王璇,錢桂英，凌曉穎,嚴(yán)花,汪受傳，3，單進(jìn)軍,3

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)兒科學(xué)研究所,江蘇省兒童呼吸疾病(中醫(yī)藥)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 210023;2.南京中醫(yī)藥大學(xué)常熟附屬醫(yī)院,江蘇 蘇州 215500;3.江蘇省中藥高效給藥系統(tǒng)工程中心,江蘇 南京 210023)

支氣管哮喘(簡稱哮喘),是常見的呼吸系統(tǒng)慢性疾病[1]。其發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜,臨床表現(xiàn)為氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性和氣道重塑[2-4]。截至2019年6月,我國20歲及以上人群哮喘患病率為4.2%,患病人數(shù)達(dá)到4 570萬[5-6]。在中國,哮喘已經(jīng)成為亟需解決的公共衛(wèi)生與醫(yī)療保健問題[7]。目前治療哮喘常用的藥物有吸入糖皮質(zhì)激素、長效β2受體激動(dòng)劑、皮質(zhì)類固醇和白三烯修飾劑[8]。臨床常用的化學(xué)藥物孟魯司特鈉被美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)通報(bào)具有精神性相關(guān)不良反應(yīng),使得哮喘治療再次面臨嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)[9-10]。目前,無論是中成藥單獨(dú)使用還是與常規(guī)哮喘藥物聯(lián)合使用治療在中國已被廣泛選擇。

黃龍止咳顆粒以黃芪、地龍為君藥,淫羊藿、魚腥草、射干、炙麻黃為臣藥,葶藶子、山楂為佐藥,桔梗為使藥,具有宣肺祛痰，健脾消食，補(bǔ)腎益精的功效。在臨床上對(duì)于支氣管哮喘和兒童咳嗽變異性哮喘療效確切。課題組前期研究表明黃龍止咳顆粒通過調(diào)控肺脂質(zhì)紊亂治療哮喘,但其分子機(jī)制尚待闡明[11]?；诖?本研究在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測的基礎(chǔ)上,進(jìn)行了相關(guān)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,以此探討黃龍止咳顆粒治療哮喘的潛在作用機(jī)制,為后續(xù)研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

1.1.1 數(shù)據(jù)庫與軟件 TCMSP數(shù)據(jù)庫(http://tcmspw.com/tcmsp.php),TCMID數(shù)據(jù)庫(http://119.3.41.228: 8000/tcmid/),Pubchem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/),Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(http://www.swisstargetprediction.ch/),Gene Cards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/),OMIM數(shù)據(jù)庫(https://omim.org/),Disgenet數(shù)據(jù)庫(https://www.disgenet.org/),Drugbank數(shù)據(jù)庫(https://go.drugbank.com/),STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/),Venny2.1在線軟件作圖工具平臺(tái)(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/),Cytoscape 3.7.1軟件,R3.6.0軟件等。

1.1.2 藥物活性成分的篩選 在TCMSP數(shù)據(jù)庫中檢索黃龍止咳顆粒中的藥物,并結(jié)合文獻(xiàn)補(bǔ)充有相關(guān)藥理作用的成分作為潛在活性成分。使用Pubchem數(shù)據(jù)庫獲得上述成分的SDF結(jié)構(gòu),保存為Canonical SMILES格式。

1.1.3 藥物靶點(diǎn)的預(yù)測 將上述得到的SMILES格式文件導(dǎo)入Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫,以“人類”為研究物種,得到黃龍止咳顆粒的藥物作用靶點(diǎn)。

1.1.4 疾病靶點(diǎn)的篩選 使用GeneCards、OMIM、Disgenet、Drugbank數(shù)據(jù)庫以“asthma”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索,獲得疾病的作用靶點(diǎn)。

1.1.5 潛在作用靶點(diǎn)的獲取 在Venny2.1在線作圖工具平臺(tái)上分別錄入黃龍止咳顆粒和哮喘的靶點(diǎn),繪制韋恩圖,兩者的交集作為藥物治療疾病的潛在作用靶點(diǎn)。

