高珍琦，謝娜婷，陳丹丹，李珊穎，李增富,2

（1.三明學院 資源與化工學院，福建 三明 365004；2.藥物植物開發(fā)利用福建省高校工程研究中心，福建 三明 365004）

馬齒莧（Portulaca oleracea），又名馬莧菜，石竹目、馬齒莧科的一年生草本植物。肉質葉對生，扁平多汁，形狀類似馬齒，上下兩面顏色區(qū)別明顯，上面暗沉下面鮮艷；葉柄較其他部位略粗壯。我國馬齒莧分布廣泛，資源十分豐富[1]。大量研究表明，馬齒莧含有黃酮類化合物、多糖、多酚等許多活性物質[2]，具有止痛、抗炎[3]、抗菌[4-7]和抗氧化[8,9]等多種功能[10-15]，是中國衛(wèi)生部劃定的101種藥食同源野生植物之一，曾經(jīng)被列入2008年北京奧運會的菜譜[1]。

目前馬齒莧黃酮的提取方法有多種，常見的主要有溶劑提取法[16]、超聲波輔助提取法[17]、微波輔助提取法[18]和酶解法等[19]。其中加熱回流水提法提取率高、綠色環(huán)保?；邳S酮類化合物在水中有一定的溶解性[20]，本研究采用加熱回流法[21]提取馬齒莧中的總黃酮，以馬齒莧總黃酮提取率為參考指標，優(yōu)化提取的工藝條件并進行驗證，探究馬齒莧總黃酮的抗氧化能力，以期為馬齒莧資源利用和功能性產(chǎn)品開發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬齒莧（Portulaca oleracea），野生鮮品，購自福建三明市三元區(qū)。蘆丁標準品，中國藥品生物制品檢定所。1,1-二苯基-2-苦基肼（DDPH），上海士鋒生物科技有限公司。

亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、無水乙醇等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

FW80 型高速萬能粉碎機，天津泰斯特；恒溫水浴鍋，江蘇金壇；干燥箱，上海一恒；722s分光光度計，上海儀電。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準曲線的制備

稱取蘆丁對照品10 mg，用體積分數(shù)70%的乙醇溶解并定容到100 mL的容量瓶中，搖勻，得到0.1 mg/mL的標準溶液。

分別取標準溶液0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL7組溶液置于10 mL容量瓶中，然后分別加入0.30 mL質量分數(shù)5%亞硝酸鈉（NaNO2）溶液混勻，放置6 min后，加入0.30 mL質量分數(shù)10%硝酸鋁Al(NO3)3溶液，混勻，放置6 min，最后加入4 mL質量分數(shù)4%NaOH溶液，充分混勻后使用70%的乙醇溶液定容至10 mL，室溫放置15 min。以不加標準液的溶液為空白參比，在510 nm處測定每個濃度標準品溶液的吸光度，繪制蘆丁標準曲線（圖1），獲得蘆丁的標準曲線，回歸方程為y=1.06x+0.0006，相關系數(shù)R2=0.9991表明存在良好的線性關系。

圖1 蘆丁標準曲線

1.3.2 馬齒莧粉的制備

將新鮮馬齒莧洗凈，處理掉馬齒莧根部并將其折成小段以利于烘干，置于烘箱中65 ℃干燥3～4 d，取出干燥的馬齒莧利用高速粉碎機粉碎2～3次，最后過孔徑60目篩成干粉常溫密封儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 單因素試驗

準確稱取2.0000 g馬齒莧樣品粉末，對料液比1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40，水浴溫度60、70、80、90、100 ℃，乙醇濃度50%、60%、70%、80%、90%以及提取時間50、60、70、80、90 min進行優(yōu)化，以每個單因素對馬齒莧總黃酮提取率的影響來確定各因素的最適值。

1.3.4 正交試驗及驗證

根據(jù)單因素結果，設計四因素三水平的正交實驗，對加熱回流提取馬齒莧總黃酮的工藝進行優(yōu)化，并做驗證實驗。

1.3.5 黃酮提取液的抗氧化活性

根據(jù)參考文獻[20]的方法進行測定，配制120 umol/LDPPH乙醇溶液。稱取44 mgDPPH，無水乙醇定容至100 mL，0～5 ℃避光保存。取3 mL、120 umol/LDPPH溶液加入0.1 mL 不同濃度的馬齒莧黃酮提取物溶液于試管，充分混合，黑暗條件下靜置30 min，在 517 nm波長處測定其吸光度 Ai；以等體積無水乙醇代替馬齒莧黃酮提取物溶液，在相同條件下測定其吸光度 A0；以等體積無水乙醇代替DPPH溶液在同條件下測定其吸光度At；以VC為陽性對照組，實驗重復3次，按照公式⑴計算 DPPH自由基清除率。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 料液比對總黃酮提取率的影響

設定加熱回流馬齒莧總黃酮提取的提取時間為60 min，乙醇濃度80%，水浴溫度90 ℃，控制料液比1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40加熱回流提取2次，并分別通過對照空白組測定吸光度，測定分析計算總黃酮的提取率，結果見圖2。

