劉雨芹，楊 瑩，魏有海，郭良芝，程 亮，郭青云

(青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院，青海省農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,青海 西寧 810016)

櫻桃(Prunusavium)又名含桃，其果實(shí)色澤鮮艷，營(yíng)養(yǎng)豐富，酸甜可口，成熟期早，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1]，近年來，在我國(guó)各省市得到大面積推廣栽培[2]，同時(shí)伴隨的病害問題也愈加凸顯。其中，葉斑病是世界范圍內(nèi)櫻桃產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生且比較嚴(yán)重的病害之一，直接影響櫻桃葉片的光合作用[3]，削弱樹勢(shì)，給果農(nóng)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[4]。目前，櫻桃葉斑病菌主要有Blumeriellajaapii[5-6]、Alternariaalternata[7]、Passaloracircumscissa[4]、Pseudocercosporapruni-persicicola[8]等。放線菌，尤其是鏈霉菌，存在于不同類型的土壤和水中，能夠產(chǎn)生多種抗菌活性的抗生素，已在生物防治上廣泛應(yīng)用[9-11]。瞿佳等[12]從核桃樹根際土壤中篩選出具有拮抗作用的暗藍(lán)色鏈霉菌(Streptomycescaeruleatus)WMF106菌株，其無菌發(fā)酵濾液原液對(duì)離體葉片上由野油菜黃單胞菌(Xanthomonascampestris)和成團(tuán)泛菌(Pantoeaagglomerans)造成的核桃黑斑病防治效果分別達(dá)到77.44%和58.33%。李志田等[13]研究發(fā)現(xiàn),分離自青海地區(qū)土壤中的渾圓鏈霉菌(Streptomycesglobosus)對(duì)桃細(xì)菌性穿孔病菌(Xanthomonasarboricola)和草莓炭疽病菌(Strawberryanthracnose)具有明顯的拮抗作用。劉俏等[14-15]在對(duì)青海地區(qū)的櫻桃葉斑病調(diào)查中發(fā)現(xiàn)其主要病原菌為鏈格孢菌屬(Alternariaspp.)和刺盤孢菌屬(Colletotrichumspp.)。其中，鏈格孢菌屬中的Alternariaalternata是引起青海櫻桃葉斑病的優(yōu)勢(shì)病原菌，其分離頻率達(dá)84.95%。目前，防治櫻桃葉斑病主要是依靠化學(xué)防治，但化學(xué)農(nóng)藥在抑制櫻桃葉斑病發(fā)生的同時(shí)，也存在防治效果不穩(wěn)定、農(nóng)藥殘留高及病害易復(fù)發(fā)等負(fù)面問題[15]。近年來，微生物菌劑因其綠色環(huán)保無污染等特性，受到廣泛關(guān)注，其中放線菌產(chǎn)生的多種天然抗生素已成為廣泛應(yīng)用的次級(jí)代謝產(chǎn)物[16-17]，并已在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用，但利用放線菌防治櫻桃葉斑病的研究仍然不足。因此，篩選拮抗櫻桃葉斑病病原菌的放線菌，對(duì)櫻桃葉斑病的生物防治具有重要意義。本研究從發(fā)病櫻桃根際土壤中篩選出具有高效拮抗櫻桃鏈格孢葉斑病菌的生防鏈霉菌株，為櫻桃葉斑病的生物防治方法提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試櫻桃葉斑病病原菌由青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所課題組分離、鑒定和保存。供試櫻桃品種為“薩米脫”；拮抗菌菌源土采自青海省海東市樂都區(qū)發(fā)病櫻桃根際土壤；供試拮抗菌菌株分離和發(fā)酵培養(yǎng)基分別為Gause′s No.1培養(yǎng)基和小米培養(yǎng)基，拮抗菌培養(yǎng)特征觀察培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基、Gao′s No.1培養(yǎng)基、Gao′s No.2培養(yǎng)基、OA培養(yǎng)基、Czapek-Dox培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基。配制方法參照文獻(xiàn)[15]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的分離 使用點(diǎn)取樣法，取青海省海東市樂都區(qū)發(fā)病櫻桃根際土壤，按土壤放線菌的標(biāo)準(zhǔn)方法分離放線菌。將土壤樣品自然風(fēng)干后混勻，將10 g土壤樣品和90 mL無菌水混勻后制備成土壤稀釋液，稀釋至10-1、10-2、10-3和10-4等不同梯度，分別涂布于Gause′s No.1培養(yǎng)基上，于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，根據(jù)不同個(gè)體菌落的菌絲形態(tài)生長(zhǎng)特點(diǎn)和其他菌絲生長(zhǎng)特性等，挑取不同的單菌落進(jìn)行純化。

