李玉璇 張玉龍 馬興煥 強(qiáng)書(shū)毓 王小慧 詹林盛

快速輸血補(bǔ)液，迅速恢復(fù)血容量是搶救大失血休克傷員的重要治療方式，能夠有效的防止因低灌注導(dǎo)致的多器官功能衰竭[1-3]。院前條件下，盡早為大量失血傷員輸注血液制品是美軍戰(zhàn)傷救治指南中的重要原則。不僅是軍方，美國(guó)地方急救中心也推薦創(chuàng)傷大失血傷員院前即接受輸血治療。嚴(yán)重創(chuàng)傷后由于大量失血、暴露于寒冷環(huán)境及維持正常體溫能力下降等原因，低體溫發(fā)生率高達(dá)10%～65%[4-5]。體溫過(guò)低合并器官灌注不足容易導(dǎo)致多臟器功能損傷，引起體內(nèi)各種生物酶活性降低，被認(rèn)為是傷員預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。低體溫、酸中毒以及凝血功能異常被稱(chēng)為大失血傷員的“死亡三聯(lián)征”[6]。院前環(huán)境的醫(yī)療設(shè)施和救治條件相對(duì)較差，傷員有可能會(huì)暴露在較為寒冷的環(huán)境中，低體溫的發(fā)生率可能會(huì)更高。因此，在創(chuàng)傷大失血傷員的院前救治中，傷員的體溫管理十分重要。

預(yù)防傷員低體溫的方式主要包括2類(lèi)：可以通過(guò)加熱毯包裹傷員以維持體溫；其次是在輸血和輸液過(guò)程中預(yù)先加溫液體，防止大量冷藏低溫血液短時(shí)間內(nèi)進(jìn)入人體，誘發(fā)傷員的低體溫癥[7]。因此，使用場(chǎng)景廣泛，便于攜帶的輸血加溫裝置用于院前輸血救治很有必要。電源供電的輸血加溫器受限于環(huán)境條件，在院前環(huán)境中應(yīng)用較少；蓄電池供電的輸血加溫器較為適合院前輸血使用，但目前蓄電池技術(shù)尚未有突破性的進(jìn)展，通常充電需要耗費(fèi)較長(zhǎng)的時(shí)間，且蓄電池日常需要較為頻繁的保養(yǎng)工作[3，8-9]。據(jù)此，考慮到院前環(huán)境的特殊性，基于過(guò)冷液體四水硝酸鈣凝固放熱原理，我們?cè)O(shè)計(jì)了一種無(wú)源輸血輸液加溫器，該裝置的特性包括如下5點(diǎn)：（1）無(wú)需電源供電，使用場(chǎng)景廣泛；（2）體積小，重量輕，便于攜帶；（3）啟動(dòng)發(fā)熱迅速，可在開(kāi)啟后1 min內(nèi)達(dá)到工作溫度；（4）工作溫度恒定保持在40℃，較為接近人體體溫。

為了進(jìn)一步研究使用該產(chǎn)品加溫后是否會(huì)對(duì)血液質(zhì)量產(chǎn)生影響，在本研究中我們分別加溫了全血和懸浮紅細(xì)胞，比較了加溫前后溶血率、血常規(guī)、生化指標(biāo)、形態(tài)學(xué)參數(shù)、膜損傷程度及凝血功能等指標(biāo)的變化，為該便攜式無(wú)源輸血輸液加溫器的轉(zhuǎn)化應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支撐。

材料與方法

1 血液來(lái)源 9份志愿者全血由解放軍總醫(yī)院第七醫(yī)學(xué)中心輸血科提供，每份30 mL，取出14 mL用于全血檢測(cè)，剩余16 mL血液常規(guī)制備懸浮紅細(xì)胞用于懸浮紅細(xì)胞檢測(cè)，之后置于4℃冰箱保存，經(jīng)48 h冷藏保存后待用。