圖2 料液比對馬齒莧總黃酮提取率的影響

由圖2可知，當料液比在1∶20～1∶40之間時，利用加熱回流法得到馬齒莧總黃酮提取率隨著溶劑的量呈現(xiàn)上升的趨勢，總黃酮提取率最高為5.01 mg/g，此時料液比為1∶30，之后馬齒莧總黃酮的提取率開始呈現(xiàn)出穩(wěn)定的趨勢，由圖可見隨著總黃酮提取率的上升達到一個峰值后，樣品表面的總黃酮濃度與提取液達到平衡狀態(tài)，故其他條件相同的條件下料液比為1∶30最優(yōu)。

2.1.2 水浴溫度對總黃酮提取率的影響

設定其余外界條件相同，利用恒溫水浴鍋加熱回流提取的料液比1∶30、提取時間60 min、乙醇濃度80%，控制其水浴溫度60、70、80、90、100 ℃，加熱回流提取2次，并分別通過對照空白組測定吸光度，測定分析計算總黃酮的提取率，結果見圖3。

圖3 水浴溫度對馬齒莧總黃酮提取率的影響

由圖3可知，當水浴溫度在60～100 ℃之間，利用加熱回流法得到馬齒莧總黃酮提取率隨著溫度的升高而增大，隨后再升高溫度提取率又降低。水浴溫度為90 ℃時總黃酮提取率最高，為5.01 mg/g，說明溫度的升高有助于溶劑滲透到組織細胞中，幫助提取率提高，當溫度超過90 ℃的時候，溫度太高導致黃酮類化合物結構受損而迅速降低了提取率，所以其他條件相同的條件下水浴溫度為90 ℃為最優(yōu)。

2.1.3 乙醇濃度對總黃酮提取率的影響

設定料液比1∶30，提取時間60 min，水浴溫度90 ℃，控制乙醇濃度為50%、60%、70%、80%、90%加熱回流提取2次，并分別通過對照空白組測定吸光度，測定分析計算總黃酮的提取率，結果見圖4。

圖4 乙醇濃度對馬齒莧總黃酮提取率的影響

由圖4可知，當乙醇濃度為50～90%，利用加熱回流法得到馬齒莧總黃酮提取率隨著乙醇濃度的升高而增大，乙醇濃度低于70%時，乙醇濃度升高總黃酮提取率隨之增加，乙醇濃度為70%時總黃酮提取率最高，為5.23 mg/g，乙醇濃度大于70%之后總黃酮提取率反而開始降低，這說明乙醇濃度影響原料中總黃酮與溶劑中黃酮相互滲透而導致總黃酮提取率上升后下降，因此其他條件相同的情況下乙醇濃度為70%時有最優(yōu)的黃酮提取率。

2.1.4 加熱時間對總黃酮提取率的影響

設定其他條件相同，料液比1∶30，乙醇濃度70%，水浴溫度90 ℃，加熱時間分別為50、60、70、80、90 min，加熱回流提取2次并分別通過對照空白組測定吸光度，測定分析計算總黃酮的提取率，結果見圖5。

圖5 加熱時間對馬齒莧總黃酮提取率的影響

由圖5可知，加熱時間50～90 min時，加熱時間為70 min的時候有最高的總黃酮提取率為5.33 mg/g，利用加熱回流得到總黃酮提取率隨著加熱時間增加迅速上升后略微降低并逐漸平穩(wěn)，這是因為加熱時間未到70 min的時候，溶劑還沒有與組織細胞充分滲透，當時間超過70 min，樣品中總黃酮與溶劑中總黃酮濃度基本趨于平衡，提取率達到穩(wěn)定狀態(tài)，所以其他條件相同的情況下選擇加熱時間為70 min為最佳。

2.2 正交試驗及驗證

在單因素試驗中選擇提取率最優(yōu)條件的3個水平，采用4因素3水平正交試驗（表1），考察料液比、水浴溫度、乙醇濃度和加熱時間對馬齒莧總黃酮提取率的影響，獲得一組總黃酮提取率最高的條件，結果見表2。

表1 因素水平表

表2 正交試驗結果與分析

由表2可知，4個因素對馬齒莧總黃酮提取率影響度從大到小是：水浴溫度＞加熱時間＞乙醇濃度＞料液比，最優(yōu)工藝為A2B2C3D2，即料液比為1∶30、加熱時間為70 min、乙醇濃度為80%、水浴溫度90 ℃時，加熱回流馬齒莧總黃酮提取率最高。

采用優(yōu)化工藝條件開展驗證試驗，得到的馬齒莧總黃酮提取率為5.513 mg/g，符合正交試驗得出的結果。

2.3 黃酮提取液的抗氧化活性評價

分別設置6組實驗，考察馬齒莧提取物和VC對DDPH自由基的清除率的影響，結果見圖6。

圖6 馬齒莧總黃酮和Vc對DPPH清除率比較

由圖6可知，馬齒莧總黃酮提取液對DDPH自由基的清除效果略低于Vc，當溶液濃度升高，對DPPH的清除效果越強，馬齒莧黃酮提取液具有較好的抗氧化活性。

3 結論

本研究通過單因素實驗和正交實驗得到最優(yōu)馬齒莧黃酮提取工藝為：料液比1∶30，加熱時間70 min，乙醇濃度80%，水浴溫度90 ℃，在此條件下馬齒莧總黃酮提取率為5.513 mg/g。馬齒莧總黃酮提取液對DPPH自由基具有較好的清除效果。