代熙，郭然，黃厚鈺，耿澤宇，袁皓，翟玉生，郝恩普，李衛(wèi)東*

1.北京中醫(yī)藥大學 中藥學院，北京 102488；2.山東坤和堂藥業(yè)股份有限公司，山東 菏澤 274000；3.通渭縣清涼沅金銀花產業(yè)扶貧開發(fā)有限公司，甘肅 通渭 743300；4.巨鹿縣發(fā)展和改革局，河北 巨鹿 055250

金銀花為忍冬科植物忍冬Lonicera japonicaThunb.的干燥花蕾或帶初開的花，自古以來作為對抗瘟疫流感的上品良藥，具有清熱解毒、疏散風熱的功能[1]。在抗擊2020 年新型冠狀病毒疫情中，金銀花在預防期用藥處方中出現(xiàn)頻次較高[2]，在阻止疫情擴散中發(fā)揮了較大作用。以綠原酸為代表的酚酸類成分是金銀花中主要的藥效成分，是其抗菌消炎的物質基礎；木犀草苷等黃酮類成分具有抗病毒、抗氧化、增強免疫等作用，也是區(qū)分金銀花和山銀花的標志性物質[3]。《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020 年版增加了綠原酸、3,5-二-O-咖啡酰奎寧酸（異綠原酸A）和4,5-二-O-咖啡?？鼘幩幔ó惥G原酸C）3 個酚酸類成分總量的指標，對金銀花藥材質量提出了更高的要求，而當前缺少對金銀花中3種酚酸類成分總量指標的研究報道。

金銀花的主產區(qū)為山東省平邑縣、河南省封丘縣和河北省巨鹿縣[4]。隨著國家脫貧攻堅和鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略的推行，金銀花因其適應性好、宜栽種成活并且利潤較高，被作為經濟植物在全國貧困地區(qū)大面積栽種。近些年出現(xiàn)了許多新興產區(qū)，如新疆、甘肅和云南等，目前上述新產區(qū)的金銀花研究報道較少，缺少對比評價。這些新產區(qū)通常處于高原等偏遠地帶，當地的光照、土壤、氣候等自然條件可能會對金銀花質量帶來影響，隨著《中國藥典》2020 年版增加了檢測指標，市場對金銀花的質量要求更加嚴格。因此，通過對不同地區(qū)金銀花藥材進行調查分析，了解當前金銀花質量情況，并以此為依據制定金銀花藥材等級質量標準，對規(guī)范金銀花藥材市場、推動未來金銀花產業(yè)健康發(fā)展具有重要意義。

1 材料

1.1 試藥

對照品綠原酸（批號：Y22M8K36544）、異綠原酸A（批號：Z05M10X87215）、異綠原酸C（批號：Z05M10X87215）、木犀草苷（批號：Y13J10H93050）均購自上海源葉生物科技有限公司，純度均≥98%；乙腈（色譜純，美國賽默飛世爾科技公司），甲醇、乙醇、磷酸、乙酸（分析純，北京化工廠），娃哈哈純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）。

1.2 儀器

LC-20 A 型高效液相色譜儀[配置SPD-M20A型二極管陣列（PDA）檢測器、SIL-20A 型自動進樣器、CTO-20A 型柱溫箱，日本島津公司]；Diamonsil Plus C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，迪馬科技有限公司）；ZORBAX SB-phenyl 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，美國安捷倫科技公司）；KQ-400KDE型高功率數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；QUINTIX65-1CN 型十萬分之一電子天平（賽多利斯科學儀器有限公司）。

1.3 樣品

課題組于2020年5—7月從全國不同地區(qū)收集各等級規(guī)格的金銀花，其中道地產區(qū)樣品采集于河北巨鹿、山東平邑和河南封丘，各16 份；新產區(qū)樣品分別采集于甘肅通渭、新疆喀什、云南云龍、陜西蒲城、寧夏中衛(wèi)，各6 份。共計8 個地區(qū)78 份樣品，經北京中醫(yī)藥大學李衛(wèi)東研究員鑒定為忍冬科植物忍冬Lonicera japonicaThunb.的干燥花蕾或帶初開的花，樣品信息見表1。

表1 金銀花樣品信息

2 方法

2.1 外觀性狀測定

目前，已有研究中以色澤、花蕾個數、花蕾長度、褐變率、黃條率、開花率和枝葉率等外觀性狀作為金銀花等級區(qū)分指標[5-9]。對于中藥材商品規(guī)格而言，等級標準的制定應盡量遵循可操作性和簡便易行的原則[10]。在金銀花實際生產中，色澤、黃條率和枝葉率是最典型的外觀形狀，因此本研究選擇上述3個外觀指標用來進行質量評價和等級區(qū)分。