2 儀器與試劑 一次性使用塑料血袋（四川南格爾生物科技有限公司），檸檬酸鹽-磷酸鹽-葡萄糖-腺嘌呤紅細(xì)胞保存劑（CPDA）（Sigma，批號(hào)：SLCF1808），注射泵（蘭格恒流泵有限公司），全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀（BC-5130深圳邁瑞公司），全自動(dòng)生化分析儀（羅氏，CobasC701），pH計(jì)（S210-8梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司），瑞式染液（索萊寶，批號(hào)：20210517），顯微鏡（BDS400重慶奧特光學(xué)儀器有限責(zé)任公司），微量游離血紅蛋白測(cè)試盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)：A071-1-1），多功能酶標(biāo)儀（SpectraMaxM5美國(guó)Molecular Devices公司），流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司），PE耦聯(lián)Annexin-V凋亡檢測(cè)試劑盒（美國(guó)BD公司，批號(hào)：0027279），F(xiàn)ITC耦聯(lián)anti-human CD47（Bio Legend，批號(hào)：B329356），血栓彈力圖儀（深圳優(yōu)迪生物技術(shù)有限公司），全自動(dòng)凝血測(cè)試儀（SF-8050北京賽科希德科技股份有限公司）。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 自制基于過(guò)冷液體凝固放熱的無(wú)源輸血加溫器：本裝置的加溫原理為過(guò)冷液體凝固放熱[10]。四水合硝酸鈣熔點(diǎn)為40℃，高純度的固態(tài)四水合硝酸鈣融化后自然冷卻能夠以液態(tài)的形式在0℃以上的環(huán)境中穩(wěn)定存在，這樣的低于凝固點(diǎn)依然以液態(tài)形式存在稱(chēng)為過(guò)冷液體。過(guò)冷液體在加入固態(tài)四水合硝酸鈣后整個(gè)體系會(huì)迅速開(kāi)始結(jié)晶，同時(shí)放出凝固熱，而使溫度上升到凝固點(diǎn)40℃，整個(gè)體系呈現(xiàn)為一種固態(tài)四水合硝酸鈣和液態(tài)四水合硝酸鈣的混合狀態(tài)，當(dāng)體系中的液態(tài)四水合硝酸鈣完全凝固后，體系溫度開(kāi)始下降。本加溫器的設(shè)計(jì)原理即基于此，第一腔室灌裝大量液態(tài)四水合硝酸鈣，約600 mL，第二腔室（包含輸血管路）放置少量固態(tài)四水合硝酸鈣，約50 g。使用前將兩腔室間的易碎帶掰開(kāi)，將第一腔室的液態(tài)四水合硝酸鈣擠入第二腔室，整個(gè)體系溫度會(huì)在1 min內(nèi)迅速升至40℃，即可開(kāi)始進(jìn)行血液加溫（圖1A、1B）。使用時(shí)血袋與加熱器的管路連接如圖1C所示，通過(guò)加溫器管路兩側(cè)的內(nèi)旋和外旋魯爾接頭與輸血器和穿刺針一側(cè)的外旋和內(nèi)旋魯爾接頭連接，輸注完畢后，管路里殘留的血液（約15 mL）處理方案與臨床輸血相同，通過(guò)將輸血器從空血袋上拔出，連接到生理鹽水袋上，通過(guò)生理鹽水將管路中殘留的血液完全回輸?shù)襟w內(nèi)。

