劉偉強(qiáng)，符 洋

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院胃腸外科，河南 鄭州 450052)

胃癌是全世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，也是最常見的惡性腫瘤死亡原因之一[1]。有研究報(bào)道胃癌發(fā)病率居我國惡性腫瘤第2位，死亡率居我國惡性腫瘤第3位。該病的主要危險(xiǎn)因素包括幽門螺桿菌感染、年齡、高鹽攝入量以及水果和蔬菜含量低的飲食[2]。盡管近些年靶向治療對(duì)惡性腫瘤生物學(xué)和發(fā)展的理解方面取得了進(jìn)展，但胃癌的治療效果有限，患者的預(yù)后仍然較差。急需有效的生物標(biāo)志物和治療的靶點(diǎn)[3-4]。因此，進(jìn)一步探索研究新的基因功能改變與胃癌發(fā)生、發(fā)展及其惡性特征的關(guān)系，對(duì)揭示其發(fā)生、發(fā)展的精確分子機(jī)制、設(shè)計(jì)合理的治療藥物及判斷預(yù)后，進(jìn)一步提高我國胃癌的治療水平具有重要意義。

FKBP家族基因因其能夠于FK506或雷帕霉素結(jié)合發(fā)揮免疫抑制作用而得名，是進(jìn)化保守的親免素家族的重要成員，在哺乳動(dòng)物中普遍表達(dá)[5-6]。FKBP家族基因都含有一個(gè)或多個(gè)PPIase結(jié)構(gòu)域，在生理或者病理情況下參與多種生物學(xué)過程，包括蛋白折疊、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答、受體信號(hào)通路等[6-7]。近年來越來越的的證據(jù)表明FKBP 家族基因在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到不可忽視的作用[8-9]。FKBP5作為FKBP家族基因的一員，其在胃癌中的表達(dá)及臨床意義尚不明確，本研究旨在分析FKBP5在胃癌中的表達(dá)，并利用生物信息學(xué)方法分析FKBP5與免疫浸潤及患者預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源從UCSC Xena(http://xena.ucsc.edu/)網(wǎng)站下載人類腫瘤基因組圖譜數(shù)據(jù)庫(TCGA)中的包含完整預(yù)后信息的胃癌組織(408例)和癌旁正常組織樣本(35例)的RNA表達(dá)數(shù)據(jù)并與臨床信息(包括總生存時(shí)間、生存狀態(tài)、T分期、病理分級(jí)等)進(jìn)行匹配，預(yù)后信息及相關(guān)臨床缺失的樣本予以剔除。

1.2 TIMER數(shù)據(jù)庫使用TIMER 2.0數(shù)據(jù)庫中的檢索功能評(píng)估FKBP5在TCGA不同腫瘤中的mRNA水平的表達(dá)情況;利用TIMER數(shù)據(jù)庫評(píng)估胃癌中FKBP5 mRNA表達(dá)與6種免疫細(xì)胞浸潤的相關(guān)性，計(jì)算出Spearman秩相關(guān)系數(shù)和P值并繪制散點(diǎn)圖。根據(jù)免疫細(xì)胞浸潤水平中位數(shù)將樣本分為高、低組，應(yīng)用Kaplan-Meier方法繪制生存曲線，log rank檢驗(yàn)其對(duì)胃癌患者預(yù)后的影響。

1.3 GSEA分析從分子特征數(shù)據(jù)庫(MSigDB)中下載 hallmark基因集(h.all.v7.2.symbols.gmt)和ontology基因集(c5.all.v7.4.symbols.gmt)，使用clusterprofiler按照默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行GSEA分析高、低表達(dá)FKBP5組的富集通路，計(jì)算出富集分?jǐn)?shù)(ES)、P值和錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)，分析FKBP5潛在作用機(jī)制。FDRP<0.05定義為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用gseaplot2繪制富集圖。

1.4 KM plotter數(shù)據(jù)庫使用KM plotter在線網(wǎng)站檢索在GSE62254數(shù)據(jù)集283例帶有完整預(yù)后信息的樣本，按照FKBP5表達(dá)中位數(shù)將樣本分為FKBP5高表達(dá)和低表達(dá)組，Kaplan-Meier方法繪制生存曲線，log rank檢驗(yàn)其對(duì)胃癌患者預(yù)后的影響。根據(jù)分期篩選出Ⅱ期和Ⅲ期的樣本，并在亞組中分析FKBP5對(duì)患者預(yù)后的影響。

