林自立，王 瑀，陳 露，陳 六，張亞光，王權(quán)勝

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，廣西 南寧 530001；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院男性科，廣西 南寧 530023）

少弱精子癥為引起男性不育的重要因素之一。前期臨床研究治療少弱精子癥患者，選用續(xù)斷種子方，具有良好的療效［1］。相關(guān)研究認(rèn)為，少弱精子癥發(fā)病機(jī)制與氧化應(yīng)激密切相關(guān)［2］。核因子紅細(xì)胞相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid like 2，Nrf2）啟動(dòng)下游抗氧化酶的醌氧化還原酶‐1（NQO1）、γ‐谷氨酰 半 胱 氨 酸 合 成 酶（γ‐glutamylcysteinesynthetase，γ‐GCS），從而發(fā)揮抗氧化作用，穩(wěn)定精子內(nèi)環(huán)境［3，4］。前期基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究證明了續(xù)斷種子方可以通過調(diào)控機(jī)體抗氧化酶活性，提高生精細(xì)胞拮抗氧化應(yīng)激能力，提高精子質(zhì)量［5］。續(xù)斷種子方能否通過Nrf2‐NQO1/γ‐GCS 信號(hào)通路減輕少弱精子癥大鼠氧化應(yīng)激損傷，從而提高精子質(zhì)量，目前尚未見研究報(bào)道。立足上述研究基礎(chǔ)，本實(shí)驗(yàn)建立少弱精子癥模型大鼠，研究續(xù)斷種子方在治療少弱精子癥模型大鼠過程中對(duì)Nrf2、NQO1、γ‐GCS 相關(guān)蛋白的影響，旨在進(jìn)一步探究續(xù)斷種子方改善模型大鼠附睪氧化損傷的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SD 大鼠40 只［購(gòu)自長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（湘）2019‐0014］，年齡為6～8 周，體質(zhì)量200～220 g?；\飼養(yǎng)于動(dòng)物房，自由飲食、自由飲水、每隔3 d 更換每籠木屑?jí)|料。飼養(yǎng)環(huán)境：室內(nèi)溫度維持19～25 ℃，濕度維持55%～65%。本實(shí)驗(yàn)通過廣西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

石蠟包埋機(jī)（德國(guó)Leica 公司）；臺(tái)式冷凍離心機(jī)（Eppendorf 公司）；半自動(dòng)輪轉(zhuǎn)切片機(jī)（英國(guó)Ther‐mo Shandon 公司）；病理組織烤片機(jī)（常州市郝思琳醫(yī)用儀器有限公司）；光學(xué)生物顯微鏡（ympus 公司）；精子計(jì)數(shù)板與彩色精子質(zhì)量檢測(cè)系統(tǒng)（北京偉力有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

動(dòng)物組織總RNA 提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix、HiScript II Q RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）（南京諾唯贊生物科技有限公司）；Nrf2 抗體購(gòu)自Affinity 公司（批號(hào)：AF0639）、NQO1 抗 體 購(gòu) 自Affinity 公 司（批 號(hào)：DF6437）；γ‐GCS 抗體購(gòu)自Affinity 公司（批號(hào)：DF8550）。

1.4 實(shí)驗(yàn)藥物

續(xù)斷種子方顆粒由江陰天江藥業(yè)有限公司制備，藥物組成：菟絲子、杜仲、續(xù)斷、牛膝、骨碎補(bǔ)、女貞子、枸杞子、黨參、白術(shù)、淮山藥各15 mg 組成，采用中藥配方顆粒劑（藥品許可證號(hào)：1203002）；左卡尼汀口服溶液10 mL：1 g（東北制藥總廠生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字H19990372）；環(huán)磷酰胺粉針劑（Baxter 公司，進(jìn)口藥品注冊(cè)證號(hào)：H20160467）。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 動(dòng)物分組與造模 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，按隨機(jī)原則分為空白組、模型組、續(xù)斷種子方組、左卡尼汀組，每組各10 只，除空白組外，余下3 組誘導(dǎo)為少弱精子癥模型，方法為：將環(huán)磷酰胺以生理鹽水配置成3.5 g/L 溶液，予腹腔注射，注射劑量為0.035 mg·g‐1·d‐1，持續(xù)注射7 d。

1.5.2 給藥方法 造模驗(yàn)證成功后開始藥物干預(yù)治療，續(xù)斷種子方組給予10 g/kg 續(xù)斷種子方溶液灌胃，左卡尼汀組給予左卡尼汀口服溶液0.1 g/kg灌胃。1 次/日，時(shí)間連續(xù)8 周。