色澤：觀察金銀花樣品整體顏色進行并分類，見圖1。根據數量分類學中多態(tài)性狀的編碼方法分為黃色、黃綠色、綠色3個等級[5]，用連續(xù)排列正整數1～3進行編碼，金銀花樣品整體呈黃色者賦值“1”；黃綠色或綠色夾雜較多黃條者賦值“2”；綠色賦值“3”。

圖1 不同等級金銀花外觀顏色對比

黃條率和枝葉率：按照五點取樣法，從樣品中選取10 g 金銀花，分離出黃色金銀花和已經開放的金銀花并稱定質量，計算其質量分數，得到黃條率；同理分離出枝葉碎屑計算得到枝葉率。

2.2 指標成分含量測定

按《中國藥典》2020 年版金銀花【含量測定】項下方法檢測樣品中酚酸類和木犀草苷成分含量，其中酚酸類成分包括綠原酸、異綠原酸A 和異綠原酸C，并計算3種酚酸的總含量。

2.3 數據處理

使用Origin 2018 對數據進行可視化處理；采用SIMCA 14.1軟件對不同地區(qū)和加工方式的金銀花進行主成分分析（principal components analysis，PCA）；采用SPSS 26.0 對不同等級金銀花進行系統(tǒng)聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA）和相關性檢驗；采用SPSSAU 20.0 計算不同等級金銀花的相關性權重（CRITIC）。

3 結果

3.1 金銀花外觀性狀和指標成分分析

金銀花外觀性狀和指標成分測定結果見表2。本研究共收集了30 份黃色金銀花、28 份黃綠色金銀花、20 份綠色金銀花，其中黃條率的變化范圍較大，為2.67%～97.44%，而枝葉率均小于10%。

表2 78批金銀花的外觀形狀和指標成分的質量分數

續(xù)表2

續(xù)表2

3.1.1 不同色澤的金銀花和指標成分含量的關系使用Origin 2018將各指標成分的結果繪制成散點圖，并根據色澤編碼對各樣本點進行相應的顏色標注，見圖2，可直觀觀察到綠原酸質量分數為1.17%～3.66%，平均值為2.42%（《中國藥典》2020 年版要求≥1.5%）；異綠原酸A 質量分數為1.02%～3.53%，平均值為2.12%；異綠原酸C 的質量分數為0.07%～0.35%，平均值為0.18%；3 種酚酸成分的總質量分數為3.34%～6.59%，平均值為4.72%（《中國藥典》2020年版要求≥3.8%）；木犀草苷質量分數為0.045%～0.185%，平均值為0.084%（《中國藥典》2020 年版要求≥0.05%），說明實驗所用金銀花樣品具有代表性。

圖2 不同顏色金銀花指標成分含量分布散點圖（n=78）

3.1.2 不同地區(qū)的金銀花色澤和指標成分含量對比 不同地區(qū)的金銀花色澤和指標成分含量對比見表3。在8個產區(qū)中，云南云龍地區(qū)的金銀花色澤數值最低，甘肅通渭的金銀花色澤數值最高。山東、河南、河北3 個主產地區(qū)金銀花的指標成分含量差別不大，其中河南金銀花綠原酸和木犀草苷含量在3 個主產區(qū)中最高，但總酚酸含量最低；河北金銀花綠原酸含量最低，但總酚酸含量最高；山東金銀花各成分含量介于兩者之間。而新產區(qū)金銀花指標成分含量相差較大，其中通渭金銀花綠原酸、木犀草苷含量和總酚酸含量高于其他5 個地區(qū)；云南金銀花綠原酸含量最低，但異綠原酸A 和異綠原酸C含量最高；新疆金銀花綠原酸和木犀草苷含量和主產區(qū)類似，然而異綠原酸A、異綠原酸C 及總酚酸含量在6個地區(qū)中最低。

表3 不同地區(qū)金銀花顏色和成分含量對比（）

表3 不同地區(qū)金銀花顏色和成分含量對比（）

3.1.3 不同加工方式的金銀花色澤和指標成分含量對比 不同加工方式的金銀花色澤和指標成分含量對比見表4。不同加工處理的金銀花色澤數值大小為：烘干>殺青烘干>陰干>曬干。殺青烘干處理的金銀花綠原酸、異綠原酸C 和總酚酸含量最高；烘干處理的金銀花木犀草苷含量最高；曬干處理的金銀花總酚酸含量最低；陰干處理的金銀花異綠原酸A含量最高，但綠原酸和木犀草苷含量最低。