1.5 免疫檢查點(diǎn)基因相關(guān)性分析在TCGA胃癌數(shù)據(jù)集中，利用Pearson相關(guān)分析FKBP5與免疫檢查點(diǎn)基因的表達(dá)相關(guān)性，其中P<0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。利用corrplot程序包繪制相關(guān)性熱圖，ggplot2繪制相關(guān)性散點(diǎn)圖。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用R-4.0.3進(jìn)行本研究的統(tǒng)計(jì)分析及作圖。2組之間的差異分析使用Wilcoxon-Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，2組以上采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)。在TCGA胃癌數(shù)據(jù)集中以FKBP5表達(dá)中位數(shù)分組用Kaplan-Meier法繪制生存曲線評(píng)估FKBP5高、低表達(dá)對(duì)患者總生存時(shí)間的影響，log rank檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)。limma程序包用來分析FKBP5高、低表達(dá)組樣本的差異基因。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 FKBP5在泛癌中表達(dá)利用TIMER數(shù)據(jù)庫檢索FKBP5在TCGA數(shù)據(jù)庫33種腫瘤樣本的轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)，F(xiàn)KBP5在多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、肝癌組織中表達(dá)上調(diào)，而在膽囊癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、甲狀腺癌、胃癌等癌組織中的表達(dá)低于癌旁組織(P<0.05)。見圖1。

圖1 FKBP5在33種人類腫瘤組織中的表達(dá)(1)P<0.05，2)P<0.01，3)P<0.001)

2.2 FKBP5在胃癌中表達(dá)進(jìn)一步我們分析了FKBP5在胃癌不同亞組中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)FKBP5在腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)，進(jìn)一步我們分析FKBP5在不同組織學(xué)亞組中的表達(dá)差異。發(fā)現(xiàn)在較高的病理分級(jí)(G3)中FKBP5表達(dá)較高，F(xiàn)KBP5的表達(dá)隨著T分期的增加而增高(P<0.05)。見圖2。

圖2 FKBP5在不同胃組織中的表達(dá)(1)P<0.05，2)P<0.01，3)P<0.001)

2.3 FKBP5的表達(dá)與胃癌患者的預(yù)后相關(guān)在TCGA胃癌數(shù)據(jù)集中，將不同樣本中FKBP5的表達(dá)按照中位數(shù)分為高表達(dá)和低表達(dá)2組，然后利用Kaplan-Meier繪制生存曲線，log rank 檢驗(yàn)比較2組生存曲線的P值，F(xiàn)KBP5高表達(dá)組患者總生存率較差(P<0.05)。就不同分期而言，在Ⅱ期胃癌患者中FKBP5高表達(dá)與較差的預(yù)后相關(guān)，而在Ⅲ期胃癌中FKBP5 高表達(dá)的患者預(yù)后較差，雖然P>0.05，但2組之間的差異有一定趨勢(shì)。然后我們利用KM plotter 網(wǎng)站檢索在GSE62254數(shù)據(jù)集中進(jìn)一步驗(yàn)證FKBP5表達(dá)對(duì)胃癌患者預(yù)后的影響，發(fā)現(xiàn)FKBP5高表達(dá)患者無論是在總體樣本中還是在Ⅱ期或者Ⅲ期患者中均表現(xiàn)出較差的預(yù)后(HR>1.50,P<0.05)。見圖3。

2.4 FKBP5在胃癌中富集通路分析在TCGA胃癌數(shù)據(jù)集中，分析FKBP5高、低表達(dá)2組的差異基因，將基因按照差異倍數(shù)(Log2FC)從高到低排序，利用GSEA分析，以GO基因集分析顯示FKBP5高表達(dá)組富集的前5個(gè)基因集為吞噬識(shí)別、免疫球蛋白復(fù)合物、免疫球蛋白復(fù)合物循環(huán)、T細(xì)胞受體復(fù)合物、免疫球蛋白受體結(jié)合。以Hallmark基因集分析顯示FKBP5高表達(dá)組與同種異體排斥、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、HEDGEHO信號(hào)、炎癥反應(yīng)、肌生成等信號(hào)通路相關(guān)(ES>1.50,P<0.05)。這些結(jié)果提示FKBP5在胃癌中的潛在作用機(jī)制。見圖4。

