牛思穎 徐嘉婕 徐夢(mèng)瑤 張議丹 夏利軍 江淼

血小板作為維持機(jī)體正常止血的主要成分，它與血管壁之間的相互作用啟動(dòng)了一系列生理止血過(guò)程：血小板黏附到破損的血管壁上，隨后發(fā)生活化、聚集、并在纖維蛋白原幫助下形成血小板血栓[1]。這一過(guò)程同樣也是病理性血栓形成的起始環(huán)節(jié)，而抑制血小板黏附已成為多個(gè)抗血栓藥物的作用靶點(diǎn)[2-3]。因此，在體外建立合適的模型以研究血小板在血管壁上的黏附對(duì)于分析血小板功能、判斷血栓發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)、檢測(cè)抗血栓藥物療效均有重要的作用[4]。

由于血小板在流體剪切力條件下的黏附、活化機(jī)制與靜止條件下存在極大的差異，因此檢測(cè)血小板黏附的模型需要最大限度地還原機(jī)體內(nèi)的血流環(huán)境。許多實(shí)驗(yàn)室根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛯?shí)驗(yàn)方法，建立了相應(yīng)的流動(dòng)裝置，從最簡(jiǎn)單的錐板黏度儀到采用微流控技術(shù)的BioFlux系統(tǒng)等等，這些系統(tǒng)以不同方式模擬血流狀態(tài)[5-8]。由于方法學(xué)的限制，這些系統(tǒng)對(duì)血管管腔的設(shè)計(jì)局限為正常的直通血管，對(duì)于存在局部狹窄、血管分支、瓣膜受損等病理血管條件則無(wú)法模擬，而這些病理血管條件恰恰是誘發(fā)病理性血栓生成的重要因素。本研究以平行平板流動(dòng)小室（parallel plate flow chamber）為基礎(chǔ)，對(duì)其中的模擬血管管腔進(jìn)行了針對(duì)性的改良，使用該裝置對(duì)不同血流條件下的血小板黏附進(jìn)行了檢測(cè)。

材料與方法

1 改良型平板流動(dòng)小室的設(shè)計(jì)

1.1 材料和設(shè)備：有機(jī)玻璃板（蘇州惠諾有機(jī)玻璃有限公司）、硅膠墊片及聚四氟乙烯硅膠管（深圳正光硅膠制品有限公司）、LSP2-2A型恒流泵（保定蘭格恒流泵有限公司）、Axiovert 40倒置顯微鏡（德國(guó)Leica）、彩色制冷CCD相機(jī)（加拿大Qicam公司）；五分類血球計(jì)數(shù)儀（日本SYSMEX公司）；血小板聚集儀（美國(guó)Chrono-log公司）；Streampix視頻錄制軟件（加拿大Norpix公司）、可溶性Ⅰ型膠原蛋白（德國(guó)Sigma）、Calcein-AM熒光染料（日本東仁化學(xué)）、3.2%檸檬酸鈉靜脈血液真空采集管（上海碧迪）。抗血小板抗體SZ-2、抗膠質(zhì)瘤抗體SZ-39由江蘇省血液研究所血栓與止血實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 平板流動(dòng)小室的設(shè)計(jì)：該裝置包括上下兩塊有機(jī)玻璃平板，中間夾有硅膠墊片和載玻片。上層平板兩端設(shè)有連接進(jìn)、出液體的接口，下層平板中央留有直徑3 cm的圓孔以供倒置顯微鏡鏡頭貼近載玻片。硅膠墊片厚度為1.5 mm，墊片中劃出20 mm×2 mm的缺口。上下層平板、硅膠以及載玻片通過(guò)螺栓擰緊組合后，上層平板與載玻片在硅膠墊片留出的缺口處形成密閉的血流通道，該通道的下底面為載玻片，在載玻片上可包被膠原、VWF蛋白等不同基質(zhì)，也可在其表面接種血管內(nèi)皮細(xì)胞（圖1A）。通過(guò)激光雕刻技術(shù)可以在硅膠墊片中刻畫出不同寬窄的缺口，以此模擬不同直徑的血管，還可通過(guò)改變?nèi)笨谛螤钅M管腔中存在狹窄、分支等病理血管狀態(tài)（圖1B）。

