陳映丹 張揚(yáng) 夏嬙 孫虹霞

（1. 遵義醫(yī)科大學(xué)珠海校區(qū) 免疫與病原生物學(xué)教研室，珠海 519041；2. 中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所 中國(guó)科學(xué)院熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510301）

基因編輯技術(shù)是指在基因水平上，對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行精確插入、刪除和修飾，從而改變基因的結(jié)構(gòu)與功能的生物技術(shù)。近年來(lái)，基因編輯技術(shù)已從鋅指核酸酶（zinc finger nuclease，ZFN）技術(shù)、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（ranscription activator-like effector nucleases，TALEN）技術(shù)，發(fā)展到成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列CRISPR/Cas（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated）核酸酶系統(tǒng)。其中，ZFN和TALEN技術(shù)依賴(lài)于DNA序列與蛋白質(zhì)模板的特異性結(jié)合，設(shè)計(jì)和組裝非常繁瑣，且成本較高。相比之下，CRISPR/Cas技術(shù)作為一種新興的基因組編輯工具，能夠引導(dǎo)gRNA對(duì)DNA的識(shí)別及編輯，具有成本低、設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、高效、特異的顯著優(yōu)勢(shì)。

微藻作為初級(jí)生產(chǎn)者［1］，種類(lèi)繁多，約有5萬(wàn)余種，且分布廣泛，生存條件多樣化，甚至可在高溫、高鹽等極端條件下生存。目前，其在食品、工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域均有應(yīng)用［2］，具有改善免疫功能、預(yù)防心血管疾病、調(diào)節(jié)土壤理化性能、生產(chǎn)生物柴油、降解重金屬等功效［3-10］。另一方面，隨著人口的增長(zhǎng)，資源儲(chǔ)備的枯竭，以及土地資源和自然環(huán)境資源等的不可再生性，使得人們面臨著資源短缺和環(huán)境污染的巨大挑戰(zhàn)，對(duì)微藻進(jìn)行遺傳改良，以尋找可替代的資源，成為了人們應(yīng)對(duì)挑戰(zhàn)的重要舉措之一。然而，野生微藻因其自身碳固定率、油脂積累率和產(chǎn)氫效率都較低，加之商業(yè)成本高昂等原因，嚴(yán)重影響了其大規(guī)模應(yīng)用。因此，尋找并利用一種強(qiáng)大、廉價(jià)、精確的基因編輯技術(shù)，建立更加經(jīng)濟(jì)綠色的生產(chǎn)工藝，是克服這些問(wèn)題并實(shí)現(xiàn)后期大規(guī)模生產(chǎn)的重要策略，其中，CRISPR系統(tǒng)的優(yōu)越性，無(wú)疑可為微藻的遺傳改良和應(yīng)用提供重要的支持。

鑒于此，本文在簡(jiǎn)要介紹CRISPR/Cas基因編輯技術(shù)的發(fā)展歷程的基礎(chǔ)上，討論了在微藻中應(yīng)用較為成熟的Cas9和Cpf1兩種系統(tǒng)的不同特征，著重闡述了CRISPR技術(shù)在微藻領(lǐng)域的發(fā)展方向和應(yīng)用，并探討了CRISPR基因編輯技術(shù)在微藻生物資源開(kāi)發(fā)利用上的發(fā)展前景，以期為CRISPR/Cas系統(tǒng)在微藻基因編輯的相關(guān)研究提供參考。

