劉耀霞，張學(xué)飛，閆佳會(huì)，姚 強(qiáng)，郭青云

(青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院，青海省農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西寧作物有害生物科學(xué)觀(guān)測(cè)實(shí)驗(yàn)站，青海 西寧 810016)

小麥?zhǔn)鞘澜缛笾饕Z食作物之一，由條形柄銹菌小麥專(zhuān)化型(Pucciniastriiformisf.sp.tritici)引起的小麥條銹病是影響小麥優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的重要病害，小麥條銹病大流行時(shí)會(huì)造成一半以上產(chǎn)量損失甚至絕產(chǎn)[1-3]。因此，掌握小麥條銹菌的流行與傳播并準(zhǔn)確估計(jì)小麥潛育期葉片菌源量是綜合防控條銹病的重要措施[4-6]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitivate PCR，qPCR)技術(shù)快速檢測(cè)馬鈴薯酸瘡痂鏈霉菌[7]、黃瓜棒孢葉斑病菌[8]、葡萄霜霉病[9]、楊樹(shù)枯萎病菌[10]、柑橘黃龍病[11]、葡萄蠶豆萎蔫病毒[12]、番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病菌[13]、油菜菌核病[14]及小麥條銹病等病害。初炳瑤等[15]利用qPCR技術(shù)檢測(cè)了四川省多個(gè)小麥品系抗條銹病的差異?？仔掠畹萚16]利用qPCR技術(shù)定量檢測(cè)天水市秦州區(qū)、隴南市禮縣及平?jīng)鍪星f浪縣標(biāo)記的小麥條銹菌越冬病株的菌源量。黃雪玲等[17]和Ma等[18]利用該技術(shù)得出小麥條銹菌基因表達(dá)水平的最適內(nèi)參基因。潘娟娟等[19]、Fraaije等[20]利用該技術(shù)研究了小麥條銹菌生理小種CYR32潛育期的條銹菌菌源量。近年來(lái)，小麥條銹菌生理小種CYR34的流行范圍逐年擴(kuò)大，逐漸上升為優(yōu)勢(shì)小種[21]，所以研究該生理小種潛育期菌源量有重要意義。本試驗(yàn)基于小麥條銹菌生理小種CYR34和小麥條銹菌延伸因子EF1引物，利用qPCR技術(shù)檢測(cè)小麥條銹菌在小麥潛育期葉片菌源量，為早期預(yù)防大面積小麥條銹病提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

(1)供試病原菌。小麥條銹菌生理小種CYR34(標(biāo)樣采自青海貴德、循化等地區(qū)，經(jīng)單孢子堆分離和毒性鑒定得到生理小種CYR34)、小麥白粉菌(Blumeriagraminisf.sp.tritici)和小麥赤霉菌(Fusariumgraminarum)。以上病原菌均由青海省農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

(2)寄主植物。高感條銹病品種銘賢169，由青海省農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 試驗(yàn)試劑與儀器

(1)試驗(yàn)試劑。CTAB(100 mL 1 mol/L Tris HCl，pH 8.0，280 mL 5 mol/L NaCl，40 mL 0.5 mol/L EDTA，580 mL ddH2O)；DNA提取液(氯仿：異戎醇=24∶1)；異丙醇；75%乙醇；1 X TE溶液；EF1引物合成于上海生工生物工程股份有限公司。DL 500 DNA Marker、TaqTM、TB Green?Premix Ex TaqTM Ⅱ均購(gòu)買(mǎi)于TaKaRa公司。

(2)試驗(yàn)儀器。DK-600A型電熱恒溫水槽，電子天平(1/1 000)；NanoDropTM One超微量紫外分光光度計(jì)；eppendorf移液器；高速冷凍離心機(jī)ST 16R；Bio-Rad Thermal Cycler PCR儀；渦旋混合儀G560E；電泳儀DYCP-31DN；凝膠成像系統(tǒng)Champ Gel 6000；光照培養(yǎng)箱MLR-352H-PC；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀7500；TissueLyserⅡ組織破碎儀等。

1.3 試驗(yàn)方法

(1)樣品DNA提取。采集的小麥條銹菌標(biāo)樣在室內(nèi)接種擴(kuò)繁，擴(kuò)繁完成后進(jìn)行毒性鑒定[22]。將條銹菌及接種后的葉片保存在冰箱用于提取DNA。利用分光光度計(jì)檢測(cè)提取到的DNA濃度，并在-80℃冰箱中冷凍保存。