圖1 改良的平板流動(dòng)小室各部分組件示意圖

2 血樣采集和血小板預(yù)處理 采用健康成年志愿者10人（經(jīng)蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)文號(hào)：2020倫審批第200040號(hào)， 男女各半，年齡21～47歲）的血樣作為對(duì)照組模擬正常平直血管內(nèi)的血小板黏附，其中5人的血樣又分別加入SZ-39單抗（陰性對(duì)照，終濃度20 μg/mL）和SZ-2單抗（20 μg/mL）進(jìn)行抗黏附藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)。志愿者血小板數(shù)量＞150×109/L，血脂正常，2周內(nèi)無(wú)服藥史，采集前簽署知情同意書。靜脈血液樣品以肝素（40 U/mL）抗凝管抗凝，室溫（25℃）保存，2 h內(nèi)使用。進(jìn)行黏附實(shí)驗(yàn)前15 min以Calcein-AM熒光染料對(duì)血小板進(jìn)行標(biāo)記：將濃度為1 mmol/L Calcein-AM 熒光染料按1∶1 000（v/v）加入血樣，輕輕混勻，放入37℃溫箱孵育。

為進(jìn)行血小板黏附抑制實(shí)驗(yàn)，將10 μL生理鹽水溶液配制的20 μg/mL的SZ-2抗體加入到血樣中作為藥物處理組，以20 μg/mL SZ-39抗體加入血樣作為陰性對(duì)照組，只加入10 μL生理鹽水的血液樣品作為空白對(duì)照組。

3 血小板黏附功能檢測(cè) 在使用平板流動(dòng)小室檢測(cè)血小板黏附功能之前，以Ⅰ型膠原對(duì)平板內(nèi)的血流通道進(jìn)行包被：以濃度為50 μg/mL乙酸酸化的Ⅰ型膠原蛋白溶液注入平板流動(dòng)小室，封閉兩端出入水口，于室溫靜置孵育過(guò)夜后以2% BSA溶液室溫孵育2 h，隨后以PBS溶液輕微沖洗通道2次，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將膠原包被后的平板流動(dòng)小室放置于倒置顯微鏡恒溫載物臺(tái)，用硅膠管（內(nèi)徑1.0 mm）將流動(dòng)小室的液體入口與恒流泵相連，使用恒流泵控制血液樣本通過(guò)流動(dòng)小室（圖2）。血流流速與剪切率通過(guò)近似泊肅葉（Poiseuille）方程換算：v=6Qa2b，其中，v（s-1）表示剪切率，Q（μL/s）代表流量，a（mm）代表小室深度，b（mm）代表小室寬度。經(jīng)過(guò)熒光標(biāo)記的血液由恒流泵泵出后，經(jīng)硅膠管道流入流動(dòng)小室，流動(dòng)小室上，顯微鏡物鏡靠近載玻片下底面，顯微鏡CCD相機(jī)對(duì)載玻片上的血小板黏附狀態(tài)進(jìn)行實(shí)時(shí)記錄。利用Image J軟件對(duì)采集的序列圖像進(jìn)行分析，計(jì)算出每張圖像中的熒光標(biāo)記血小板聚集體的表面覆蓋率。

圖2 平板流動(dòng)小室的檢測(cè)裝置示意圖

4 血小板聚集功能及血小板表面CD-62P表達(dá)檢測(cè) 收集流出平板流動(dòng)小室的血樣，根據(jù)體積補(bǔ)充1∶9枸櫞酸鈉抗凝劑，充分混勻后以1 100 r/min分離心5 min分離出富血小板血漿（PRP），剩余樣品以3 000 r/min離心10 min分離出乏血小板血漿（PPP），以PPP將PRP中的血小板濃度調(diào)節(jié)至30×107/mL。參照文獻(xiàn)方法[9]以PPP調(diào)零，PRP懸液在血小板聚集儀上以光學(xué)比濁法分別以ADP、瑞斯托霉素和膠原為誘導(dǎo)劑檢測(cè)血小板聚集率。

取流出平板流動(dòng)小室的血樣10 μL加入PE標(biāo)記的抗CD-62P抗體1 μL，37℃溫育15 min后加生理鹽水0.5 mL，在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)CD-62P表達(dá)率。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 不同實(shí)驗(yàn)組均重復(fù)三次以上，數(shù)據(jù)記錄、統(tǒng)計(jì)后以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS14.0軟件對(duì)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，不同組間比較采用配對(duì)的非參數(shù)Wilcoxon檢驗(yàn) ，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 血小板在正常血管腔內(nèi)的黏附 本研究中血液在高度為0.5～1.5 mm的微通道內(nèi)流動(dòng)，模擬血流剪切率為1 000～1 500 s-1，流體黏度接近于1，此時(shí)可將管腔內(nèi)流體行為視為經(jīng)典的不可壓縮牛頓流體[10]。當(dāng)使用0.5 mm硅膠墊片，剪切率為1 000 s-1，根據(jù)泊肅葉公式推算液體流速為1.2 mL/min。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，無(wú)論模擬病理血管或是正常血管，在I型膠原包被的管腔表面8～12 min均可達(dá)到接近最大血小板黏附覆蓋面積。考慮到用血量的限制，將黏附終止時(shí)間設(shè)置為10 min。由圖3A計(jì)算得出，在不加入任何黏附抑制劑或抗血小板藥物條件下，血小板在膠原表面可達(dá)到57.6±8.2%的黏附覆蓋率；當(dāng)加入足量抗黏附抑制劑SZ2單抗（20 μg/mL）時(shí)，血小板黏附被明顯抑制6.1±2.9%；而加入同等劑量的SZ-39單抗，血小板黏附率為54.8±10.1%。SZ-39組與空白對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而與SZ-2組之間差異顯著（P＜0.01），（圖3B），統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)見(jiàn)圖4。