1.1.6 網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建及分析 將藥物的活性成分、潛在作用靶點(diǎn)分別導(dǎo)入Cytoscape軟件,構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”相互作用網(wǎng)絡(luò)圖,使用Network Analyzer功能對(duì)藥物中的主要活性成分進(jìn)行分析。

1.1.7 蛋白相關(guān)作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析 通過STRING數(shù)據(jù)庫獲取潛在作用靶點(diǎn)的相互作用信息,將其導(dǎo)入Cytoscape軟件,繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖,根據(jù)節(jié)點(diǎn)的Degree值篩選出核心靶點(diǎn)。

1.1.8 通路富集分析 使用R語言對(duì)潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行富集分析,得到GO和KEGG富集分析的條形圖和通路圖,分析黃龍止咳顆粒治療哮喘的生物過程和信號(hào)通路。

1.2 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.2.1 儀器與試劑 梯度PCR 儀(MJ mini)購自德國Eppendorf公司;倒置顯微鏡(DMIL)購自德國Leica公司; 超聲波噴霧器(江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司);RIPA裂解液、BCA蛋白濃度定量試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司);ECL高敏發(fā)光液、蛋白預(yù)染Maker(天能生物科技有限公司);脫脂奶粉(日本W(wǎng)ako公司);SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)(Biosharp生物科技有限公司);β-actin抗體(美國Proteintech公司); ERK1/2、p-ERK1/2、NF-κB p65、JNK、pJNK、p38 MAPK、p-p38MAPK(美國Cell Signaling公司);辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔、山羊抗小鼠及兔抗山羊二抗(南京福麥斯生物技術(shù)有限公司);小鼠TNF-α ELISA試劑盒、小鼠IL-5 ELISA試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2.2 動(dòng)物分組及造模 雌性C57BL/6J小鼠40只,6周齡,購自南京青龍山養(yǎng)殖場，動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(蘇)2017-0001,所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物委員會(huì)批準(zhǔn)(編號(hào):201903A018)。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,將小鼠隨機(jī)分為4組,每組10只,分別為空白組、模型組、黃龍止咳顆粒組和孟魯司特組。用卵清蛋白(OVA)誘導(dǎo)小鼠哮喘模型,分別于第1天和第14天腹腔注射含OVA 20 μg和氫氧化鋁1 mg的致敏溶液0.2 mL。從第20天開始,小鼠使用超聲波噴霧器連續(xù)4 d吸入3%(w/v)霧化OVA 30 min。孟魯司特鈉(1.52 mg·kg-1·d-1)和黃龍止咳顆粒(9.1 g·kg-1·d-1)。從第19天開始[11],每24 h灌胃1次,連續(xù)7 d,該劑量根據(jù)臨床等效劑量換算得到。

1.2.3 組織病理學(xué)檢測 取左側(cè)肺組織放置于4%多聚甲醛溶液中固定,經(jīng)石蠟包埋、切片,對(duì)標(biāo)本進(jìn)行HE染色,鏡下觀察并拍照。

1.2.4 ELISA檢測炎癥因子含量 采集小鼠外周血血清,依據(jù)ELISA試劑盒說明書的方法步驟測定小鼠血清IL-5、TNF-α水平。

1.2.5 qPCR檢測相關(guān)基因表達(dá) 采用qPCR法檢測肺組織中關(guān)鍵靶基因IL-6、TNF、MAPK3、PTGS2、IL-1β、TLR4、MMP9、ICAM1、MPO mRNA的表達(dá),以2-ΔΔCt值表示基因相對(duì)表達(dá)量。引物信息見表1,引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

表1 引物序列

1.2.6 Western blot檢測相關(guān)蛋白表達(dá) 取肺組織冰上剪碎后、裂解,BCA法測定蛋白濃度,進(jìn)行SDS-PAGE電泳,各樣品取40 μg總蛋白上樣電泳,轉(zhuǎn)膜,加入稀釋一抗的P38、p-P38、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK、p-JNK、NF-κB、p-NF-κB、β-actin 抗體,P38、p-P38、NF-κB、p-NF-κB、β-actin 的稀釋比例為1∶1 000,ERK1/2、p-ERK1/2、JNK、p-JNK的稀釋比例為1∶2 000,4 ℃孵育過夜,TBST洗膜后加入HRP標(biāo)記的二抗,37 ℃孵育1 h。ECL顯影,凝膠成像系統(tǒng)分析目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量,目標(biāo)蛋白表達(dá)量通過β-actin進(jìn)行校正。