1 CRISPR/Cas基因編輯技術(shù)概述

1.1 CRISPR/Cas基因編輯技術(shù)的發(fā)展歷程

CRISPR/Cas可通過(guò)特異性RNA引導(dǎo)Csa蛋白對(duì)DNA進(jìn)行靶向切割，是迄今為止已知的原核生物中唯一的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)。自1987年，Ishino等［11］在研究大腸桿菌堿性磷酸酶同工酶轉(zhuǎn)化時(shí)，發(fā)現(xiàn)了串聯(lián)的、間隔的短回文重復(fù)序列，并在其他細(xì)菌中得到鑒定［12-17］。但直到2002年，才正式將存在于細(xì)菌和古細(xì)菌中的有規(guī)律的重復(fù)序列命名為成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列CRISPR，并首次發(fā)現(xiàn)在其附近還有CRISPR相關(guān)基因Cas［18］。之后，西班牙學(xué)者M(jìn)ojica等［19］發(fā)現(xiàn)CRISPR間隔序列與噬菌體和外來(lái)質(zhì)粒序列具有同源性，推測(cè)CRISPR可能與細(xì)菌的免疫防御有關(guān)聯(lián)。隨后，Barrangou等［20］證明了CRISPR/Cas系統(tǒng)參與了細(xì)菌對(duì)噬菌體免疫防御作用的功效。2008年和2010年，CRISPR的干擾工作［21］及其干擾機(jī)制［22］分別得到了揭示。此時(shí)，科研人員已經(jīng)對(duì)CRISPR/Cas系統(tǒng)的作用機(jī)制有了基本了解（圖1）。

圖1 CRISPR研究發(fā)展過(guò)程時(shí)間線(xiàn)Fig. 1 The time line of the CRISPR development process

2012年，美國(guó)Emmanuelle和Jennifer實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)嗜熱鏈球菌CRISPR/Cas系統(tǒng)的Cas9-crRNA復(fù)合物在體外引入了DNA特定位點(diǎn)的雙鏈斷裂，該斷裂序列可與crRNA互補(bǔ)，證實(shí)Cas9-crRNA復(fù)合物作為由RNA引導(dǎo)的核酸內(nèi)切酶，具有識(shí)別目標(biāo)序列和切割DNA的功能［23-24］。2013年，張鋒團(tuán)隊(duì)首次使用CRISPR/Cas9工具在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行了有效的基因組編輯［25］。自此，使用CRISPR/Cas9敲除靶基因逐漸成為生物科技領(lǐng)域的熱門(mén)研究技術(shù)，為基因功能研究、動(dòng)植物育種和生物量產(chǎn)率增加提供了新的技術(shù)支持。

1.2 CRISPR/Cas基因編輯技術(shù)的分類(lèi)

CRISPR系統(tǒng)包括一段成簇的短回文重復(fù)序列和一系列Cas蛋白編碼基因，如Cas 1、Cas 2、Cas 4和效應(yīng)蛋白Cas 9、Cpf 1等，進(jìn)一步細(xì) 化，其可被分為2大類(lèi)、6種類(lèi)型和33個(gè)子類(lèi)型（圖2）［26］。其中，Class I類(lèi)系統(tǒng)包括type I、type III以及type Ⅳ，依賴(lài)于多亞基蛋白質(zhì)復(fù)合物，可利用幾種Cas蛋白和crRNA形成效應(yīng)復(fù)合物；Class II類(lèi)系統(tǒng)包括type II、type V以及type VI，僅使用單一效應(yīng)蛋白，利用大量的單組分Cas蛋白與crRNA結(jié)合以介導(dǎo)干擾過(guò)程。目前，由于克隆及在宿主細(xì)胞傳遞的便利性，Class II類(lèi)效應(yīng)子核酸酶應(yīng)用更為廣泛，而type II的CRISPR/Cas9系統(tǒng)和type V的CRISPR/Cpf 1系統(tǒng)，是目前研究最深入、應(yīng)用最廣泛的兩種類(lèi)型（表1）。

表1 Cas9和Cpf1的不同特征Table 1 Distinct characteristics of Cas9 and Cpf1

1.2.1 依賴(lài)于Cas9的CRISPR基因編輯 化膿性鏈球菌Cas9核酸酶（SpCas9）是在植物、動(dòng)物和微藻中進(jìn)行基因組編輯最常用的Cas9變體。CRISPR/Cas9免疫防御系統(tǒng)主要包含兩部分，引導(dǎo)RNA（gRNA）和Cas9蛋白。gRNA可結(jié)合到一個(gè)特定的目標(biāo)DNA序列，并通過(guò)一個(gè)簡(jiǎn)短的DNA序列，鄰近原間隔相鄰基序（protospacer adjacent motif，PAM）定位，通常是“NGG”［27］。由于 PAM 序列位于外來(lái)的 DNA 的原始間隔區(qū)旁邊，不在基因組 CRISPR 基因座中的間隔區(qū)旁邊，因此 PAM 有助于區(qū)分自身和非自身 DNA，從而防止自身免疫的產(chǎn)生。Cas9具有核酸酶活性，負(fù)責(zé)切割DNA雙鏈。當(dāng)形成gRNA-Cas9復(fù)雜形式，Cas9在PAM序列前的3個(gè)堿基點(diǎn)進(jìn)行雙鏈切割，主要產(chǎn)生平末端［24］；切割點(diǎn)通常經(jīng)過(guò)非同源端連接（（non-homologous end joining，NHEJ）修復(fù)，這種連接通常容易出錯(cuò)，導(dǎo)致切割點(diǎn)插入或刪除，而這種突變通常會(huì)導(dǎo)致移碼突變，影響蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄翻譯，從而破壞基因的功能。