圖3 流動(dòng)狀態(tài)下血小板在平板流動(dòng)小室管腔表面的黏附

圖4 血液樣本中加入不同單克隆抗體后的血小板黏附率

2 血小板在病理血管條件下的黏附 使用圖1B中的硅膠墊片，模擬血管內(nèi)存在粥樣斑塊導(dǎo)致局部管腔狹窄時(shí)的血流狀態(tài)，在同樣加入SZ2單抗（20 μg/mL）條件下，雖然整個(gè)血管腔的血小板黏附率未見(jiàn)顯著差異，但在管腔狹窄處兩側(cè)明顯可見(jiàn)有順血流方向分布的片狀血小板黏附（圖5）。

圖5 模擬局部管腔狹窄時(shí)血小板的黏附（加入20 μg/mL SZ2）

使用圖1B中的硅膠墊片，研究血管分支部位的血小板黏附情況，血管分支處的血小板明顯呈大片狀黏附、并相互聚集成團(tuán)，大量標(biāo)記熒光的血小板層疊后在圖像中顯示為過(guò)曝光白色區(qū)域（圖6）。

圖6 模擬血管分支部位血小板的黏附（未加黏附抑制劑）

3 流經(jīng)平板小室的血小板聚集和活化檢測(cè) 血小板由恒流泵推注流經(jīng)平板小室，小室內(nèi)包被的膠原屬于活體內(nèi)血管破損處暴露的基質(zhì)成分之一。血小板表面膜糖蛋白GPIb通過(guò)血漿中VWF分子的介導(dǎo)與膠原相互作用，從而產(chǎn)生向內(nèi)傳導(dǎo)的信號(hào)促使血小板活化?；罨“蹇沙霈F(xiàn)聚集功能的改變以及膜表面CD-62P的表達(dá)。

研究結(jié)果顯示，血小板流經(jīng)模擬正常血管的平板小室后，ADP誘導(dǎo)聚集率未有顯著改變；而流經(jīng)模擬狹窄血管的平板小室后，ADP誘導(dǎo)聚集率增高，CD-62P的表達(dá)也呈現(xiàn)同樣改變，顯示狹窄血管所產(chǎn)生的湍流對(duì)血小板有一定的激活作用。研究中使用針對(duì)血小板GPIb的單抗SZ2作為黏附抑制劑，由于SZ2的作用，瑞斯托霉素和膠原誘導(dǎo)的血小板聚集被明顯抑制（表1），但SZ-2對(duì)于血管狹窄所導(dǎo)致的CD-62P表達(dá)增高沒(méi)有抑制作用。

表1 血小板流經(jīng)平板小室后的聚集活性和CD62P表達(dá)水平

討 論

血栓栓塞性疾病是當(dāng)前危害人類健康，導(dǎo)致病死率最高的原因之一，如心肌梗死，腦血栓形成，深靜脈血栓形成，肺栓塞等。此外，血栓形成是許多疾病發(fā)病機(jī)制中涉及的一種重要病理過(guò)程，如動(dòng)脈粥樣斑塊形成、腎小球腎炎、糖尿病小血管病變、妊娠高血壓綜合征等[1]。所有這些生理、病理性血栓的形成都始于血小板在血管壁的黏附。因此，檢測(cè)血小板在血管壁上的黏附對(duì)于研究血小板功能、研制抗血栓藥物等都有重要價(jià)值[11]。