1.5.3 標(biāo)本制作及檢測(cè)附睪精子質(zhì)量 斷頸處死大鼠，迅速開腹摘取雙側(cè)附睪組織，放置于添加10 mL 生理鹽水中將其剪碎，37 ℃恒溫水孵育5 min，搖晃，使精子游離出來，運(yùn)用精子計(jì)數(shù)板中，運(yùn)用自動(dòng)精子分析儀（Computerassisted sperm analysis，CASA）進(jìn)行檢測(cè)精子濃度、精子活率。

1.5.4 蘇木素‐伊紅染色法染色（Hematoxylin Eo‐sin，HE）觀察附睪顯微結(jié)構(gòu) 4%多聚甲醛固定附睪組織；乙醇脫水；二甲苯進(jìn)行透明；包埋，切片，HE 染色法染色，光鏡下觀察附睪組織改變。

1.5.5 RT‐QPCR 檢 測(cè) 附 睪 組 織 中Nrf2、NQO1、γ‐GCS mRNA 表達(dá) 取勻漿后的附睪組織，使用Trizol 法提取總RNA，檢測(cè)RNA 濃度和純度，調(diào)整RNA 濃度至1 μg，并按說明書逆轉(zhuǎn)錄cDNA。在體系 中 加 入 引 物（表1）和SYBR‐Green 試 劑，于Roche‐LightCycler‐480 型 實(shí) 時(shí) 熒 光 定 量PCR 儀 上，以三步法對(duì)cDNA 進(jìn)行擴(kuò)增，通過ΔΔCT=（目的基因CT?目的內(nèi)參基因CT）?（空白基因CT?空白內(nèi)參基因CT），計(jì)算各組2‐ΔΔCT，即得各組信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA）表達(dá)與對(duì)照組mRNA 的倍數(shù)。引物序列見表1。

表1 RT?qPCR 的特異性引物序列Tab 1 RT?qPCR specific primer sequence

1.5.6 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)附睪組織中Nrf2、NQO1、γ‐GCS 蛋白表達(dá) 取附睪組織進(jìn)行常規(guī)制備石蠟切片，以免疫組化法檢測(cè)各組大鼠Nrf2、NQO1、γ‐GCS 蛋 白 表 達(dá)。光 鏡 下 觀 察 各 組Nrf2、NQO1、γ‐GCS 蛋白表達(dá)情況。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 分組造模結(jié)果

造模后各組大鼠均出現(xiàn)活動(dòng)減弱、不同程度的飲水和進(jìn)食減少，體重下降，毛發(fā)干枯，自主活動(dòng)頻率減少，反應(yīng)遲緩等癥狀，藥物干預(yù)后1 周后上述情況逐漸好轉(zhuǎn)。在造模中左卡尼汀組、模型組、續(xù)斷種子方組均出現(xiàn)死亡，死亡因素考慮為：因劑量及體重計(jì)算不夠精確出現(xiàn)死亡2 只（模型組1 只、左卡尼汀片組1 只），灌胃過程中因食管血管破裂、刺破胃等原因致只大鼠死亡1 只（續(xù)斷種子方組1 只）。所以最終大鼠數(shù)量為37 只。

2.2 各組大鼠精液質(zhì)量比較

精子密度和精子活動(dòng)率：相較于空白組，其余組精子密度、活動(dòng)率均明顯降低（P<0.05），模型組精子密度、活動(dòng)率明顯降低（P<0.05）；與模型組比較，續(xù)斷種子方組和左卡尼汀組精子密度和活動(dòng)率均明顯升高（P<0.05）。見表2。

表2 各組大鼠精液質(zhì)量比較（±s）Tab 2 Semen quality comparison of rats in each group（xˉ± s）

表2 各組大鼠精液質(zhì)量比較（±s）Tab 2 Semen quality comparison of rats in each group（xˉ± s）

組別空白組模型組續(xù)斷種子方組左卡尼汀組n 10 9 9 9 FP精子濃度（×106/mL）51.47±3.13 11.49±1.39 34.42±3.45 33.00±3.45 269.331 0.000活動(dòng)率（%）63.15±2.12 20.65±1.86 41.13±2.33 35.32±1.60 743.531 0.000

2.3 大鼠附睪組織病理形態(tài)改變

視野內(nèi)可見空白組附睪管排列緊密規(guī)則，組織結(jié)構(gòu)完整，上皮細(xì)胞排列規(guī)整，管腔精子數(shù)目多，分布均勻。模型組附睪組管腔織出現(xiàn)結(jié)構(gòu)萎縮，排列疏松，間質(zhì)變大，細(xì)胞碎片增多，精子細(xì)胞明顯減少。續(xù)斷種子方組、左卡尼汀組與模型組相比，附睪管腔病變具有顯著改善，腔內(nèi)正常精子量增多，分布均勻，見圖1。