圖4 GSEA分析FKBP5在胃癌中富集通路分析

2.5 FKBP5與腫瘤免疫細(xì)胞浸潤相關(guān)通過TIMER數(shù)據(jù)庫分析FKBP5轉(zhuǎn)錄水平與胃癌中B細(xì)胞、CD4 T細(xì)胞、CD8 T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞6種免疫細(xì)胞浸潤水平的相關(guān)性。發(fā)現(xiàn)FKBP5與CD4+ T細(xì)胞、CD8+ T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞的浸潤呈正相關(guān)(cor>0.35,P<0.05)，與腫瘤純度呈負(fù)相關(guān)，與B細(xì)胞浸潤水平無明顯相關(guān)性(P>0.05)。在TCGA胃癌樣本中，利用免疫浸潤水平中位數(shù)分組，生存分析發(fā)現(xiàn)高巨噬細(xì)胞浸潤與較差的預(yù)后相關(guān)(P<0.05),而其他幾種免疫細(xì)胞浸潤水平與患者預(yù)后無明顯相關(guān)性。見圖5。

圖5 FKBP5在胃癌中免疫浸潤的關(guān)系

2.6 FKBP5的表達(dá)與免疫檢查點(diǎn)基因正相關(guān)利用Pearson相關(guān)分析評(píng)估FKBP5轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)與一些經(jīng)典的免疫檢查點(diǎn)基因的相關(guān)性并繪制熱圖。FKBP5與大部分免疫檢查點(diǎn)基因存在正相關(guān)(cor>0.45,P<0.05)；散點(diǎn)圖顯示FKBP5與PDCD1(cor=0.43，P<0.05)、PDCD1LG2(cor=0.56，P<0.05)明顯正相關(guān)。見圖6。

圖6 FKBP5與免疫檢查點(diǎn)基因的相關(guān)性

3 討論

胃癌是一種發(fā)病率和死亡率都很高的惡性腫瘤。目前的分子檢測(cè)學(xué)數(shù)據(jù)表明，胃癌并不是一個(gè)單一的、均質(zhì)化的實(shí)體腫瘤，而是由具有不同生物學(xué)特性的幾種胃癌分子亞型組成。比較經(jīng)典的分型標(biāo)準(zhǔn)是1965年確立的Lauren分型，根據(jù)胃癌的組織結(jié)構(gòu)和生物學(xué)行為分為：腸型和彌漫性[10]。而后隨著測(cè)序技術(shù)和高通量數(shù)據(jù)分析技術(shù)的發(fā)展，有機(jī)會(huì)從分子水平進(jìn)一步探究胃癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制。TCGA團(tuán)隊(duì)依據(jù)高質(zhì)量、大規(guī)模的測(cè)序數(shù)據(jù)將胃癌分為：EBV病毒陽型、微衛(wèi)星不穩(wěn)定型、基因組穩(wěn)定型、染色體不穩(wěn)定型4種分子亞型[11]。與傳統(tǒng)的組織學(xué)分型相比，分子分型在患者預(yù)后預(yù)測(cè)、個(gè)體化治療方案確定、療效評(píng)估等方面更具臨床影響力。但是目前并沒有一些針對(duì)胃癌的特異性分子被應(yīng)用于臨床。因此挖掘新的、有效的分子標(biāo)志物對(duì)胃癌的診斷、預(yù)后評(píng)估及治療具有重要意義。

FKBP5是一種編碼蛋白質(zhì)的基因，作為進(jìn)化保守的親免素家族的一員，其蛋白序列中含有兩個(gè)PPIase結(jié)構(gòu)域和3個(gè)重復(fù)的TPR結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域?qū)τ谄湫惺构δ芫哂兄匾饔肹12]。例如，F(xiàn)KBP5通過與熱休克蛋白Hsp90/Hsp70結(jié)合成復(fù)合體進(jìn)而調(diào)節(jié)糖皮質(zhì)激素受體功能[13]。既往研究[14-15]表明，F(xiàn)KBP5的表達(dá)失調(diào)或表觀遺傳學(xué)的改變會(huì)導(dǎo)致炎癥、心血管疾病、精神疾病的發(fā)生、發(fā)展。近年來越來越的研究[16-18]發(fā)現(xiàn)FKBP5的失調(diào)與甲狀腺癌、惡性膠質(zhì)瘤、黑色素瘤等的發(fā)生和生存預(yù)后顯著相關(guān)。

