楊子燁，張桂梅，王佩華，王慧楠，姜明瑞，張婧秋，岳珠珠，王志成，王英姿

北京中醫(yī)藥大學 中藥學院，北京 102488

千金子系大戟科大戟屬植物續(xù)隨子Euphorbia lathyrisL.的干燥成熟種子，味辛，性溫，歸肝、腎、大腸經(jīng)，具有瀉下逐水、破血消癥之功[1]，可用于水腫、痰飲、二便不通、積滯腹脹、瘀血經(jīng)阻，外治疣贅、頑癬[2-3]。千金子作為瀉下逐水藥中的有毒中藥，常制霜減毒后使用，但毒性一直制約著千金子的臨床應(yīng)用。目前初步研究認為，千金子炮制減毒的機制主要與制霜后二萜醇酯類化合物含量降低有關(guān)，有研究表明千金子制霜后千金子素L1、千金子素L2、千金子素L3、千金子素L8的含量明顯降低[4-6]。

近年來文獻報道大戟科中藥多具有腎毒性[7-10]，但未見對千金子腎毒性作用的研究。人胚腎細胞HEK293 是源于胚胎腎臟組織的永生化細胞，常用于中藥的體外腎毒性研究[11-12]，因此本研究以HEK293 細胞為研究對象，通過比較千金子制霜前后提取物對HEK293 細胞的毒性差異，為探討千金子制霜減毒的作用機制提供新思路，為千金子的臨床安全應(yīng)用提供參考。

1 材料

千金子飲片（安徽滬譙中藥飲片廠，批號：1203070692）經(jīng)北京中醫(yī)藥大學的劉春生教授鑒定為大戟屬續(xù)隨子Euphorbia lathyrisL.的干燥成熟種子。千金子生品及霜品提取物均為實驗室自制。

DMEM 培養(yǎng)基（批號：10569044）、胎牛血清（批號：10091-418）、胰酶（批號：15050057）、青霉素-鏈霉素雙抗（批號：15140122）、磷酸鹽緩沖液（PBS，批號：C10010500BT）均購于美國Thermo公司；細胞增殖檢測試劑盒（批號：C35006）、細胞凋亡檢測試劑盒（批號：C1062S）、細胞周期檢測試劑盒（批號：C1052S）均購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；乳酸脫氫酶（LDH）檢測試劑盒（批號：A020-2）、谷胱甘肽（GSH）檢測試劑盒（批號：A006-2-1）、尿素氮（BUN）檢測試劑盒（批號：C013-2-1）、肌酐（Cr）檢測試劑盒（批號：C011-2-1）均購于南京建成科技有限公司；實驗用水由密理博純水儀制備。

IX51 型倒置相差顯微鏡（日本Olympus 公司）；311 型CO2恒溫培養(yǎng)箱、1550 型酶標儀（美國Thermo公司）；HR1500-IIA2型生物安全柜（海爾集團）；5424 型離心機（德國Eppendorf 公司）；Milli-Q Biocel 型純水機（美國Millipore 公司）；AUW120 D220D型分析天平（日本島津公司）；BD-C6型流式細胞儀（美國BD公司）。

HEK293 細胞來自美國模式菌種收集中心（ATCC）細胞庫。

2 方法

2.1 千金子生品、霜品提取物及供試品溶液的制備

千金子霜品由本實驗室采用壓制法對千金子去油制霜而成，參考《中華人民共和國藥典》2020 年版千金子霜項下方法[1]，取適量千金子，去皮取凈仁，碾碎如泥，經(jīng)微熱，壓榨除去大部分油脂，含油量符合要求后，取殘渣研制成符合規(guī)定的松散粉末。制備的千金子霜含油量為19.2%。

分別稱取千金子生品、霜品250 g 置于量瓶中，加95%乙醇加熱回流提取3 次。將提取液放冷后濾過，合并濾液，減壓回收至無醇味，加適量水分散，以等體積石油醚為溶劑萃取3 次，回收溶劑得千金子生品、霜品石油醚提取物。