有研究者嘗試使用椎板黏度計(jì)模擬血流條件下的血小板黏附，但該裝置無(wú)法進(jìn)行表面黏附基質(zhì)的包被，也不能進(jìn)行實(shí)時(shí)觀測(cè)；其后有研究者使用毛細(xì)玻璃管或平板小室，以及在平板小室基礎(chǔ)上推出的BioFlux系統(tǒng)。毛細(xì)管和BioFlux系統(tǒng)對(duì)液體流動(dòng)狀態(tài)的模擬較為真實(shí)，但其管腔表面無(wú)法包被內(nèi)皮細(xì)胞[10]。相較之下，平板流動(dòng)小室原理簡(jiǎn)單，易于在顯微鏡下實(shí)時(shí)觀測(cè)并且能在管腔內(nèi)包被各種基質(zhì)（包括膠原、VWF分子、內(nèi)皮細(xì)胞等），是較為理想的研究血小板黏附的工具[12-13]。然而傳統(tǒng)的平板流動(dòng)小室仍然存在缺陷，一是為了便于使用倒置顯微鏡觀察黏附結(jié)果，其采用聚乙烯培養(yǎng)皿為下層板，以真空負(fù)壓將上下層平板及硅膠墊片貼合在一起，但在實(shí)際使用中，當(dāng)血液流速增大、血流側(cè)向剪切力接近動(dòng)脈壓力時(shí)，真空負(fù)壓已無(wú)法將上下層緊密貼合最終導(dǎo)致血流滲漏。本研究中用具備一定厚度的有機(jī)玻璃板為下層板，以螺栓將整個(gè)裝置緊合，同時(shí)在下層平板中開(kāi)孔以便顯微鏡物鏡貼近載玻片進(jìn)行觀測(cè)。這一改進(jìn)既保證了檢測(cè)裝置的密閉，同時(shí)也不影響顯微鏡觀測(cè)記錄影像，實(shí)際使用效果良好，目前已申請(qǐng)專利。

研究中設(shè)計(jì)的平板流動(dòng)小室由上層平板、硅膠墊片及下層板上的載玻片圍成密閉的管腔，管腔高度取決于硅膠墊片厚度，管腔的形狀和寬度取決于硅膠墊片中刻畫出的通道。本研究利用硅膠墊片易于加工的特性，在常規(guī)平直通道以外，還設(shè)計(jì)了帶有管腔內(nèi)部有狹窄、有血管分支以及有靜脈瓣膜的通道，用以模擬機(jī)體內(nèi)存在血管粥樣斑塊、血流紊亂、瓣膜缺損等病理血管狀態(tài)。根據(jù)流體動(dòng)力學(xué)原理，在血管狹窄或分支處，血流處于湍流狀態(tài)[14]；而在湍流狀態(tài)下施加于血小板的側(cè)向剪切力大于穩(wěn)流狀態(tài)且方向復(fù)雜，血小板極易發(fā)生活化進(jìn)而觸發(fā)“外向內(nèi)”信號(hào)傳導(dǎo)通路，使血小板發(fā)生黏附和聚集[15]。本研究中的黏附實(shí)驗(yàn)顯示，與平直血管相比，血管狹窄口前后的血小板黏附明顯多于管腔其他部位；而在血管分支處，除可見(jiàn)片狀血小板黏附，還可見(jiàn)多層血小板聚集，已呈現(xiàn)血小板血栓的形態(tài)。流經(jīng)病理血管管腔的血液分離出的PRP，ADP誘導(dǎo)聚集增強(qiáng)且CD62P表達(dá)增多，顯示其與正常對(duì)照相比具有更高的易栓傾向。由于粥樣斑塊形成等病理血管狀態(tài)在易栓人群中普遍存在，因此，單純以抗血小板黏附為靶向的抗血栓治療難以獲得理想的療效，在臨床實(shí)踐中必須與抗血小板活化、抗血小板聚集藥物聯(lián)用。

研究中設(shè)計(jì)改良的平板流動(dòng)小室可使用顯微鏡附帶的CCD相機(jī)實(shí)時(shí)記錄血小板黏附狀態(tài)，對(duì)于研究血小板功能、血小板與血管內(nèi)皮細(xì)胞，血小板與內(nèi)皮下基質(zhì)的相互作用、抗血栓藥物的藥效等都可以作為一種便捷易用的檢測(cè)裝置。我們使用該裝置檢測(cè)了多例健康供血者血小板的黏附，以及加入抗血小板抗體SZ-2后血小板黏附功能的改變，這些試驗(yàn)取得了較為滿意的結(jié)果。在此基礎(chǔ)上加以人機(jī)工學(xué)方面的改進(jìn)，該裝置有望成為檢驗(yàn)血栓狀態(tài)、監(jiān)測(cè)抗血栓藥物療效的儀器在臨床獲得應(yīng)用。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突