圖1 基于過(guò)冷液體凝固放熱的無(wú)源輸血加溫器

3.2 輸血效果及血液質(zhì)量檢測(cè)：每個(gè)樣本實(shí)驗(yàn)前留取5 mL作為對(duì)照，另取5 mL經(jīng)無(wú)源輸血加溫器加溫。因使用了較少的血液（5 mL）進(jìn)行模擬實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中使用注射泵控制血液流速為5 mL/min以最大限度模擬實(shí)際狀態(tài)。首先使用20 mL注射器吸取15 mL空氣，然后吸取5 mL冷藏血液，之后迅速與加溫器連接，注射泵和注射器口朝下垂直放置，保證血液先進(jìn)入加溫器，最后通過(guò)注射器內(nèi)預(yù)先吸入的空氣推動(dòng)血液流出加溫器，檢測(cè)加溫后的血液質(zhì)量。全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀檢測(cè)血常規(guī)各項(xiàng)指標(biāo)，pH值采用微量pH計(jì)測(cè)定，生化指標(biāo)Na+（鈉離子）/K+（鉀離子）/GLU（葡萄糖）/LDH（乳酸脫氫酶）由全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)，瑞式染色后鏡下觀察紅細(xì)胞形態(tài)，按照游離血紅蛋白檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定細(xì)胞中FHb（游離血紅蛋白）含量，紅細(xì)胞表面PS（磷脂酰絲氨酸）暴露和CD47表達(dá)使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，凝血四項(xiàng)采用全自動(dòng)凝血測(cè)試儀檢測(cè)，TEG（血栓彈力圖）使用血栓彈力圖儀檢測(cè)。全血和懸浮紅細(xì)胞質(zhì)量評(píng)價(jià)檢測(cè)指標(biāo)如圖2所示。

圖2 全血和懸浮紅細(xì)胞質(zhì)量評(píng)價(jià)檢測(cè)指標(biāo)

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 9統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，血常規(guī)、生化指標(biāo)和凝血相關(guān)指標(biāo)等計(jì)量資料以±s表示。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用配對(duì)t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 輸血速度與加溫溫度測(cè)試結(jié)果 在加溫器研發(fā)階段，我們對(duì)不同的輸血速度下加溫后血液溫度進(jìn)行了測(cè)試，結(jié)果如表1所示。本試驗(yàn)中的血液流速我們?cè)O(shè)置為5 mL/min，需要說(shuō)明的是大量失血傷員的急救輸血，其流速有時(shí)候可能會(huì)達(dá)到30～60 mL/min甚至更高，以快速的恢復(fù)傷員的血容量。但是我們?cè)O(shè)計(jì)的無(wú)源輸血加溫器，加溫管路長(zhǎng)度固定，發(fā)熱液溫度恒定，因此流速與加溫時(shí)間和加溫后血液的溫度成反比，即流速越慢單位體積血液加溫時(shí)間越長(zhǎng)，加溫后血液的溫度越高。因此在本研究中選擇了臨床輸血治療推薦的相對(duì)較慢的輸血速度5 mL/min進(jìn)行試驗(yàn)。

表1 輸血速度與加溫溫度測(cè)試結(jié)果

2 溶血率及血常規(guī)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果 如圖3和表2所示，全血加溫后游離血紅蛋白（FHb）、溶血率、RBC計(jì)數(shù)、PLT計(jì)數(shù)、HGB含量及HCT均無(wú)明顯變化，血常規(guī)各項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果之間的前后差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；WBC計(jì)數(shù)減少，從（6.17±2.44）×109/L降低至（5.87±2.49）×109/L，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.333，P＜0.05）。懸浮紅細(xì)胞加溫后FHb濃度升高，從（386.40±78.87）mg/L升高至（431.67±84.92）mg/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.817，P＜0.001）；溶血率升高，從（0.39±0.08）%升高至（0.43±0.08）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.828，P＜0.05），但在國(guó)標(biāo)允許的范圍內(nèi)；RBC計(jì)數(shù)升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，HGB含量增加，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，HCT值升高，差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明加溫前后對(duì)懸浮紅細(xì)胞血液成分無(wú)明顯影響。

圖3 全血和懸浮紅細(xì)胞加溫前后溶血率變化

表2 全血和懸浮紅細(xì)胞加溫前后血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果（±s）

3 生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果 如圖4所示，全血及懸浮紅細(xì)胞加溫前后pH值無(wú)明顯變化。如表3所示，觀察加溫后各項(xiàng)生化指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，全血Na+、GLU、LDH及懸浮紅細(xì)胞Na+、K+、GLU加溫前后變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。全血加溫后K+濃度升高，從（3.41±0.27）mmol/L升高至（3.61±0.26）mmol/L，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.468，P＜0.001）；懸浮紅細(xì)胞加溫后LDH濃度升高，從（185.56±32.00）U/L升高至（198.77±32.19）U/L，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.643，P＜0.01）。

