預(yù)之前進(jìn)行振腹手法操作規(guī)范化培訓(xùn)，且所有大鼠干預(yù)均由同一名操作者完成，手法干預(yù)完一只大鼠，休息5分鐘后再進(jìn)行下一只大鼠手法干預(yù)。具體干預(yù)操作如下：

操作者左手固定大鼠，使大鼠腹部朝上，參照《實驗針灸學(xué)》[11]選取神闕穴。根據(jù)類比法，人手中指指腹面積與大鼠前爪面積近似相等，故選取右手中指置于大鼠神闕穴，進(jìn)行振腹法操作，每只大鼠每次操作15分鐘，第22天起開始干預(yù)，連續(xù)干預(yù)15天。手法干預(yù)過程中，大鼠未出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)。實驗過程中對動物的處理均符合北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院動物倫理委員會要求。

1.6 取材與檢測指標(biāo)

1.6.1 樣本采集 大鼠于第35天最后一次干預(yù)后禁食12小時，腹腔注射2%戊巴比妥鈉50 mg/kg，大鼠昏迷后，腹主動脈取血4 mL，靜置30分鐘，放入多孔離心機(jī)中，3 000 r/min，4℃離心15分鐘，取上清液注入一次性EP管內(nèi)密封，-80℃冰箱保存；取出雙側(cè)卵巢，眼科剪去除卵巢表面脂肪組織、包膜及輸卵管，生理鹽水沖洗后紗布吸拭表面水分，分別將雙側(cè)卵巢用4%多聚甲醛固定或-80℃冰箱保存。

1.6.2 卵巢形態(tài)學(xué)觀察 選取大鼠左側(cè)卵巢，4%多聚甲醛固定24小時，經(jīng)脫水后制作石蠟包埋切片，蘇木精—伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色，光鏡下觀察卵巢組織學(xué)特點(diǎn)。

1.6.3 血清性激素及炎癥因子水平檢測 取各組大鼠血清，按照ELISA試劑盒說明書檢測血清性激素及炎癥因子水平。采用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測定各孔的A值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算血清中促黃體生成素(luteinizing hormone,LH)、卵泡刺激素(follicle stimulating hormone,FSH)、雌二醇(estrogen,E2)、睪酮(testosterone,T)、TNF-α、IL-6的含量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠卵巢組織形態(tài)學(xué)變化

與空白組比較，模型組大鼠卵巢形態(tài)HE染色切片呈顯著性改變，出現(xiàn)較多的囊性卵泡，且顆粒細(xì)胞減少，二甲雙胍組及振腹組大鼠卵巢形態(tài)與模型組相比，囊性卵泡減少。見圖1。

注: A空白組；B模型組；C 二甲雙胍組；D振腹組

2.2 大鼠血清性激素水平

與空白組相比，模型組、二甲雙胍組的LH、FSH、T水平均顯著升高(P<0.05)，E2水平降低(P<0.05)；振腹組T水平升高，E2水平降低(均P<0.05)。與模型組對比，二甲雙胍組、振腹組LH、FSH、T水平均降低(P<0.05)，E2水平升高(P<0.05)。與二甲雙胍組比較，振腹組LH、T水平降低(P<0.05)，E2水平升高(P<0.05)，F(xiàn)SH水平低于二甲雙胍組，差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組PCOS大鼠血清性激素水平比較

2.3 大鼠血清炎癥因子水平

與空白組相比，模型組大鼠TNF-α、IL-6水平顯著升高(P<0.05)；二甲雙胍組IL-6水平升高(P<0.05)。與模型組比較，二甲雙胍組與振腹組大鼠TNF-α、IL-6水平均顯著降低(P<0.05)。與二甲雙胍組比較，振腹組TNF-α水平降低、IL-6水平升高，但無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，如表2。

表2 各組PCOS大鼠血清炎癥因子水平比較

3 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為多囊卵巢綜合征屬于“不孕”“經(jīng)遲”“閉經(jīng)”“月經(jīng)過少”等范疇[5]，本病的病機(jī)為腎虛、脾虛、肝郁、沖任損傷、天癸失序、痰瘀胞宮等，與腎、脾、肝三臟有關(guān)。腎虛為本，腎精不足，則會影響對肝脾的滋養(yǎng)；沖任損傷、天癸失序，血海不能充盈，則出現(xiàn)女性月經(jīng)延期，嚴(yán)重者陰血匱乏，陰陽失調(diào)，繼而出現(xiàn)閉經(jīng)、不孕。腎虛易致血瘀，一者氣虛推動無力而致瘀，或氣虛統(tǒng)攝無力致血不歸經(jīng)；再者元陽不足，溫煦無力則血脈寒澀難行，如冬日寒至則水凝，血為陰類，賴陽以動，無陽則冰結(jié)而為瘀。痰瘀互結(jié)于胞宮，阻礙氣血運(yùn)行，則致不孕、月經(jīng)后期或閉經(jīng)、卵巢多囊樣改變；痰瘀泛溢于肌膚，可見形體肥胖、多毛、痤瘡等。