1.2.2 生防放線菌菌株的初篩 采用瓊脂塊平板對(duì)峙培養(yǎng)法[12]，在PDA平板上接種供試的櫻桃葉斑病菌，在28 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，用直徑為5 mm的滅菌打孔器打取菌餅，用無菌接種針將菌餅接種于PDA平板中心，菌絲表面向下。采用同樣的方法將培養(yǎng)7 d的生防放線菌菌株，在櫻桃葉斑病菌菌餅四周均勻反貼4個(gè)待測(cè)放線菌菌餅，以僅接種櫻桃葉斑病菌的平板為對(duì)照，每種處理重復(fù)3次，于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察并記錄病原菌菌落直徑，7 d后計(jì)算抑菌率。

1.2.3 生防放線菌菌株無菌發(fā)酵液制備 將生防菌株接種于Gause′s No.1培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)7 d。從該平板取直徑為8 mm的圓形菌餅，放入300 mL三角瓶中，再裝入60 mL的小米液體培養(yǎng)基，放入溫度為28 ℃，220 r/min的攪拌搖床中振蕩培養(yǎng)5 d，發(fā)酵產(chǎn)物在10 000 r/min的離心機(jī)下離心10 min，得到了小米發(fā)酵濾液，然后經(jīng)無菌微孔濾膜(0.22 μm)過濾，放4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 生防放線菌菌株的復(fù)篩 采用生長(zhǎng)速率法，在培養(yǎng)皿中加入無菌發(fā)酵濾液1 mL，與冷卻至50 ℃左右的9 mL PDA培養(yǎng)基充分混勻后至凝固。用直徑為5 mm無菌打孔器打出櫻桃葉斑病菌菌餅，將其向下放置于平板的正中心，以無菌水與PDA制成的平板為對(duì)照，在28 ℃下培養(yǎng)，用十字交叉法測(cè)量培養(yǎng)7 d后的菌落直徑并計(jì)算抑菌率。

1.2.5 生防放線菌菌株的離體篩選 選取健康完整、葉齡相同的“薩米脫”櫻桃葉片，對(duì)其進(jìn)行消毒處理，然后放在滅菌濾紙上晾干，使用無菌昆蟲針在葉背主葉脈兩側(cè)針刺6個(gè)對(duì)稱的傷口，用移液器在傷口上滴加30 μL 1×105個(gè)/mL的櫻桃葉斑病菌孢子懸浮液，28 ℃下放置2 h自然晾干，于24 h和48 h后分別滴加30 μL 1×108cfu/mL的生防菌菌懸液和250 g/L嘧菌酯懸浮劑500倍液，以無菌水處理做對(duì)照，每個(gè)處理3片葉，3次重復(fù)，同樣晾干后置于培養(yǎng)皿中并保濕，在溫度28 ℃、相對(duì)濕度80%的條件下進(jìn)行12 h 6 000 lx光照，12 h黑暗培養(yǎng)。每天記錄櫻桃葉片的病斑直徑，7 d后計(jì)算抑菌率。

1.2.6 拮抗菌株的鑒定 在6種不同的培養(yǎng)基(PDA、LB、Czapek-Dox培養(yǎng)基、OA培養(yǎng)基、Gao′s No.1培養(yǎng)基和Gao′s No.2培養(yǎng)基)上分別接種放線菌菌株，放入28 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),在7～15 d內(nèi)進(jìn)行觀察并記錄其生長(zhǎng)情況。生理生化特性鑒定參考《放線菌快速鑒定與系統(tǒng)分類》[18]方法。分子生物學(xué)鑒定采用CTAB法提取待測(cè)菌株的基因組DNA，使用引物(正向7F：5′-CAGAGTTTGAT CCTGGCT-3′；反向1540R：5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′)進(jìn)行16S rRNA片段擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。將其與研究相關(guān)所得的16S rRNA基因序列組合在NCBI的Blast Search功能對(duì)放線菌菌株基因進(jìn)行相似性基因檢索，從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已知序列進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，采用MEGA5.1中鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析，采用單因素隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)和新復(fù)極差法(Duncan)進(jìn)行多重比較分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 櫻桃葉斑病菌拮抗放線菌的篩選