圖4 全血和懸浮紅細(xì)胞加溫前后pH變化

表3 全血和懸浮紅細(xì)胞加溫前后生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果（ ±s）

4 紅細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 如圖5所示，全血加溫后，MCV（平均紅細(xì)胞體積）、RDW（紅細(xì)胞分布寬度）、MPV（平均血小板體積）、PDW（血小板分布寬度）均無(wú)明顯改變。全血和懸浮紅細(xì)胞加溫前后取血液進(jìn)行常規(guī)涂片，瑞式染色后在顯微鏡高倍視野和油鏡下觀察其紅細(xì)胞、血小板形態(tài)，結(jié)果顯示加溫前后紅細(xì)胞、血小板形態(tài)完整，其中存在極少數(shù)變形的紅細(xì)胞，這些結(jié)果均顯示無(wú)源輸血加溫器不會(huì)引起明顯的紅細(xì)胞破壞，對(duì)血液中有形成分的影響很小。

圖5 全血和懸浮紅細(xì)胞加溫前后形態(tài)學(xué)指標(biāo)變化

5 膜損傷指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果 如圖6所示，全血及懸浮紅細(xì)胞加溫前后PS暴露和CD47分子表達(dá)平均熒光強(qiáng)度雖略有改變，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖6 全血和懸浮紅細(xì)胞加溫前后PS、CD47變化

6 凝血功能相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果 表4為全血加溫后凝血功能相關(guān)指標(biāo)變化情況。由表可見(jiàn)，MA值從（59.34±4.19）min升高至（65.19±3.51）min，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.961，P＜0.01）；而其余指標(biāo)加溫前后均無(wú)明顯變化。

表4 全血血栓彈力圖和凝血四項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果（±s）

討 論

加溫輸血在戰(zhàn)爭(zhēng)現(xiàn)場(chǎng)大量失血傷員救治中具有重要意義。大量快速輸血前，通常建議將血液制品復(fù)溫后再回輸，血液復(fù)溫能夠增強(qiáng)其流動(dòng)性，有利于灌注，還可以避免大量冷藏庫(kù)存血輸入后引起受者低體溫而誘發(fā)嚴(yán)重的不良反應(yīng)[11]?？梢允褂脤?zhuān)用的設(shè)備或者是在溫水進(jìn)行血液復(fù)溫，水溫一般控制在37℃左右，以免過(guò)熱造成紅細(xì)胞損傷而引起急性溶血反應(yīng)。本研究中我們使用的輸血加溫器，其加溫原理為四水合硝酸鈣過(guò)冷液體凝固放熱，四水合硝酸鈣的熔點(diǎn)為40℃，根據(jù)不同的血液流速需要，其加熱溫度介于33.67℃～40.20℃，在此條件下我們?cè)u(píng)價(jià)了全血和懸浮紅細(xì)胞經(jīng)無(wú)源輸血加溫器加溫后其溶血率、生化指標(biāo)、膜損傷及凝血功能相關(guān)指標(biāo)的變化。