1.2.2 依賴(lài)于Cpf1核酸酶的CRISPR基因編輯 2015年，張峰團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)了CRISPR系統(tǒng)新的核酸酶Cas12a（后期更改命名為Cpf1）［28］。CRISPR/Cpf1系統(tǒng)與Cas9系統(tǒng)在功能原理上相似，但與Cas9系統(tǒng)相比，存在著以下差別。首先，Cpf1相關(guān)的CRISPR陣列在轉(zhuǎn)錄為成熟的crRNA的過(guò)程中，無(wú)需tracrRNA和RNase III參與；其二，Cas12識(shí)別富含T的更長(zhǎng)的PAM序列“TTTN”，Cas9識(shí)別富含G的PAM序列“NGG”；其三，Cpf1蛋白切割產(chǎn)生了黏性末端［28］。

與Cas9系統(tǒng)相比，CRISPR/Cpf1系統(tǒng)更具有一些優(yōu)勢(shì)［29］，主要表現(xiàn)Cpf1可在不需要tracrRNA的特性的條件下更簡(jiǎn)單地制備指導(dǎo)RNA，且Cpf1具有的單個(gè)核酸酶結(jié)構(gòu)域（RuvC）體積比Cas9小，編輯效率更準(zhǔn)確有效；Cpf1蛋白切割產(chǎn)生的黏性末端，有利于目的基因利用非同源重組的方法插入位點(diǎn)；Cpf1識(shí)別更長(zhǎng)的原間隔子相鄰基序（PAM），減少了其在富含GC的基因組上被誤讀的機(jī)會(huì)，從而導(dǎo)致靶標(biāo)突變效率大大提高［29］。在PAM識(shí)別后，Cpf1將目標(biāo)DNA切割到PAM位點(diǎn)的下游更遠(yuǎn)的位置，以使其在非同源末端連接過(guò)程中得以保留。而在Cas9中，PAM位點(diǎn)靠近切割位點(diǎn)通常會(huì)導(dǎo)致其破壞，從而排除了之后的編輯工作。CRISPR/Cpf1基因編輯可將目標(biāo)基因重新定位以進(jìn)行重復(fù)編輯，從而提高了目標(biāo)效率。

1.2.3 CRISPR基因調(diào)控 CRISPR干擾和CRISPR激活 CRISPR/Cas 系統(tǒng)還可通過(guò)催化失活的 DNasedead Cas（dCas）變體進(jìn)行基因調(diào)控，用于CRISPR干 擾（CRISPR interference，CRISPRi）和CRISPR激活（CRISPR activation，CRISPRa）。如果Cas9的兩個(gè)蛋白結(jié)構(gòu)域（HNH和RucV）失活，即可突變?yōu)橐粋€(gè)保留了靶向DNA結(jié)合能力而無(wú)催化活性的Cas9蛋白（dCas9）［30-31］。dCas9是調(diào)節(jié)目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄水平的工具，基因抑制的程度可以通過(guò)調(diào)節(jié)dCas9的表達(dá)或調(diào)節(jié)gRNA的結(jié)合位置來(lái)控制。為了提高效率，dCas9蛋白通常與各種轉(zhuǎn)錄抑制因子（如KRAB）或者轉(zhuǎn)錄激活因子（如VP64）融合，使目標(biāo)基因在雙重效應(yīng)下受到最大的抑制或上調(diào)。此外，與傳統(tǒng)的基因組編輯方法相比，使用CRISPRi造成的抑制是可逆的過(guò)程，甚至可以同時(shí)調(diào)節(jié)多個(gè)靶基因的表達(dá)。基于此，CRISPRi具有發(fā)展為一種操縱和修飾代謝途徑關(guān)鍵基因工具的潛能。