表1 小麥條銹菌引物

(2)引物篩選及特異性檢測(cè)。所用小麥條銹菌引物見(jiàn)表1，EF1引物是小麥條銹菌延伸因子[23]，PS1、PS2是利用條銹菌β-微管蛋白1基因(基因登錄號(hào)：HM067998.1)序列設(shè)計(jì)的引物。常規(guī)PCR 25 μL反應(yīng)體系為12.5 μL Ex Taq，各0.5 μL 10 μmol/L正反引物，0.5 μL模板DNA，11 μL ddH2O。常規(guī)PCR反應(yīng)程序見(jiàn)表2。3%瓊脂糖凝膠電泳(120 V，30 min)后用凝膠成像觀(guān)察條帶。qPCR 25 μL反應(yīng)體系為12.5 μL TBGreen，各1 μL 10 μmol/L正反引物，0.4 μL ROX，1 μL模板DNA，9.1 μL ddH2O。qPCR反應(yīng)程序見(jiàn)表3。觀(guān)察電泳條帶及熔解曲線(xiàn)，從而篩選引物。

(3)靈敏度檢測(cè)。小麥條銹菌生理小種CYR34 DNA的原溶液濃度為1.05×108fg/μL，稀釋后得到濃度分別為1.05×107、1.05×106、1.05×105、1.05×104、1.05×103、1.05×102和10.5 fg/μL的溶液。通過(guò)EF1引物進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增和qPCR擴(kuò)增，根據(jù)有無(wú)擴(kuò)增片段和熒光信號(hào)值評(píng)價(jià)EF1引物對(duì)小麥條銹菌DNA的靈敏度。

(4)qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制。將小麥條銹菌生理小種CYR34的DNA初始濃度按10倍梯度稀釋?zhuān)⒗胵PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增后得到相應(yīng)的CT值(每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))，在Excel中建立qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

(5)樣品驗(yàn)證檢測(cè)。在光照培養(yǎng)箱MLR-352H-PC中栽培24盆銘賢169，每盆種10棵小麥幼苗。待小麥生長(zhǎng)至2葉期，將條銹菌孢子懸浮液涂抹在第1片葉片正面，在接種室黑暗培養(yǎng)24 h后移至溫室，培養(yǎng)溫度為10～15 ℃。每隔24 h采樣1次，直至出現(xiàn)病斑(第8天后)，每次取約100 mg葉片，每個(gè)樣品重復(fù)3次。將采集的樣品保存在-80 ℃冰箱中。提取DNA前將葉片表面清洗干凈，再利用CTAB方法提取小麥葉片gDNA，并進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。應(yīng)用所建立的qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算小麥潛育期葉片中的條銹菌菌源量。

2 結(jié)果與分析

2.1特異性引物篩選分別利用三組引物進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增和qPCR擴(kuò)增后，特異性引物篩選如圖1，從圖中可以看出EF1引物擴(kuò)增出了單一的目的條。引物qPCR熔解曲線(xiàn)如圖2所示，由圖2可知引物EF1熔解曲線(xiàn)為單一的產(chǎn)物峰，而引物PS1和PS2擴(kuò)增出現(xiàn)了多條片段，熔解曲線(xiàn)出現(xiàn)雜峰，產(chǎn)生其他非特異性熒光。因此，選用小麥條銹菌延伸因子EF1為本試驗(yàn)的引物。

圖1 特異性引物篩選 Fig.1 Screening of specific primer

圖2 引物qPCR 熔解曲線(xiàn)Fig.2 qPCR melting curves of primer

2.2引物特異性檢驗(yàn)以ddH2O作為對(duì)照，利用EF1引物對(duì)小麥條銹菌、小麥白粉菌及小麥赤霉菌基因組DNA進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增。EF1引物特異性檢測(cè)結(jié)果如圖3所示，由圖3可知小麥條銹菌擴(kuò)增出了特異性目的片段243 bp，陰性對(duì)照及其他病原菌均未擴(kuò)增出片段。EF1引物qPCR熔解曲線(xiàn)如圖4所示，從圖中可以看出，進(jìn)行qPCR擴(kuò)增后熔解曲線(xiàn)未出現(xiàn)雜峰，擴(kuò)增產(chǎn)物單一。說(shuō)明EF1引物特異性良好，可以用于小麥條銹菌特異性檢測(cè)。