表4 不同加工方式金銀花顏色和成分含量對比（）

表4 不同加工方式金銀花顏色和成分含量對比（）

3.2 金銀花等級標準劃分

3.2.1 PCA 為了分析金銀花藥材質量的差異性規(guī)律，在剔除指標含量低于《中國藥典》2020 年版規(guī)定的12 份不合格樣品后，使用SIMCA 14.1 軟件進行PCA，根據樣品的產地和加工方式對66 批金銀花進行分組，分別得到PCA 得分圖（圖3）。由圖3A可知，3個主產區(qū)的金銀花分布特征相似，可將3個主產區(qū)作為一個整體，并且陜西蒲城、寧夏中衛(wèi)和新疆喀什地區(qū)的金銀花與主產區(qū)特征相近，分布重合。但甘肅通渭和云南云龍地區(qū)的部分樣品與主產區(qū)樣品距離較遠，說明這2 個地區(qū)金銀花特征與主產區(qū)差異較大。在圖3B中，PCA模型可以對不同加工方式的樣品進行較好地區(qū)分，其中烘干與殺青烘干分布較為重疊、相似度高，但這2 種加工方式與曬干、陰干區(qū)分界限明顯，說明不同加工方式會對金銀花質量產生較大影響，并且從整體上可以將烘干和殺青烘干歸為一類（機器加熱干燥）、曬干和陰干歸為一類（自然晾干）。

在主成分因子載荷圖（圖3 C）中，橫縱坐標分別為在第1 主成分及第2 主成分中各指標對PCA 模型的貢獻率，距離原點越遠表明該指標對樣品的差異貢獻率越大[11]?？偡铀岷俊⒕G原酸含量、色澤及黃條率在第1 主成分上載荷量較大，異綠原酸A、異綠原酸C 和木犀草苷含量在第2 主成分上載荷量較大，說明這些指標是影響金銀花產生等級差異的主要因素。

圖3 金銀花PCA（n=66）

3.2.2 HCA 由PCA 結果可知，54、61、63 號為離群樣本，將66 批合格樣品中3 個離群樣本剔除，數據標準化處理后，運用SPSS 26.0 進行HCA，聚類方法為瓦爾德法，利用歐式平方距離法進行計算，聚類結果見圖4。HCA 將金銀花分為4 類（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ），其中Ⅰ類金銀花顏色多為綠色，其綠原酸含量、總酚酸含量、木犀草苷含量最高，異綠原酸A、異綠原酸C 含量、枝葉率和黃條率較低；Ⅱ類金銀花主要為綠色和黃綠色，其綠原酸含量、異綠原酸A、異綠原酸C 含量、總酚酸含量水平次高；Ⅲ類和Ⅳ類之間距離較近，顏色均為黃綠色或黃色，其中Ⅲ類金銀花各含量指標較低，Ⅳ類金銀花綠原酸含量最低，但異綠原酸A 和異綠原酸C 含量最高，枝葉率和黃條率最高。因此對金銀花的質量等級劃分為4類比較合適。

圖4 金銀花樣品HCA

3.2.3 相關性檢驗 使用SPSS 26.0繼續(xù)對HCA處理的樣品各指標進行相關性分析，結果見表5。除水分外，其他指標之間的相關性較強，適合用作等級劃分。綠原酸含量與色澤、總酚酸含量及木犀草苷含量呈極顯著正相關（P<0.01），與黃條率、枝葉率呈極顯著負相關（P<0.01），但是與異綠原酸A含量呈顯著負相關（P<0.05），綠原酸和異綠原酸A均為正向指標卻具有負相關性，因此兩者不適合同時用作等級劃分的指標；木犀草苷含量與綠原酸含量呈極顯著正相關（P<0.01），與異綠原酸A、異綠原酸C含量呈顯著負相關（P<0.05），同樣木犀草苷也不適合與異綠原酸A、異綠原酸C 含量一起作為等級劃分指標?？紤]到各指標之間的相關性和沖突性，以及實際操作的簡便性，用作等級質量標準劃分的指標不宜太多，最終選擇3 個外觀形狀指標（色澤、黃條率、枝葉率）和3 個內在成分指標（綠原酸含量、總酚酸含量、木犀草苷含量）綜合進行等級劃分。