2 CRISPR/Cas基因編輯技術(shù)在微藻中的 應(yīng)用

作為一種新興的生物技術(shù)工具，CRISPR基因編輯技術(shù)在生物的基因功能研究，以及動(dòng)植物品種如水稻、高粱、小麥、大豆和玉米等的遺傳改造等方面展現(xiàn)出了廣闊的應(yīng)用前景［32-37］。隨著技術(shù)的成熟和基因組測(cè)序成本的降低，CRISPR技術(shù)在微藻上的應(yīng)用也得到了快速發(fā)展。據(jù)報(bào)道，CRISPR技術(shù)在微藻中的應(yīng)用最早是在模式生物萊茵衣藻中實(shí)現(xiàn)的［38］，隨著萊茵衣藻［39］和小球藻［40］等藻類(lèi)基因組測(cè)序的完成，明確的遺傳背景更有力地推動(dòng)了其在衣藻、藍(lán)藻等多種微藻基因工程中的研究和應(yīng)用。將CRISPR技術(shù)應(yīng)用于微藻中，不僅可證明特定基因的功能，開(kāi)發(fā)具有工業(yè)性狀的菌株，而且與其他工程核酸酶相比，還具有高效率，高準(zhǔn)確性和簡(jiǎn)便性的特性。

2.1 衣藻

對(duì)模式藻萊茵衣藻的基因工程研究早在幾十年前就開(kāi)始了［41］。萊茵衣藻具有單細(xì)胞形態(tài)，培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，可自養(yǎng)、異養(yǎng)、混合營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)等特征，是首批對(duì)其線(xiàn)粒體和葉綠體基因組進(jìn)行測(cè)序的藻類(lèi)之一［42］。同時(shí)，許多異源轉(zhuǎn)基因已在衣藻中表達(dá)，包括許多抗生素抗性標(biāo)記、報(bào)告基因等，這些工具的開(kāi)發(fā)對(duì)研究基因表達(dá)和篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞至關(guān)重要。這些特征使得其作為早期研究基因編輯技術(shù)的模型藻類(lèi)。

自2014年CRISPR/Cas9系統(tǒng)首次被應(yīng)用在萊茵衣藻的基因編輯中，Jiang等［43］也成功將Cas9和sgRNA轉(zhuǎn)入衣藻細(xì)胞進(jìn)行了短暫表達(dá)，并成功敲除了萊茵衣藻中內(nèi)源的雷帕霉素敏感性基因FKB12。然而，在超過(guò)109個(gè)細(xì)胞的16次獨(dú)立轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中，僅有一個(gè)帶有雷帕霉素抗性的突變體菌落產(chǎn)生，表現(xiàn)出極低的轉(zhuǎn)化效率，并提示Cas9潛在毒性的存在。為了避免Cas9載體引起的細(xì)胞毒性和脫靶效應(yīng)，2016年，Shin等［44］在體外合成Cas9-gRNA核糖核蛋白復(fù)合物（RNP），并通過(guò)電穿孔方法直接將其轉(zhuǎn)化至萊茵衣藻中，成功在MAA7，CpSRP43和Ch1M三個(gè)不同基因座上獲得CRISPR/Cas9誘導(dǎo)的突變，與載體驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)化相比，RNP方法對(duì)基因沉默的效率提高了100倍，而且無(wú)非靶向效應(yīng)。

作為具有多種代謝工程技術(shù)和工具的模式生物，萊茵衣藻可用于黃斑色素的工業(yè)生產(chǎn)。葉黃素和玉米黃質(zhì)是膳食類(lèi)胡蘿卜素，可降低年齡相關(guān)性黃斑變性，在維持眼睛健康方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Baek等［45］使用預(yù)組裝的RNP遞送方法敲除玉米黃質(zhì)環(huán)氧化酶（zeaxanthin epoxidas，ZEP）基因，發(fā)現(xiàn)ZEP敲除突變體可持續(xù)產(chǎn)生玉米黃質(zhì)，光合產(chǎn)量也得到了大幅度提高［46］。再者，由于Cas9蛋白只具有瞬時(shí)活性并隨后被細(xì)胞內(nèi)源蛋白酶降解，因此RNP也減少了脫靶效應(yīng)和細(xì)胞毒性。