本研究利用生物信息學(xué)發(fā)現(xiàn)FKBP5在多種腫瘤組織中的普遍失調(diào)，其中在胃癌腫瘤組織中下調(diào)，同時(shí)FKBP5 在不同T分期和組織學(xué)分級(jí)中的表達(dá)也存在異質(zhì)性，F(xiàn)KBP5在高T分期(T4、T3)中的表達(dá)更高，在高組織學(xué)分級(jí)(G3)中表達(dá)更高，這些結(jié)果表明FKBP5 可能在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用。同時(shí)我們分別在TCGA的測(cè)序數(shù)據(jù)和GSE62254芯片數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)FKBP5高表達(dá)的患者總生存時(shí)間更短，預(yù)后更差，且這種差異獨(dú)立于不同的病理分期。表明FKBP5有望成為胃癌潛在的生物標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)。GSEA富集分析發(fā)現(xiàn)FKBP5主要與同種異體排斥、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、HEDGEHO 信號(hào)、炎癥反應(yīng)等通路相關(guān)。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是指上皮細(xì)胞與其周圍的細(xì)胞分離并獲得間質(zhì)遷移特性的過程。目前普遍認(rèn)為上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在惡性腫瘤遷移、侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的具有重要作用[19]。因此，我們推測(cè)FKBP5可能通過激活上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、炎癥反應(yīng)等信號(hào)促進(jìn)胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，但其潛在機(jī)制仍需要深入研究。

腫瘤微環(huán)境由各種免疫細(xì)胞、炎癥細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、血管、淋巴管及細(xì)胞外基質(zhì)組成[20]。近年來靶向腫瘤微環(huán)境的研究成為熱點(diǎn)。腫瘤中不同比例的免疫細(xì)胞能夠與腫瘤細(xì)胞相互作用，從而發(fā)揮抗腫瘤或者促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用。作為腫瘤中免疫浸潤細(xì)胞的組成部分，巨噬細(xì)胞在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及免疫治療耐藥等方面具有重要作用。例如，M2巨噬細(xì)胞受到Th2細(xì)胞因子激活并表現(xiàn)出促進(jìn)組織重塑和腫瘤進(jìn)展的功能[21]。本研究的數(shù)據(jù)表明，在胃癌中微環(huán)境中巨噬細(xì)胞比例增多與不良預(yù)后明顯相關(guān)，相關(guān)性分析顯示FKBP5 mRNA的表達(dá)與巨噬細(xì)胞浸潤、CD4+ T細(xì)胞浸潤、中性粒細(xì)胞浸潤、樹突狀細(xì)胞浸潤明顯正相關(guān)，提示FKBP5可能參與免疫微環(huán)境的調(diào)節(jié)。有研究[22]發(fā)現(xiàn)FKBP51s可以作為黑色素瘤患者免疫治療效果的預(yù)測(cè)因子。D’Arrigo等[23]發(fā)現(xiàn)FKBP51s通過催化隨后糖基化所需的蛋白質(zhì)折疊上調(diào)質(zhì)膜上的PD-L1表達(dá)。因此我們進(jìn)一步分析FKBP5的表達(dá)與一些公認(rèn)的免疫檢查點(diǎn)基因的表達(dá)的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)FKBP5與這些免疫相關(guān)基因明顯正相關(guān)。目前以程序性死亡受體1、PD-L1為靶點(diǎn)的藥物已經(jīng)被批準(zhǔn)用于部分腫瘤的免疫治療。我們的數(shù)據(jù)表明FKBP5可能參與胃癌中的免疫調(diào)節(jié)，從而促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展及免疫逃逸，因此靶向FKBP5可能通過調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境，從而提高免疫治療效果。

綜上所述，本研究利用生物信息學(xué)方法系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)FKBP5在胃癌較高的病理分級(jí)和T分期中表達(dá)較高，且高表達(dá)與預(yù)后不良相關(guān)。FKBP5高表達(dá)與巨噬細(xì)胞等免疫浸潤水平正相關(guān)，同時(shí)參與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等致癌相關(guān)通路,有望成為胃癌預(yù)后生物標(biāo)志物和治療的新靶點(diǎn)。