2 結(jié)果

2.1 黃龍止咳顆粒的潛在活性成分

在TCMSP數(shù)據(jù)庫中設(shè)定OB≥30%、DL≥0.18,對(duì)黃芪、桔梗、麻黃、射干、葶藶子、淫羊藿、魚腥草的有效成分進(jìn)行篩選,在TCMID數(shù)據(jù)庫中檢索地龍、山楂,并結(jié)合文獻(xiàn)[12-14]補(bǔ)充納入黃芪中的黃芪甲苷;桔梗中的桔梗皂苷D;麻黃中的麻黃堿、偽麻黃堿,共得到潛在活性成分175個(gè)。

2.2 潛在靶點(diǎn)預(yù)測

將Swiss數(shù)據(jù)庫中的預(yù)測靶點(diǎn)去重后,共得到藥物靶點(diǎn)1 026個(gè),中藥-成分-靶點(diǎn)統(tǒng)計(jì)見表2。通過OMIM、Disgenet、Genecards、Drugbank數(shù)據(jù)庫得到疾病靶點(diǎn)900個(gè),在Venny2.1在線作圖工具平臺(tái)上分別輸入藥物與疾病的靶點(diǎn),繪制韋恩圖(圖1),兩者取交集后獲得共同靶點(diǎn)153個(gè)。結(jié)果顯示,黃龍止咳顆?？赡芡ㄟ^多個(gè)潛在作用靶點(diǎn)協(xié)同發(fā)揮治療哮喘的作用。

表2 中藥-成分-靶點(diǎn)基本信息統(tǒng)計(jì)表

圖1 藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)韋恩圖

2.3 藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將黃龍止咳顆粒的活性成分與153個(gè)潛在作用靶點(diǎn)輸入Cytoscape軟件,篩除與靶點(diǎn)無交集的孤立成分,繪制網(wǎng)絡(luò)圖(圖2)。Degree排序顯示,在142個(gè)與潛在靶點(diǎn)相互作用的活性成分中,香葉木素(Diosmetin)、芫花素(Genkwanin)、柚皮苷(naringenin)、甘草素(Liquiritigenin)等均能與20個(gè)以上的靶點(diǎn)相連接,推測為黃龍止咳顆粒治療哮喘的主要活性成分。而TNF、MAPK3、PTGS2、MMP9等又能與30個(gè)以上的成分相連接,可能為黃龍止咳顆粒的主要作用靶點(diǎn)。上述網(wǎng)絡(luò)分析體現(xiàn)了黃龍止咳顆粒多成分、多靶點(diǎn)的綜合調(diào)節(jié)特點(diǎn)。

注:◇.疾病;○.靶點(diǎn);□.藥物;△.成分

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

在STRING數(shù)據(jù)庫中錄入153個(gè)藥物-疾病共同靶點(diǎn),得到蛋白相互作用的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系數(shù)據(jù),并使用Cytoscape軟件進(jìn)行可視化分析,構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖(圖3)。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)

通過Degree值排序,選取分值大于平均分的基因作為核心靶點(diǎn),將前30個(gè)靶點(diǎn)使用R 3.6.1繪制條形圖(圖4)。

圖4 基于PPI拓?fù)浞治龅暮诵陌悬c(diǎn)排序

2.5 靶點(diǎn)通路分析

153個(gè)潛在靶點(diǎn)經(jīng)R語言運(yùn)行后可得到GO分析(P<0.05)1 785個(gè)生物學(xué)過程、62個(gè)細(xì)胞組分、120個(gè)分子功能(圖5A),生物過程主要與cAMP信號(hào)傳導(dǎo)、炎癥反應(yīng)、平滑肌收縮等相關(guān);細(xì)胞組分主要涉及免疫突觸、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物等;分子功能主要集中在類固醇激素受體活性、細(xì)胞因子受體、轉(zhuǎn)錄因子活性等方面。KEGG分析(P<0.05)共富集于84條信號(hào)通路(圖5B),主要與炎癥、免疫相關(guān),包括TNF信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、花生四烯酸代謝、cGMP-PKG信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、Th17細(xì)胞分化等。