取相當于生藥量0.32 g 的千金子生品、霜品提取物，加入二甲基亞砜（DMSO）50 mL，制成生藥質(zhì)量濃度為6.4 mg·mL–1的母液，以DMEM 培養(yǎng)基等比例稀釋，得質(zhì)量濃度分別為12.5、25.0、50.0、100.0、200.0、400.0、800.0、1 600.0、3 200.0、6 400.0 μg·mL–1的供試品溶液，各供試品溶液以0.22μm的濾膜濾過后，備用。

2.2 細胞培養(yǎng)

HEK293 常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM 培養(yǎng)基中，置于37 ℃、CO2體積分數(shù)5%、相對濕度70%～80%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞密度達80%～90%時，用胰蛋白酶消化，按照1∶4 進行傳代，取狀態(tài)良好的細胞進行實驗。

2.3 CCK-8法檢測HEK293細胞存活率

將處于對數(shù)生長期的HEK293 細胞接種于96 孔板中，每孔5000 個細胞，培養(yǎng)過夜。待細胞生長到匯合狀態(tài)，加入質(zhì)量濃度分別為12.5、25.0、50.0、100.0、200.0、400.0、800.0、1 600.0、3 200.0、6 400.0 μg·mL–1的各千金子供試品溶液，同時設(shè)置空白組（只加入等體積的DMEM 培養(yǎng)基）和對照組（只加入細胞和等體積的DMEM 培養(yǎng)基），每組設(shè)置5 個復孔，處理48 h 后每孔加入CCK-8 溶液10 μL。在37 ℃孵育1 h 后，利用酶標儀測定450 nm 處的吸光度（A），按照公式（1）計算細胞存活率。

2.4 細胞數(shù)目及形態(tài)觀察

選擇對數(shù)生長的HEK293細胞，以1×105個/孔均勻接種于6 孔板，分為對照組，千金子生品低、中、高質(zhì)量濃度（100、200、400 μg·mL–1）組和千金子霜品低、中、高質(zhì)量濃度（100、200、400 μg·mL–1）組。細胞置于CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，各給藥組分別加入相應(yīng)質(zhì)量濃度的千金子生品和霜品提取物溶液1 mL。對照組給予等體積無血清細胞培養(yǎng)液，每組分別設(shè)3個復孔。于CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h 后，置于倒置相差顯微鏡下觀察HEK293 細胞數(shù)目及細胞形態(tài)，并拍照。

2.5 碘化丙啶（PI）染色法檢測細胞周期

選擇對數(shù)生長的HEK293 細胞，細胞分組及處理同2.4 項下。培養(yǎng)48 h 后，各給藥組分別加入相應(yīng)質(zhì)量濃度的千金子生品和霜品提取物溶液1 mL。對照組加入等體積無血清細胞培養(yǎng)液，每組分別設(shè)置3 個復孔。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h 后，收集細胞，并用PBS 重復洗滌，棄去上清液后，加入預(yù)冷的70%乙醇1 mL 固定，輕輕吹打混勻，在4 ℃放置過夜。染色前用PBS 洗去固定液，1000×g離心5 min。加入PI/RNase staining buffer 0.5 mL混勻，避光條件染色30 min 后，使用流式細胞儀在激發(fā)波長488 nm紅色熒光下檢測。

2.6 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡

選擇對數(shù)生長的HEK293細胞，細胞分組及處理同2.4項下。在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，用0.25%胰酶消化處理貼壁細胞，用預(yù)冷的PBS 溶液重復洗滌，1000×g離心5 min，棄上清。加入Binding Buffer 300 μL 于樣品管中使細胞懸浮，再加入Annexin VFITC 5 μL 及PI 10 μL，避光條件孵育15 min，最后用流式細胞儀進行檢測。