圖1 各組附睪病理結(jié)果Fig 1 Pathological results of epididymis in each group

2.4 各 組 大 鼠 附 睪 組 織 中Nrf2、NQO1、γ‐GCS mRNA 表達(dá)比較

實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real‐time fluores‐cent quantitative polymerase chain reaction，RT‐qPCR）結(jié)果顯示，相較于空白組，模型組大鼠附睪Nrf2、NQO1、γ‐GCS mRNA 表達(dá)明顯降低（P<0.05），與模型相比，續(xù)斷種子方組、左卡尼汀組Nrf2、NQO1、γ‐GCS mRNA 表 達(dá) 明 顯 升 高（P<0.05），見表3。

表3 各組大鼠附睪Nrf2、NQO1、γ?GCSmRNA 相對(duì)表達(dá)量的比較（±s）Tab 3 Comparison of relative expression of NRF2，NQO1，γ?GCS mRNA in epididymis of rats in each group（±s）

表3 各組大鼠附睪Nrf2、NQO1、γ?GCSmRNA 相對(duì)表達(dá)量的比較（±s）Tab 3 Comparison of relative expression of NRF2，NQO1，γ?GCS mRNA in epididymis of rats in each group（±s）

組別空白組模型組續(xù)斷種子方組左卡尼汀組n 10 9 9 9 FP基因相對(duì)表達(dá)量Nrf2 1.00 0.66±0.05 0.85±0.03 0.90±0.03 56.849 0.000 NQO1 1.00 0.72±0.06 0.83±0.05 0.86±0.05 13.981 0.002 γ‐GCS 1.00 0.67±0.05 0.82±0.04 0.87±0.07 46.312 0.000

2.5 各組大鼠附睪組織Nrf2、NQO1、γ‐GCS 蛋白表達(dá)比較

各組大鼠附睪組織Nrf2、NQO1、γ‐GCS 免疫組化法顯示，模型組Nrf2、NQO1、γ‐GCS 免疫組化棕黃色陽(yáng)性表達(dá)低（圖2B、3B、4B）；續(xù)斷種子方組、左卡尼汀組Nrf2、NQO1、γ‐GCS 免疫組化中棕黃色陽(yáng)性表達(dá)明顯較高（圖2C、2D；圖3C、3D；圖4C、4D），空白組Nrf2、NQO1、γ‐GCS 免疫組化中棕黃色陽(yáng)性表達(dá)最高（圖2A、3A、4A）。

圖2 各組大鼠附睪組織Nrf2 蛋白表達(dá)（IHC × 200）Fig 2 Expression of Nrf2 protein in epididymis of rats in each group（IHC × 200）

3 討論

少弱精子癥目前引起男性不育的中重要因素之一，少弱精癥的發(fā)生有多種原因，例如：氧化應(yīng)激、生殖道感染、精索靜脈畸形擴(kuò)張與彎曲等，各因素相互影響，致使少弱精子癥的發(fā)生［6］。目前研究認(rèn)為，少弱精子癥發(fā)病機(jī)制與氧化應(yīng)激損傷緊密相關(guān)［2］。原因?yàn)榫淤|(zhì)膜上雙鍵的不飽和脂肪酸受到活性氧（ROS）侵犯，精子質(zhì)膜過氧化損傷，導(dǎo)致精子的活動(dòng)能力下降。同時(shí)還破壞線粒體的內(nèi)外膜，激活相關(guān)凋亡蛋白而導(dǎo)致精子死亡［7，8］。

少弱精子癥將其歸屬為中醫(yī)“精冷”“精少”“精濁”等相關(guān)范疇。近些年來，諸多學(xué)者根據(jù)中醫(yī)“腎藏精”、為“先天之本”的理論，認(rèn)為腎虛為本病主要的病因病機(jī)，與肝郁與脾虛相關(guān)；基于課題組對(duì)文獻(xiàn)研究與臨床實(shí)踐，以為本病主要病因病機(jī)為“營(yíng)氣不從，腎精虧虛，營(yíng)氣不從”，營(yíng)氣不從可理解為附睪部分氣血缺乏，腎主生殖，主藏精，腎脾在精血生成方面相互為用，脾主運(yùn)化，攝取谷食中精微物質(zhì)并化營(yíng)生血，先后天互為滋養(yǎng)，脾臟健運(yùn)，腎精充盈，脾腎共同所化精血提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，若脾失運(yùn)化，則營(yíng)氣不從，氣血不足，導(dǎo)致營(yíng)衛(wèi)失和，附睪組織血管供養(yǎng)血液及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)作用失調(diào)，導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)失充，精子無法成熟；若腎精虧虛，則氣血郁滯，經(jīng)絡(luò)阻塞，精絡(luò)不暢，輸送營(yíng)養(yǎng)道路受阻，精子活力降低，最終導(dǎo)致精子行走通道不通則不育。則治當(dāng)以補(bǔ)腎健脾為法，佐以活血生精的續(xù)斷種子方，此方源自岳甫嘉《醫(yī)學(xué)正印·卷上》：“固腎健脾生精種子奇方”，岳甫嘉認(rèn)為脾的運(yùn)化功能為男性出生后營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)主要來源，若氣血充盈，則腎精滿溢，生精種子源源不絕，此方為生精最快，加之節(jié)制欲望，得子更易。方中菟絲子、枸杞子、女貞子、山藥、白術(shù)、黨參以補(bǔ)氣健脾，益腎生精；杜仲、續(xù)斷、骨碎補(bǔ)以補(bǔ)腎生精，活血通絡(luò)；諸藥合用具有健脾益腎、活血生精之功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)證實(shí)該方中主要藥物的菟絲子與枸杞子成分含有總黃酮［9，10］、女貞子中含有齊墩果酸［11］、續(xù)斷成分含皂苷類［12］、杜仲多糖［13］具有抗氧化、清除自由基、提升氧氣利用率等作用。