圖5 GO生物學(xué)過程分析、細(xì)胞組分分析、分子功能分析(A)和KEGG富集分析(B)

2.6 黃龍止咳顆粒對(duì)哮喘模型小鼠肺組織的影響

用HE染色法觀察各組小鼠肺切片,空白組小鼠各級(jí)支氣管及肺泡的結(jié)構(gòu)完整, 無明顯炎癥細(xì)胞浸潤;與空白組相比,模型組氣道周圍有大量浸潤性炎癥細(xì)胞;黃龍止咳顆粒組和孟魯司特組炎癥細(xì)胞浸潤明顯少于模型組。見圖6。

圖6 各組小鼠肺組織病理變化

2.7 黃龍止咳顆粒對(duì)哮喘模型小鼠血清TNF-α、IL-5含量的影響

文獻(xiàn)報(bào)道哮喘小鼠由于炎癥和氣道高反應(yīng)性,血清TNF-α和IL-5的水平通常會(huì)升高[15]。本研究結(jié)果表明,與正常組比較,模型組小鼠血清IL-5、TNF-α含量明顯增高;與模型組比較,黃龍止咳顆粒組和孟魯司特組IL-5、TNF-α含量均明顯降低。見圖7。

注:與空白組比較,###P<0.001;與模型組比較,*P<0.05，**P<0.01,***P<0.001?！纒, n=5。

2.8 黃龍止咳顆粒對(duì)哮喘模型小鼠肺組織靶基因表達(dá)的影響

通過 qPCR 檢測“2.4”中拓?fù)浞治龅玫降那?0名核心靶點(diǎn)的基因表達(dá)情況,結(jié)果提示存在明顯差異性表達(dá)的基因有 MAPK3、TLR4、IL-1β、IL-6、TNF-α、MMP9。見圖8。

注:與空白組比較,#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001;與模型組比較,*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001?！纒, n=3。

2.9 黃龍止咳顆粒對(duì)哮喘模型小鼠肺組織中關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較,模型組中磷酸化關(guān)鍵蛋白的含量以及磷酸化與非磷酸化蛋白的比值均增加;給予黃龍止咳顆粒后,磷酸化關(guān)鍵蛋白含量以及上述比值均出現(xiàn)不同程度的降低。見圖9。

注:與空白組比較,##P<0.01,###P<0.001;與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01?！纒, n=3。

3 討論

本研究篩選出黃龍止咳顆粒的有效成分,并得到該藥治療哮喘的相關(guān)靶點(diǎn)。富集分析結(jié)果顯示TNF信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、花生四烯酸代謝、cGMP-PKG信號(hào)通路等可能為黃龍止咳顆粒治療哮喘的潛在作用通路。

TNF信號(hào)通路通過激活NF-κB和MAPK信號(hào)通路發(fā)揮作用[16-18]。腫瘤壞死因子(TNF-α)是一種可以直接殺傷腫瘤細(xì)胞,對(duì)正常細(xì)胞沒有明顯毒性的細(xì)胞因子[19]。TNF可結(jié)合的受體有2種,分別是TNFR1和TNFR2,均為Ⅰ型跨膜蛋白[20]。TNFR1在大多組織中都可以表達(dá),并且可以通過可溶性三聚體形式將TNF完全激活[21],而TNFR2通常存在于免疫系統(tǒng)中,目前關(guān)于TNF信號(hào)的信息大部分來源于TNFR1[22]。TNFR1信號(hào)傳導(dǎo)誘導(dǎo)許多基因的激活,這些基因主要受2個(gè)不同途徑控制,即NF-κB途徑和MAPK級(jí)聯(lián)途徑[23]。TNFR2信號(hào)傳導(dǎo)激活NF-κB通路,包括JNK通路和依賴PI3K的NF-κB通路[24]。