研究發(fā)現(xiàn)，首先全血加溫后K+濃度略有升高，但FHb和溶血率均無(wú)明顯改變。通常血液制品儲(chǔ)存過(guò)程中陽(yáng)離子泄露是由于紅細(xì)胞破壞或通透性增加，導(dǎo)致胞內(nèi)K+外流，血漿中K+濃度升高，因此在紅細(xì)胞儲(chǔ)存損傷的研究中一般K+濃度增加與溶血顯著相關(guān)。那加溫為什么溶血率沒(méi)有變化而K+濃度升高呢？結(jié)合血常規(guī)中白細(xì)胞數(shù)目降低，作者認(rèn)為可能是白細(xì)胞對(duì)溫度敏感性較高，導(dǎo)致白細(xì)胞破壞或通透性增加，引起的胞內(nèi)鉀離子外流及血常規(guī)計(jì)數(shù)減少，全血中紅細(xì)胞K+濃度變化的差異也可以得到解釋。MA值升高，MA是TEG圖上的最大振幅，即最大切應(yīng)力系數(shù)，反映正在形成的血凝塊的最大強(qiáng)度及血凝塊形成的穩(wěn)定性，正常值為50～70 min，MA主要受纖維蛋白原及血小板兩個(gè)因素的影響，其中血小板的作用（約占80%）要比纖維蛋白原（約占20%）大，加溫后MA值升高，但血小板其他相關(guān)指標(biāo)均無(wú)明顯變化，說(shuō)明加溫對(duì)血小板功能的影響在可接受的正常范圍內(nèi)[12]，禤健蓉等[13]研究了升溫對(duì)血小板功能的影響，研究表明體外41℃加溫10 min對(duì)血小板含量和TEG-MA均無(wú)明顯影響，與我們的結(jié)論相一致。其次，懸浮紅細(xì)胞是全血經(jīng)離心移除大部分血漿后加入紅細(xì)胞保存液制成，而紅細(xì)胞保存液和殘留的血漿對(duì)熱有一定的緩沖能力，加溫后，其紅細(xì)胞計(jì)數(shù)，血紅蛋白濃度，紅細(xì)胞壓積略有升高，其值依舊在正常范圍內(nèi)，且差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；游離血紅蛋白和溶血率升高，但仍在國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的游離血紅蛋白≤0.72 g/L，溶血率＜紅細(xì)胞總量的0.8%范圍內(nèi)。

基于過(guò)冷液體凝固放熱的無(wú)源輸血加溫器造成紅細(xì)胞損傷的可能機(jī)制主要表現(xiàn)在以下幾方面：首先是溫度因素，在加溫過(guò)程中，熱量在細(xì)胞內(nèi)積累、擴(kuò)散，超出紅細(xì)胞的熱平衡和熱耐受限度，造成膜通透性增加，THOMAS G PODER等[14]對(duì)血液加溫與溶血關(guān)系進(jìn)行分析，分析結(jié)果表明溫度≤43℃時(shí)，溫度對(duì)紅細(xì)胞溶血的影響極低，而我們?cè)O(shè)計(jì)的加溫器工作溫度為40℃，結(jié)合以上研究結(jié)果，此溫度下對(duì)紅細(xì)胞質(zhì)量影響較?。黄浯问菣C(jī)械力因素，加溫過(guò)程中血液快速通過(guò)加溫輸血管路，途徑輸血管內(nèi)部流場(chǎng)環(huán)境及細(xì)口徑輸血針頭時(shí)，紅細(xì)胞會(huì)受到外力沖擊及管壁的摩擦力造成溶血，但馬印圖等[15]研究中血液流速為80 mL/min，對(duì)紅細(xì)胞數(shù)量、形態(tài)、溶血率及游離血紅蛋白幾乎沒(méi)有影響，因此本研究中采用臨床最小流速來(lái)最大化溫度對(duì)血液質(zhì)量的影響；最后與紅細(xì)胞年齡有關(guān)，在新鮮采集的血液中，也存在年輕紅細(xì)胞和衰老紅細(xì)胞，加溫過(guò)程中衰老紅細(xì)胞更容易受到熱損傷和機(jī)械應(yīng)力破壞，溶血率升高。

總結(jié)本研究的結(jié)果，全血短暫加溫后，其血液質(zhì)量無(wú)明顯變化；懸浮紅細(xì)胞短暫加溫后，其質(zhì)量相關(guān)指標(biāo)雖略有變化，但仍在正常范圍內(nèi)。全血和懸浮紅細(xì)胞經(jīng)無(wú)源輸血加溫器加溫后，游離血紅蛋白、溶血率等相關(guān)指標(biāo)符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)“全血及成分血質(zhì)量要求GB18469-2012”[16]。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突