近些年來研究發(fā)現(xiàn)生殖系統(tǒng)過氧化，即氧化應(yīng)激成為男性不孕不育的共同特征［14］。氧化應(yīng)激是因?yàn)轶w內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生和抗氧化能力的失衡而導(dǎo)致的［15］，其中ROS 為活性氧簇，其具有較高的活性，是衡量機(jī)體是否具有抗氧化能力的一個(gè)重要指標(biāo)之一［16］。Nrf2 通過激活抗氧化酶的轉(zhuǎn)錄從而維持氧化還原過程動(dòng)態(tài)平衡，為細(xì)胞內(nèi)調(diào)控氧化還原過程的重要轉(zhuǎn)錄因子［17］，具有抗凋亡［18］、維持細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)［19］、抗炎癥反應(yīng)［20］等功能。正常條件下，Nrf2 在細(xì)胞質(zhì)中通過與Kelch 樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān) 蛋 白1（Kelch‐like ECH‐associated protein1，Ke‐ap1）在細(xì)胞質(zhì)結(jié)合而失去活性，處于一種未激活穩(wěn)態(tài)，如果受外界氧化應(yīng)激情況下，Nrf2 不再處于穩(wěn)態(tài)，從而脫離至細(xì)胞核中，并與抗氧化元件（antioxi‐dant response elements，AREs）結(jié) 合，繼 而 調(diào) 控NQO1、γ‐GCS 等下游蛋白的表達(dá)，提升細(xì)胞抗氧化能力與降低氧化應(yīng)激損傷［21，22］。有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)通過激活Nrf2/ARE 信號(hào)通路，調(diào)控Nrf2 的下游靶基因NQO1 及γ‐GCS 等相關(guān)蛋白的表達(dá)，提高Nrf2、NQO1 及γ‐GCS 的蛋白的表達(dá)水平，提升機(jī)體抵抗能力，調(diào)控抗氧化機(jī)制作用，減輕生精障礙，改善精子活力［23，24］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：相較與空白組，其余組精子密度和精子活動(dòng)率均明顯降低（P<0.05），模型組精子密度、活動(dòng)率明顯降低（P<0.05），提示造模成功；與模型組比較，續(xù)斷種子方組和左卡尼汀組精子密度和活動(dòng)率均明顯升高（P<0.05），證明續(xù)斷種子方可以提高精子質(zhì)量。模型組NQO1、γ‐GCS相關(guān)水平明顯降低，與治療組與模型組比較，Nrf2、NQO1、γ‐GCS 相關(guān)水平明顯升高，提示續(xù)斷種子方可以減輕大鼠氧化應(yīng)激損傷。

綜上所述，續(xù)斷種子方能夠減輕大鼠氧化應(yīng)激損傷，提高少弱精子癥大鼠精子質(zhì)量，其作用機(jī)制可能是促進(jìn)少弱精子癥大鼠附睪組織Nrf2‐NQO1/γ‐GCS 信 號(hào) 通 路 活 化，上 調(diào)Nrf2、NQO1 和γ‐GCS蛋白表達(dá)相關(guān)。

作者貢獻(xiàn)度說明：

林自立：數(shù)據(jù)整理與分析，撰寫論文；王瑀：建立模型；陳露：建立模型、藥物干預(yù)；陳六：指標(biāo)檢測(cè)；張亞光：負(fù)責(zé)文章的校對(duì)、完善；王權(quán)勝：研究總負(fù)責(zé)人、指導(dǎo)教師。

作者之間沒有任何利益沖突。