對(duì)分離的56株放線菌采用平板對(duì)峙法進(jìn)行篩選，其中對(duì)櫻桃葉斑病菌具有抑制作用的有4個(gè)放線菌菌株，分別為5-16、5-17、3-22、7-1，部分結(jié)果見表1和圖1。抑菌率均在64%以上，其中3-22菌株的抑菌率達(dá)到了76.39%(表1)。4個(gè)菌株的抑菌帶邊緣菌絲稀疏，鏡檢觀察發(fā)現(xiàn)，抑菌帶周圍櫻桃葉斑病菌的部分菌絲扭曲、斷裂，分生孢子膨大、畸形(圖1)，說明拮抗放線菌對(duì)櫻桃葉斑病菌的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用。

表1 拮抗菌株對(duì)櫻桃葉斑病菌的抑制效果

圖1 拮抗櫻桃葉斑病菌生防放線菌的篩選Fig.1 Screening of biocontrol Actinomycetes against antagonistic Prunus avium leaf spot

2.2 拮抗放線菌無菌濾液對(duì)櫻桃葉斑病菌的抑菌活性

由表2可知，放線菌3-22菌株和5-16菌株的抑菌效果較好，處理后7 d對(duì)櫻桃葉斑病菌的抑菌率分別為84.44%和79.17%，菌落直徑分別為13.47 mm和18.03 mm。5-17菌株的無菌濾液對(duì)櫻桃葉斑病菌的抑菌效果最低，僅為73.43%。3-22菌株與其他3個(gè)菌株的抑菌率相比，在P<0.05水平抑制作用有顯著性差異。圖2為4株放線菌菌株無菌濾液對(duì)櫻桃葉斑病菌的菌落直徑的抑制作用。

圖2 拮抗放線菌無菌濾液對(duì)櫻桃葉斑病菌的抑菌活性Fig.2 Antibacterial activity of sterile filtrate of antagonistic actinomycetes against Prunus avium leaf spot

2.3 生防放線菌菌株的離體葉片篩選結(jié)果

由表3可知，不同放線菌菌株對(duì)離體葉片葉斑病具有一定的防治效果，其中放線菌3-22菌株的抑菌效果最好，與250 g/L嘧菌酯懸浮劑500倍液的抑菌率差異不顯著(P=0.05)。不同時(shí)間的處理結(jié)果表明，早接種拮抗放線菌的效果高于晚接種的效果，尤其是早接種的保護(hù)作用好于晚接種的保護(hù)作用。其中，3-22菌株在24 h后接種處理的抑菌率為79.75%，而48 h后接種處理的抑菌率為75.54%。

表3 不同放線菌懸浮液對(duì)櫻桃葉片病斑直徑的影響

2.4 拮抗放線菌的形態(tài)學(xué)觀察及生理生化特性分析

2.4.1 形態(tài)學(xué)特征 用電子顯微鏡對(duì)4株菌株進(jìn)行觀察，其成熟孢子絲形成的孢子鏈均呈串珠狀，孢子為柱形，表面光滑無刺(圖3)，此特征為鏈霉菌屬的一種典型形態(tài)學(xué)特征。

圖3 放線菌菌株5-16、5-17、3-22和7-1在電子顯微鏡下的形態(tài)特征Fig.3 Morphological characteristics of actinomycete strains 5-16，5-17，3-22 and 7-1 under electron microscope

將4株放線菌接種于6種測(cè)試培養(yǎng)基，在28 ℃培養(yǎng)48～72 h后開始有菌落出現(xiàn)，5 d后開始產(chǎn)生孢子。菌落在不同的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況均不同，結(jié)果見表4。5-16菌株在Gao′s和Czapek-Dox培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)緊密，氣生菌絲隨著時(shí)間的推移逐漸發(fā)育變深，由白色變成灰色或深灰色。但在LB、OA和PDA培養(yǎng)基上氣生菌絲顏色較淺，多為白色或灰白色，該菌株在這6種培養(yǎng)基上均不產(chǎn)生可溶性色素，基內(nèi)氣生菌絲呈現(xiàn)不同的顏色，在LB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)一般。5-17菌株在Gao′s No.1、Gao′s No.2和OA培養(yǎng)基上分別產(chǎn)生褐色、中赭黃色和橘黃色的可溶性色素，在另外3種培養(yǎng)基上不產(chǎn)生可溶性色素，氣生菌絲為白色到深灰色等不同顏色。3-22菌株和7-1菌株在6種培養(yǎng)基上均不產(chǎn)生可溶性色素，氣生菌絲的顏色多為白色和灰色。