2.7 試劑盒檢測生化指標

選擇對數(shù)生長的HEK293細胞，細胞分組及處理同2.4項下。培養(yǎng)48 h后收集細胞上清液，按試劑盒說明書檢測上清液中BUN、Cr、LDH 水平。每孔細胞用PBS 溶液重復洗滌后，加入RIPA 細胞裂解液裂解30 min，收集細胞，4 ℃、12 000 r·min–1離心10 min（離心半徑為8.4 cm），取上清液，按照試劑盒的說明書測定細胞裂解液中GSH水平。

2.8 統(tǒng)計學處理

采用SAS 9.4 軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，各組數(shù)據(jù)以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），兩組間比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 千金子制霜前后對HEK293細胞存活率的影響

CCK-8 結(jié)果表明，作用于HEK293 細胞48 h 后，與對照組比較，千金子生品組質(zhì)量濃度為50.0～6 400.0 μg·mL–1時，細胞存活率呈劑量依賴性降低（P<0.01）；與千金子生品相應(yīng)質(zhì)量濃度組比較，千金子霜品組質(zhì)量濃度為50.0～1 600.0 μg·mL–1時，細胞存活率顯著升高（P<0.01），且呈量-效關(guān)系，見表1。

表1 千金子生品和霜品對HEK293細胞存活率的影響（,n=5）

表1 千金子生品和霜品對HEK293細胞存活率的影響（,n=5）

注：與對照組比較，**P<0.01；與千金子生品相應(yīng)質(zhì)量濃度組比較，##P<0.01。

3.2 千金子制霜前后對HEK293 細胞數(shù)目及形態(tài)的影響

結(jié)果顯示，對照組HEK293 細胞數(shù)目多且形態(tài)呈梭形，細胞間隙較小，生長情況良好。與對照組比較，千金子生品組細胞數(shù)目減少、形態(tài)皺縮、體積變小、細胞間隙變大、凋亡小體增加。隨著千金子生品劑量增加，死亡細胞數(shù)目增加。與千金子生品組比較，千金子霜品相應(yīng)質(zhì)量濃度組細胞數(shù)目增加、形態(tài)皺縮的情況得以改善、細胞間隙縮小、凋亡小體減少、死亡細胞數(shù)目減少，且呈劑量依賴性，見圖1。

3.3 千金子制霜前后對HEK293細胞周期的影響

流式細胞儀檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，千金子生品各質(zhì)量濃度組HEK293 細胞G0/G1、G2/M 期比例顯著降低（P<0.05，P<0.01），S期細胞比例顯著升高（P<0.01）。與千金子生品組比較，千金子霜品相應(yīng)質(zhì)量濃度組S 期細胞比例顯著降低（P<0.01），G2/M 期細胞比例升高（P<0.05，P<0.01），提示千金子生品可導致HEK293 細胞周期阻滯，而制霜后可明顯降低S 期細胞比例，升高G2/M 期細胞比例，結(jié)果見表2。

表2 千金子生品和霜品對HEK293細胞周期的影響（,n=3）

表2 千金子生品和霜品對HEK293細胞周期的影響（,n=3）

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與千金子生品相應(yīng)質(zhì)量濃度組比較，#P<0.05，##P<0.01；表3～4同。

3.4 千金子制霜前后對HEK293細胞凋亡的影響

與對照組比較，千金子生品各質(zhì)量濃度組HEK293 細胞的早期凋亡率、晚期凋亡率、總凋亡率顯著升高（P<0.05，P<0.01），呈劑量依賴性；與千金子生品組比較，千金子霜品相應(yīng)質(zhì)量濃度組可顯著降低細胞早期凋亡率、晚期凋亡率及總凋亡率（P<0.01），且呈劑量依賴性，結(jié)果見表3。

表3 千金子生品和霜品對HEK293細胞凋亡的影響（,n=3）

表3 千金子生品和霜品對HEK293細胞凋亡的影響（,n=3）

3.5 千金子制霜前后對HEK293 細胞腎功能指標的影響

與對照組比較，千金子生品各質(zhì)量濃度組HEK293細胞中GSH 水平顯著降低（P<0.01），LDH 活性顯著升高（P<0.01），BUN、Cr 水平顯著升高（P<0.05，P<0.01）。與千金子生品組比較，千金子霜品相應(yīng)質(zhì)量濃度能顯著提高HEK293 細胞中GSH 水平（P<0.01），降低LDH活性和BUN、Cr水平（P<0.05，P<0.01），且具有一定的劑量相關(guān)性，見表4。