NF-κB是細(xì)胞內(nèi)重要的核轉(zhuǎn)錄因子,調(diào)節(jié)數(shù)百個(gè)基因的表達(dá),這些基因參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化、炎癥、發(fā)育和凋亡[25]。NF-κB p65為NF-κB轉(zhuǎn)錄因子家族的重要成員,在炎性反應(yīng)中起中心調(diào)控作用[26]。正常生理狀態(tài)下,NF-κB以無活性的形式存在于胞質(zhì)中,當(dāng)受到其他外部抗原刺激后, 被激活的NF-κB轉(zhuǎn)錄入核,調(diào)控下游多種炎癥相關(guān)因子表達(dá),如TNF-α、IL-1β和COX-2等,參與各種炎癥反應(yīng)[27-28]。同時(shí),這些炎癥相關(guān)因子通過正反饋提高NF-κB活性,進(jìn)一步促進(jìn)炎癥因子的產(chǎn)生和釋放,即產(chǎn)生炎癥放大級(jí)聯(lián)反應(yīng)[29-30]。NF-кB在哮喘的發(fā)病機(jī)制和導(dǎo)致急性和慢性炎癥的機(jī)制中發(fā)揮重要作用,是目前哮喘機(jī)制的研究中相對(duì)較多的通路,其與哮喘氣道炎癥及氣道重塑關(guān)系密切[31-33]。PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鏊玫年P(guān)鍵靶點(diǎn)中MMP9、TNF及IL-1β均與NF-κB信號(hào)通路有關(guān), MMP9是氣道重塑發(fā)生的關(guān)鍵酶, 其啟動(dòng)因子上含有NF-κB的結(jié)合位點(diǎn)[34]。

有絲分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)是一族在真核生物中非常保守的絲/蘇氨酸蛋白激酶,可參與細(xì)胞的生長增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)或死亡[35]。MAPK信號(hào)通路在哺乳動(dòng)物類細(xì)胞中主要由p38信號(hào)通路、ERK信號(hào)通路和JNK信號(hào)通路組成。MAPK在許多與炎癥相關(guān)的細(xì)胞功能中起著重要作用,包括基因表達(dá)、細(xì)胞分化、生長和凋亡。在調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)中發(fā)揮著重要作用,該通路的激活可促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子的生成而加劇炎癥反應(yīng)[36]。同時(shí),NF-κB作為P38 MAPK、ERK1/2、JNK的重要下游信號(hào)因子,被激活后可誘導(dǎo)NF-κB活化,從而介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。目前已有研究表明,MAPK的3個(gè)亞家族都參與哮喘的發(fā)病機(jī)理,并且在哮喘的動(dòng)物模型中,3個(gè)MAPK成員的磷酸化狀態(tài)/活性都被上調(diào)[37]。因此,抑制MAPK通路的活性已經(jīng)成為一種用于逆轉(zhuǎn)哮喘炎癥和重塑的有力策略。

為了證實(shí)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測結(jié)果,本研究選擇對(duì)MAPK和NF-κB信號(hào)通路進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,結(jié)果顯示黃龍止咳顆粒中的黃芪、山楂、淫羊藿等主要活性成分可能通過TNF、MAPK、NF-κB等信號(hào)通路作用于TNF、MAPK3、MMP9等關(guān)鍵靶點(diǎn),發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子活性、酶活性、受體活性等生物學(xué)作用,從而逆轉(zhuǎn)哮喘炎癥以治療哮喘。通過比較我們發(fā)現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測與實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果均證實(shí)了TNF信號(hào)通路在黃龍止咳顆粒治療哮喘中發(fā)揮的作用,兩者具有較高的一致性;同時(shí),通過對(duì)部分拓?fù)浞治龅玫降暮诵陌悬c(diǎn)進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn),與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測的結(jié)果基本一致,部分核心靶點(diǎn)如PTGS2、ICAM1沒有表現(xiàn)出明顯差異。

綜上所述,本研究證實(shí)黃龍止咳顆粒可以改善哮喘小鼠的氣道重塑和氣道高反應(yīng),其機(jī)制可能是抑制TNF信號(hào)通路,從而進(jìn)一步抑制MAPK和NF-κB信號(hào)通路有關(guān),初步驗(yàn)證了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析結(jié)果,肯定了其在治療哮喘方面的應(yīng)用價(jià)值,可供臨床用藥參考。