表4 5-16、5-17、3-22、7-1菌株在6種不同培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征比較

2.4.2 生理生化特性 參照《放線菌快速鑒定與系統(tǒng)分類》[18]鑒定方法，對(duì)4個(gè)菌株進(jìn)行生理生化鑒定，結(jié)果顯示4個(gè)菌株明膠液化、淀粉水解、硝酸鹽還原、阿拉伯糖、纖維二糖、葡萄糖、果糖、木糖醇、木糖、甘露醇、赤蘚糖醇、鼠李糖、甘露醇和肌醇為陽性，蜜二糖、D-山梨糖醇、牛奶凝固、纖維素水解、硫化氫、吲哚反應(yīng)、甲基紅反應(yīng)和V-P試驗(yàn)為陰性，與鏈霉菌具有相同的生理生化特性(表5)。

表5 4株拮抗放線菌的生理生化特征

2.4.3 16S rDNA基因序列分析 以5-16、3-22、5-17菌株和7-1菌株基因組DNA為模板，擴(kuò)增獲得相應(yīng)菌株的16S rDNA序列長(zhǎng)度分別為1 468 bp、1 469 bp、1 425 bp和1 469 bp(圖4)?；?6S rDNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明(圖5)，4個(gè)菌株與鏈霉菌菌株處于同一分支，一致性高達(dá)99%。結(jié)合其形態(tài)學(xué)特征、生理生化特性及基于16S rDNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，將4個(gè)菌株鑒定為鏈霉菌屬(Streptomycessp.)。

圖5 基于16S rDNA基因序列Blast結(jié)果構(gòu)建的4個(gè)菌株系統(tǒng)發(fā)育樹圖Fig.5 Phylogenetic tree constructed according to Blast results of 16S rDNA genes

3 討論與結(jié)論

鏈霉菌屬是放線菌類群中常見的成員之一，具有防病抗菌功能，且抑菌譜廣，可產(chǎn)生多種抗生素，在生物農(nóng)藥和生物制劑開發(fā)方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。國(guó)內(nèi)學(xué)者研究表明鏈霉菌對(duì)藍(lán)莓潰瘍病(Botryosphaeriadothidea)[19]和葡萄霜霉病(Plasmoparaviticola)[20]有不同程度的拮抗活性。Boukaew等[21]研究表明，生米卡鏈霉菌(S.mycarofaciensSS-2-243)對(duì)紅辣椒樹根莖性腐病(Ralstoniasolanacearum)、水稻白葉枯病(Xanthomonasoryzae)、番茄灰霉病(Botrytiscinerea)和馬鈴薯瘡痂病(Streptomycesscabies)有不同程度的拮抗活性，在田間條件下能明顯降低病害的發(fā)病率。同時(shí)，鏈霉菌屬已被制成殺菌劑應(yīng)用于植物病害的防治，在應(yīng)用過程中發(fā)現(xiàn)其不僅能防治真菌病害，還能產(chǎn)生吲哚乙酸IAA等活性物質(zhì)促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育[22]。本研究從感病櫻桃根際土壤中篩選得到1株拮抗鏈霉菌菌株3-22，該菌株對(duì)櫻桃離體葉斑病菌表現(xiàn)較強(qiáng)的抑菌效果，與250 g/L嘧菌酯懸浮劑500倍液的抑菌效果相當(dāng)，且越早接種拮抗菌對(duì)病害的控制越有利，與陸繼臣等[23]報(bào)道的結(jié)果一致。由此可見，3-22菌株是一株較為理想的拮抗菌，可作為櫻桃葉斑病鏈格孢菌的生防菌株。此外，通過形態(tài)學(xué)特征和16S rDNA鑒定，該菌株屬于鏈霉菌屬。但是關(guān)于3-22菌株在生物防治中的作用機(jī)理和在田間的拮抗效果仍需進(jìn)一步探究。