腹部與臟腑氣血有著密切聯(lián)系?！鹅`樞·脹論》載：“臟腑之在胸脅腹里之內(nèi)也……夫胸腹，臟腑之郭也。”清代醫(yī)家張振鋆的《厘正按摩要術(shù)》也稱：“胸腹者，五臟六腑之宮域，陰陽氣血之發(fā)源?！币虼?，腹部為元?dú)鈿w藏之所。胃氣為后天動力，先天之根本元?dú)獾煤筇焖瘸漯B(yǎng)以源源不絕，故人以胃氣為本。臟腑功能正常與否，人體的發(fā)病、預(yù)后轉(zhuǎn)歸均與元?dú)?、胃氣的盛衰息息相關(guān)。朱震亨《丹溪心法》中記載：“有諸內(nèi)者，必形諸外?！迸K腑功能出現(xiàn)異常時，其陰陽氣血虛實可通過胸腹部表現(xiàn)出來。腹部是醫(yī)者，尤其是推拿醫(yī)者觸及探知患者體內(nèi)臟腑陰陽氣血情況的重要部位，同時通過腹部按摩，影響胃氣、元?dú)馄鸬秸{(diào)整臟腑之陰陽氣血虛實的功用。

振腹法是由全國第五批名老中醫(yī)臧?？平淌趧?chuàng)立及其弟子付國兵教授等三代人發(fā)展而來，對治療內(nèi)、婦、兒科等多種疾病都有一定療效[12-14]，其操作主要以醫(yī)者手掌掌心勞宮穴正對患者腹部神闕穴，中指對應(yīng)患者任脈，食指和無名指對應(yīng)患者腎經(jīng)，拇指和小指置于胃經(jīng)，腕關(guān)節(jié)帶動手掌指間關(guān)節(jié)在腹部進(jìn)行頻率為300～400次/分鐘的振動[15]。振腹法操作腧穴主要為神闕穴，神闕穴位于臍中，是胎兒時期與母體相連的性命紐帶、神氣通行之門戶。走行于腹部的三陰經(jīng)：足太陰脾經(jīng)、足厥陰肝經(jīng)、足少陰腎經(jīng)，通過任脈、沖脈、帶脈與督脈將臍與陰陽諸經(jīng)絡(luò)密切相聯(lián)系，故神闕穴為先后天神氣交匯出入之所，與人體氣血陰陽、臟腑功能盛衰虛實密切相關(guān)[16]。因此，振腹法通過神闕穴影響人體諸經(jīng)脈，激發(fā)腎中之精氣，溫暖臟腑以驅(qū)散內(nèi)寒，培元?dú)庖詼匕麑m、促天癸，調(diào)脾胃理中氣以生氣血，疏肝氣以理氣機(jī)，調(diào)理沖任，活血化瘀，從而達(dá)到治療作用。

研究表明，慢性炎癥參與了PCOS的發(fā)生發(fā)展過程[4]，PCOS患者無論有無肥胖，炎癥因子都存在不同程度的升高，其中以TNF-α、IL-6升高等為主[17]，這些炎癥因子與人體性激素水平含量密切相關(guān)。TNF-α可以刺激卵泡膜細(xì)胞增生，在調(diào)節(jié)卵泡期和黃體期卵巢的正?；顒臃矫姘l(fā)揮重要作用[18]，且TNF-α參與PCOS患者的雄激素的代謝過程，與PCOS患者高雄激素血癥有關(guān)[19]。IL-6作為重要的促炎因子及免疫調(diào)節(jié)因子，在卵巢成熟和著床過程中起著重要作用[20-21]，且PCOS患者IL-6基因-174位點(diǎn)的G/C多態(tài)性與PCOS患病風(fēng)險密切相關(guān)[22]。

本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，對PCOS大鼠進(jìn)行振腹法干預(yù)后，大鼠卵巢形態(tài)結(jié)構(gòu)改善明顯，性激素LH、FSH、E2、T水平具有統(tǒng)計學(xué)差異，與二甲雙胍組同樣存在統(tǒng)計學(xué)差異，表明振腹法在改善PCOS大鼠性激素水平及卵泡生長發(fā)育情況方面具有一定療效，且療效較二甲雙胍顯著。此外，研究表明二甲雙胍對多種炎癥標(biāo)志物產(chǎn)生影響，以TNF-α、IL-6為顯著[23]。本研究中振腹法干預(yù)可顯著降低PCOS大鼠炎癥因子TNF-α、IL-6水平，與二甲雙胍組比較無統(tǒng)計學(xué)差異，表明振腹法可調(diào)節(jié)PCOS大鼠炎癥反應(yīng)且與二甲雙胍具有相同的療效。

因此，本研究結(jié)果提示改善慢性炎性狀態(tài)可能是振腹法治療PCOS的作用機(jī)制，為臨床振腹法治療PCOS提供了一定的科學(xué)依據(jù)。但本研究仍存在一些不足，本研究樣本量較少，研究結(jié)果可能存在統(tǒng)計學(xué)偏倚。此外本研究干預(yù)周期較短，振腹組與模型組大鼠比較炎性因子水平有顯著統(tǒng)計學(xué)差異，但與二甲雙胍組比較無明顯統(tǒng)計學(xué)差異，后期研究將加大樣本量并延長干預(yù)周期，進(jìn)一步探討振腹法改善炎癥反應(yīng)的作用機(jī)制。