表4 各組HEK293細胞上清液中LDH、BUN、Cr水平及細胞內(nèi)GSH水平（,n=3）

表4 各組HEK293細胞上清液中LDH、BUN、Cr水平及細胞內(nèi)GSH水平（,n=3）

4 討論

中藥體外腎損傷可降低腎細胞存活率，導致細胞形態(tài)變差，BUN、Cr 溢出而進入血漿。BUN、Cr是機體的蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)物，反映氮的分解和腎的排泄功能，常用于腎臟疾病和藥物性腎組織損傷的監(jiān)測和診斷[13-14]，其含量變化與腎細胞損傷程度直接相關(guān)。LDH 是廣泛分布于腎細胞內(nèi)中的生化酶，正常時不能透過細胞膜，當細胞受損或缺氧時外泄到培養(yǎng)液中，故LDH 細胞外活力增高程度與腎損傷程度密切相關(guān)[15-17]。氧化損傷是導致腎損傷發(fā)生的機制之一，GSH 是一種細胞質(zhì)中普遍存在的抗氧化物，在細胞內(nèi)能清除過氧化物代謝產(chǎn)物，保護細胞免受氧化性傷，當GSH 水平下降，機體氧自由基的清除能力降低，可導致機體出現(xiàn)嚴重的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)[18]，造成組織細胞損傷。綜上，當腎細胞受到損傷時，機體內(nèi)氧化指標和腎功能指標異常，抑制細胞增殖，促進細胞凋亡。

細胞周期是細胞生命活動的動態(tài)過程，從功能角度分成G0/G1期、S期和G2/M期[19]。當細胞受到一定的刺激后，細胞周期運轉(zhuǎn)過程會出現(xiàn)障礙，不能使細胞平穩(wěn)正常進入下一個時期，造成細胞周期阻滯直接導致細胞凋亡，抑制細胞增殖。細胞凋亡是細胞程序化死亡，經(jīng)一系列基因活化及調(diào)控細胞有序的、自主的主動死亡過程，在細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)、細胞衰老和機體生長發(fā)育等方面發(fā)揮著重要作用[20]。當腎細胞受到損傷時，能夠引起其細胞周期明顯阻滯，從而抑制細胞增殖與分化，促進細胞凋亡。

本研究從細胞增殖與凋亡、氧化損傷及腎細胞功能角度初步探討了千金子制霜前后提取物對HEK293 細胞的毒性損傷及作用機制，實驗結(jié)果表明，千金子生品對HEK293 細胞增殖有明顯的抑制作用，呈一定的量-效關(guān)系，并使細胞形態(tài)變差；千金子霜品對HEK293 細胞增殖的抑制作用明顯降低，可提高其存活率，并改善細胞形態(tài)。結(jié)合文獻[21-25]及本實驗結(jié)果分析，千金子生品造成腎細胞損傷可能有以下幾種途徑：1）降低HEK293 細胞在G0/G1期、G2/M 期的比例，升高S 期的比例，明顯抑制S 期向G2/M 期的轉(zhuǎn)化，導致細胞復制受阻，減慢細胞分裂速度，降低細胞存活率，促進細胞凋亡。2）造成腎細胞氧化損傷，機體內(nèi)積聚過多氧自由基，引發(fā)過氧化脂質(zhì)反應(yīng)，從而降低LDH和GSH水平，導致腎細胞膜損傷及細胞代謝異常，從而促進細胞凋亡。3）使腎細胞膜受損，BUN、Cr等通過細胞膜溢出細胞進入血漿，腎功能異常，造成HEK293細胞過度凋亡。千金子制霜后可通過減輕細胞氧化損傷，改善腎細胞功能損傷，減少細胞凋亡從而降低腎毒性，這為進一步闡明千金子制霜減毒的機制提供了參考。