高曉娟，薛久洲，高 艷，劉萬華，白艷艷，薛琳玨，白崇生，郝玉青，劉健鵬*

(1.榆林學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 榆林 719000；2.榆林市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，陜西 榆林 719000；3.榆林市動物疫病預(yù)防控制中心，陜西 榆林 719000)

豬瘟( Classical swine fever，CSF) 是一種由豬瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)引起的豬重要急性型與較為烈性的傳染病，嚴(yán)重威脅著我國養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。通過疫苗進(jìn)行免疫則是目前預(yù)防和控制CSF發(fā)生和流行的重要手段和措施，該病的臨床特征包括器官出血、壞死、梗死和纖維素性壞死性腸炎等，后期常繼發(fā)副傷寒及巴氏桿菌病。豬瘟居我國豬五大傳染病(豬瘟、偽狂犬病、藍(lán)耳病、Ⅱ型圓環(huán)病毒病、口蹄疫)之首，嚴(yán)重影響著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。就目前而言，對CSF的預(yù)防仍然是通過疫苗免疫，在制定并執(zhí)行相對固定的免疫程序、選擇疫苗類型、免疫增強(qiáng)劑等方面應(yīng)加以注意，但如何提高抗體水平、增強(qiáng)疫苗免疫效果是CSF防控中一直以來有待解決的關(guān)鍵問題。而穴位免疫是根據(jù)針灸與現(xiàn)代免疫學(xué)理論，經(jīng)穴位注射抗原物質(zhì)后，通過活化機(jī)體免疫系統(tǒng)，調(diào)節(jié)、增強(qiáng)免疫應(yīng)答反應(yīng)。其中，后海穴就是家畜一個(gè)常用的重要經(jīng)絡(luò)穴位，且經(jīng)證實(shí)能有效提高抗體效價(jià)和放大疫苗免疫作用。在豬病防治中也有相關(guān)研究報(bào)道，黃慶洲等通過豬后海穴注射豬傳染性胃腸炎疫苗，母豬初乳、常乳及免疫仔豬血清中IL-2的含量較口服組和肌肉注射組高。蔣圣姣等發(fā)現(xiàn)，后海穴注射口蹄疫疫苗的抗體效價(jià)優(yōu)于肌肉注射對照組。張志成等發(fā)現(xiàn)，后海穴注射豬瘟兔化弱毒苗1頭份效果比肌肉注射2頭份的效果還好。因此，本試驗(yàn)采用后海穴注射途徑對30日齡仔豬進(jìn)行CSF疫苗免疫，分析其抗體水平和免疫效果，以期為生產(chǎn)中提高仔豬CSF免疫效果提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

CSF疫苗為豬瘟活疫苗(齊魯動物保健品有限公司，濟(jì)南，批號：150251004)，60頭份/瓶。豬瘟正向間接血凝試劑盒(批號：20170504202)，購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)動物選擇及試驗(yàn)設(shè)計(jì) 選擇健康無病、未免疫接種過CSF疫苗的30日齡PIC仔豬80頭作為試驗(yàn)動物。將80頭仔豬隨機(jī)分為2組，每組40頭，分別開展后海穴接種CSF疫苗效果研究和后海穴免疫接種CSF疫苗后抗體時(shí)序消長規(guī)律兩個(gè)試驗(yàn)研究。

1.2.2 后海穴接種CSF疫苗效果研究 將40頭30日齡PIC仔豬隨機(jī)將其分為對照組和試驗(yàn)組2組，每組各20頭，對照組通過頸部肌肉CSF疫苗(每頭1頭份)，試驗(yàn)組后海穴接種CSF疫苗(每頭1頭份)，(后海穴注射具體操作方法：在尾根與肛門中間凹陷的小窩處進(jìn)針，且保持與豬的脊柱方向平行刺入，進(jìn)針深度為1.5～3.0 cm。)接種30 d后，對每頭試驗(yàn)豬進(jìn)行前腔靜脈無菌采血5 mL，分離血清，測定各組抗體水平?？贵w合格率=(抗體合格樣本數(shù)/本組樣本總數(shù))×100%，抗體水平≥5即為合格。

1.2.3 后海穴免疫接種CSF疫苗后抗體時(shí)序消長規(guī)律 將40頭30日齡PIC仔豬隨機(jī)將其分為對照組和試驗(yàn)組2組，每組各20頭，分別通過頸部肌肉(對照組)和后海穴(試驗(yàn)組)接種CSF疫苗(每頭1頭份)，于7 d、14 d、21 d、35 d和60 d后分別無菌采集血，分離血清，測定各組抗體水平。

1.2.4 抗體檢測及結(jié)果判定 該試驗(yàn)采用正向間接血凝試驗(yàn)(IHA)對CSF抗體進(jìn)行檢測，方法按照試劑盒使用說明書進(jìn)行。結(jié)果判定：將血凝板放在白紙上，先觀察陰性對照血清1∶16孔、稀釋液對照孔，均應(yīng)無凝集(紅細(xì)胞全部沉入孔底形成邊緣整齊的小圓點(diǎn))或僅出現(xiàn)“+”凝集(大部分紅細(xì)胞沉入孔底，邊緣有少量紅細(xì)胞懸浮)，陽性血清對照孔1∶2～ 1∶256 各孔應(yīng)出現(xiàn)“++”以上凝集(大部分或全部紅細(xì)胞懸浮孔內(nèi))，以呈現(xiàn)“++”血凝反應(yīng)的血清最高稀釋度作為該血清的間接血凝抗體效價(jià)。在對照孔合格的前提下，觀察待檢血清各孔，以呈現(xiàn)“++”凝集(50%以上的紅細(xì)胞出現(xiàn)懸浮)的血清最大稀釋倍數(shù)為該血清的抗體效價(jià)，抗體效價(jià)達(dá)≥1∶32 (即25，第5孔)為合格。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel2007初步整理后，采用SPASS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，并用檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析，>0. 05表示差異不顯著，<0. 01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 后海穴接種CSF疫苗效果研究