表5 金銀花各項等級指標相關性檢驗

3.2.4 綜合權重分析 層次分析法（AHP）是最常用的主觀權重賦值法，其通過決策者的經驗判斷各指標的相對重要程度，來合理地給出各指標權重，進而對項目進行優(yōu)劣排序[12]。將本研究指標分為6個層次，各層次之間的相對重要程度為總酚酸含量（X5）>綠原酸含量（X4）>顏色（X1）>木犀草苷含量（X6）=黃條率（X2）>枝葉率（X3），所構建的判斷矩陣評分見表6，一致性比率因子（CR）=0.016<0.10，滿足一致性檢驗，計算得到顏色、黃條率、枝葉率、綠原酸含量、總酚酸含量、木犀草苷含量的指標權重分別為0.155 4、0.090 1、0.040 3、0.228 4、0.380 8、0.105 1。指標CRITIC 是一種客觀權重賦值法，其原理是利用數據自身波動性和相關性進行分析，相較于主觀權重賦值法更能直觀反映各指標權重的關系[13]。計算權重前需要先將數據進行極值標準化，再導入SPSSAU 20.0 軟件構建判斷矩陣，得出判斷矩陣的對比強度與沖突性指標，確定各指標權重系數分別為0.239 6、0.221 6、0.115 8、0.098 5、0.126 4、0.188 7。將上述兩種方法結合，按公式（1）計算綜合權重（ω）。

表6 金銀花等級指標AHP優(yōu)先判斷矩陣

式中ωAHP-CRITIC表示6個指標各自的ω，對各樣本進行綜合評分，能夠基于主觀和客觀兩個方面進行分析評價，其結果更能反映樣本實際情況，6 個指標各自的ω分別為0.247 9、0.130 5、0.030 5、0.147 0、0.314 5 和0.1296。最終按公式（2）計算綜合得分（Q）。

綜合得分結果見圖5、表7，分值越高說明金銀花質量越好，其分布符合正態(tài)分布（P=0.200>0.05），進一步將樣品分為4 個區(qū)間[14]，參考4 個區(qū)間各指標范圍進行等級標準的劃分，得到最終等級標準，見表8。

表7 金銀花樣品綜合得分結果

表8 金銀花等級質量劃分標準

圖5 金銀花樣品綜合得分分布直方圖

4 討論

《中國藥典》2020 年版規(guī)定金銀花中綠原酸含量不得低于1.5%，酚酸類總量不得低于3.8%，木犀草苷含量不得低于0.05%?？偡铀岷繛椤吨袊幍洹?020 年版新增指標，規(guī)定為金銀花中3 個咖啡酰奎寧酸的總含量，用來總體評價金銀花中酚酸類成分的含量特征。本研究共計12 份樣品含量不達標，其中綠原酸不達標的樣品數量最少，僅有2 份；有3 份樣品的木犀草苷含量不達標；總酚酸含量不合格的樣品最多，共8 份，說明目前金銀花生產不能僅僅關注綠原酸含量，還應重視總體酚酸類成分水平的提高。

通過對比不同產地金銀花成分含量和PCA 得分圖發(fā)現(xiàn)，主產區(qū)金銀花質量相對比較穩(wěn)定，3 大產區(qū)金銀花特征比較類似。而新產區(qū)金銀花含量相差較大，可能是處于不同土壤地理條件和氣候環(huán)境的原因。山東、河南、河北3 個主產區(qū)同為溫帶季風氣候，地理氣候條件類似。甘肅通渭處于黃土高原，海拔較高，紫外線輻射強，氣候干旱；新疆地區(qū)位于溫帶大陸性氣候區(qū)，晝夜溫差大，光照充足；云南云龍位于云貴高原，當地氣候濕潤，水資源豐富。這些新產區(qū)的地理氣候環(huán)境同主產區(qū)有很大的不同。金銀花是適應性很強的植物，耐干旱耐貧瘠，如果生產種植管理得當，這些脅迫環(huán)境可能會有利于金銀花有機酸、黃酮等次生代謝物質的積累，促進藥效成分含量的提升[15]。本研究僅限于《中國藥典》2020年版限定的檢測指標，新產區(qū)金銀花其他化學成分和藥理藥效是否同主產區(qū)存在差異還有待研究驗證。

目前，市場上金銀花加工方式主要為烘干、曬干，少數為殺青烘干，偶有陰干。本研究通過對不同加工方式的金銀花樣品進行對比分析，發(fā)現(xiàn)不同加工方式得到的金銀花顏色不同。烘干處理的金銀花顏色偏綠，而曬干金銀花顏色偏黃[7]，殺青烘干得到的金銀花顏色多為黃綠色，但殺青烘干金銀花綠原酸含量和總酚酸含量最高。雖然傳統(tǒng)認為“金銀花色青者佳”[16]，但不能僅通過顏色來判斷金銀花質量，還需結合藥效成分含量的高低進行分級定類。本研究通過聚類分析和相關性檢驗對各指標進行等級劃分驗證，再利用綜合評分法確定權重，最終將金銀花劃分為4 個等級。該分級方法通過結合外觀形狀和內在成分進行等級劃分，既保證一定的科學性，符合目前市場通用的分類習慣和實際情況，對金銀花生產和市場流通具有一定的參考意義。