圖3 EF1引物特異性檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Specificity detection of primer EF1

圖4 EF1引物qPCR 熔解曲線(xiàn)Fig.4 qPCR melting curve of primer EF1

2.3引物靈敏度檢測(cè)將小麥條銹菌gDNA的濃度進(jìn)行梯度稀釋后，分別用常規(guī)PCR和qPCR進(jìn)行擴(kuò)增。EF1引物對(duì)常規(guī)PCR有擴(kuò)增，檢測(cè)到最低條銹菌菌源量為1.05×104fg/μL，低于該濃度條銹菌無(wú)擴(kuò)增條帶(圖5)。qPCR檢測(cè)到的濃度最低值為1.05×102fg/μL，即qPCR檢測(cè)靈敏度是常規(guī)PCR靈敏度的100倍(圖6)。

圖5 EF1引物常規(guī)PCR 靈敏度檢測(cè)Fig.5 Sensitivity detection of ordinary PCR of primer EF1

圖6 qPCR 靈敏度檢測(cè)Fig.6 Sensitivity detection of qPCR

2.4qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立將小麥條銹菌DNA的濃度進(jìn)行10倍稀釋?zhuān)圆煌稊?shù)梯度稀釋的gDNA為模板構(gòu)建qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。以循環(huán)數(shù)為Y軸，基因組DNA濃度的對(duì)數(shù)為X軸，繪制qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)后得出回歸方程。小麥條銹菌標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)如圖7所示，DNA拷貝數(shù)與CT值之間存在良好的線(xiàn)性關(guān)系：Y=-1.788 5x+27.681(R2=0.981 9，P<0.001)。

圖7 小麥條銹菌標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.7 Standard curve of P.striiformis f. sp. tritici

圖8 接種后小麥潛育期葉片菌源量Fig.8 Bacteria source quantity in wheat leaves during the incubation period after inoculation

2.5小麥潛育期葉片菌源量檢測(cè)取接種后的小麥葉片進(jìn)行qPCR檢測(cè)，其菌源量如圖8所示。接種后第1天條銹菌菌源量為0.01 ng，菌源量隨著接種天數(shù)的增加不斷增多；第9天葉片表面出現(xiàn)零星的夏孢子，停止取樣，增長(zhǎng)趨勢(shì)呈指數(shù)型：Y=0.011e0.839x(R2=0.964 2)，其中x是接種天數(shù)，Y是接種后的菌源量。接種后第8天檢測(cè)到小麥葉片中的條銹菌菌源量達(dá)到約5.5 ng。

3 討論與結(jié)論

通過(guò)qPCR技術(shù)建立小麥潛育期條銹菌菌源量檢測(cè)體系可為預(yù)防小麥條銹病提供理論依據(jù)。Devadas等[24]與Wang等[25]利用遙感技術(shù)、紅外光譜分析等技術(shù)檢測(cè)到小麥條銹菌。潘娟娟等[19]通過(guò)應(yīng)用特異性引物betaf/betar建立了qPCR檢測(cè)體系，定量檢測(cè)小麥葉片接種條銹菌后組織內(nèi)的DNA變化，可以有效預(yù)測(cè)條銹菌在一定時(shí)間內(nèi)的菌源量變化。

本試驗(yàn)基于小麥條銹菌生理小種CYR34和小麥條銹菌延伸因子EF1引物，利用qPCR技術(shù)快速準(zhǔn)確檢測(cè)小麥潛育期條銹菌菌源量，得出以下結(jié)論：(1)本研究建立了qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，DNA拷貝數(shù)與CT值存在良好的線(xiàn)性關(guān)系，即Y=-1.788 5x+27.681(R2=0.981 9，P<0.001)。(2)本研究構(gòu)建的qPCR檢測(cè)體系的靈敏度是常規(guī)PCR的100倍，能夠更早、更及時(shí)地檢測(cè)病害。(3)在小麥葉片接種條銹菌后第1天應(yīng)用qPCR檢測(cè)體系檢測(cè)到條銹菌，且第8天檢測(cè)到小麥葉片中的條銹菌菌源量約為5.5 ng。