由表1知，試驗(yàn)組抗體合格率高達(dá)100%，對照組差異極顯著，后海穴注射CSF疫苗的抗體水平明顯高于肌肉注射(<0.01)。常規(guī)肌肉注射CSF后，免疫抗體合格率>70%，雖符合強(qiáng)制免疫要求，但是抗體水平不是很均一，疫苗的保護(hù)效果并不是很理想。

2.2 后海穴免疫接種CSF疫苗后抗體消長規(guī)律

由圖1可以看出，在CFS疫苗接種后的整個(gè)抗體消長過程中，同一時(shí)間段，試驗(yàn)組的抗體效價(jià)均高于對照組，其中，第14天、35天時(shí)差異顯著(<0.05)，第60天時(shí)差異極顯著(<0.01)。且試驗(yàn)組的抗體平均效價(jià)在疫苗接種后第14、21、35、60天時(shí)均高于2(合格水平)，而對照組的抗體平均效價(jià)只有在疫苗接種后第21、35天時(shí)高于2。表明，在CFS疫苗接種后的整個(gè)抗體消長過程中，后海穴免疫注射較肌肉注射途徑的抗體水平高，且抗體平均效價(jià)在合格水平以上出現(xiàn)的時(shí)間早，維持時(shí)間較長。

表1 CSF抗體效價(jià)檢測結(jié)果Table 1 Results of CSF antibody titer test

圖1 CSF抗體消長規(guī)律(n=20)小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)Fig.1 Growth and decline law of CSF antibodyDifferent lower case letters mean significant difference (P<0.05)

進(jìn)一步分析CFS疫苗接種后的抗體消長規(guī)律發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組和對照組的CFS抗體均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，且在疫苗接種第35天達(dá)到抗體效價(jià)峰值，但試驗(yàn)組的峰值高于對照組，二者在峰值前、后的升長與下降速度也顯著不同。試驗(yàn)組的CFS抗體效價(jià)在峰值前的上升速度整體較對照組快(第14天到21天這一階段除外)，其在第14天與21天間、第21天與35天間均差異顯著(<0.05)，對照組只有第14天與21天間差異顯著。而試驗(yàn)組在峰值后的下降速度較對照組慢，對照組在第35天與60天間差異顯著(<0.05)，而試驗(yàn)組差異不顯著。綜合表明，后海穴免疫注射CFS疫苗與肌肉注射相比，抗體產(chǎn)生的速度較快、衰減速度較慢，且峰值高，維持時(shí)間長。

3 討 論

由于新生仔豬CFS抗體可通過母乳獲得，但CFS母源抗體隨著仔豬斷奶，在32日齡時(shí)顯著降低，并確定在25～32 d進(jìn)行首免較好。因此，本試驗(yàn)為了最大限度的避免母源抗體的影響，將30日齡仔豬作為試驗(yàn)動物進(jìn)行首次接種。同時(shí)，由于疫苗接種后一般4～7 d產(chǎn)生抗體，且生產(chǎn)實(shí)際中多在60日齡進(jìn)行二免。所以，本試驗(yàn)于CFS疫苗接種后30 d進(jìn)行初步的抗體檢測，并于接種后第7天開始至第60天分不同時(shí)間進(jìn)行抗體效價(jià)追蹤，以觀察其產(chǎn)生、衰減速度，掌握消長規(guī)律?？贵w水平的高低標(biāo)志著豬體對疫病的易感程度，抗體峰值出現(xiàn)的遲早、持續(xù)時(shí)間長短表明不同的疫苗免疫效果。本試驗(yàn)通過抗體效價(jià)檢測，證實(shí)后海穴免疫注射CFS疫苗后的抗體水平較同等試驗(yàn)條件、同等免疫劑量下的肌肉注射途徑高，這與傅章偉的研究結(jié)果一致。而進(jìn)一步的抗體追蹤試驗(yàn)證實(shí)，后海穴免疫注射CFS疫苗后的抗體峰值較肌肉注射高，維持時(shí)間較長，更深入確鑿地表明，CFS疫苗后海穴注射，可有效提高免疫效果?？梢?，后海穴是一個(gè)較敏感的免疫注射部位，比常規(guī)肌肉注射方式更容易激發(fā)動物機(jī)體的免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫保護(hù)力。

雖然后海穴注射CFS疫苗有較好的免疫效果，但也存在一些不足。由于穴位范圍很小，且要注意防止刺傷脊椎和直腸等原因，導(dǎo)致其操作要求較高、操作時(shí)間較長，且對豬的應(yīng)激反應(yīng)較強(qiáng)，再加上后海穴距離肛門較近，而肛門本身不清潔，使消毒煩瑣，操作勞動量加大。因此，在后海穴注射CFS疫苗的生產(chǎn)實(shí)踐中，應(yīng)注意克服這些負(fù)面影響。