2017年，Cpf1核酸酶第一次在萊茵衣藻進(jìn)行了試驗(yàn)，通過(guò)將Cpf1 RNP與單鏈寡聚脫氧核苷酸（ssODNs）作為DNA修復(fù)模板，在萊茵衣藻中實(shí)現(xiàn)了同源定向的DNA替代，其共轉(zhuǎn)染可達(dá)到10%的精確效率，且Cpf1 RNP單獨(dú)轉(zhuǎn)化FKB12基因的靶向效率與Cas9 RNP相似。同年，研究人員首次使用CRISPRi系統(tǒng)用于萊茵衣藻中脂質(zhì)的基因調(diào)控［47］。磷酸烯醇丙酮酸羧化酶（phosphoenolpyruvate carboxylase，PEPC）是脫羧酶家族中的一種關(guān)鍵酶，它與磷酸烯醇丙酮酸（Phosphoenolpyruvate，PEP）形成草酰乙酸直接相關(guān)，草酰乙酸流入三羧酸循環(huán)以進(jìn)行蛋白質(zhì)合成。通過(guò)下調(diào)PEPC1編碼蛋白的表達(dá)，調(diào)節(jié)碳在脂質(zhì)中的流向，成功提高了萊茵衣藻的生物量和脂質(zhì)積累速率。MAA7是編碼色氨酸合酶 β-亞基的基因，無(wú)功能的MAA7突變體可以在含有5-FI色氨酸類(lèi)似物的培養(yǎng)基上進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)缺陷型選擇。為解決低下的基因編輯效率，2020年，研究者選擇研究MAA7基因，使用預(yù)先組裝的RNP復(fù)合體，成功靶向敲除萊茵衣藻MAA7基因［48］，通過(guò)MAA7突變體的選擇和鑒定，評(píng)估MAA7的基因編輯效率［44］；通過(guò)在RNP上添加雙鏈HDR模板，評(píng)估靶向MAA7的HDR敲入效率，闡明了優(yōu)化RNP復(fù)合物的濃度和轉(zhuǎn)化方案對(duì)于實(shí)現(xiàn)高效率的靶向敲除的重要性；同樣的，重組位點(diǎn)和HDR模板的濃度的優(yōu)化對(duì)于實(shí)現(xiàn)高效率的HDR介導(dǎo)的敲入也至關(guān)重要［48］。同時(shí)，該優(yōu)化方法也可以擴(kuò)展到其他具有工業(yè)潛力的藻類(lèi)。

2.2 藍(lán)藻

藍(lán)藻以其能利用太陽(yáng)光和CO2，且遺傳操作適應(yīng)性好的特性，成為了生產(chǎn)生物燃料和生物衍生化學(xué)品的理想底盤(pán)生物［49-50］。然而，藍(lán)藻基因組的修飾由于部分藍(lán)藻是寡倍體或多倍體而變得耗時(shí)和復(fù)雜。直到CRISPR/Cas技術(shù)對(duì)基因組編輯方式的改變，使得藍(lán)藻的代謝工程有了新的突破。

2016年，研究者第一次在藍(lán)藻中使用了CRISPR/Cas9系統(tǒng)。nblA 基因是聚球藻 2973 中藻膽體降解的必需元素。野生型聚球藻 2973 菌株在缺乏硝酸鹽的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)表現(xiàn)出黃色漂白效果，但nblA刪除菌株具有明顯的非漂白表型，并在相同條件下保持綠色。通過(guò)選擇敲除nblA基因，可觀(guān)地表明了在藍(lán)藻中瞬時(shí)Cas9表達(dá)可以實(shí)現(xiàn)基因編輯，并且Cas9的存在提高了編輯效率［51］。隨后，Li及其同事通過(guò)敲除glgC基因，使藍(lán)藻中的大部分碳通量從糖原轉(zhuǎn)移到琥珀酸酯，從而產(chǎn)生更高水平琥珀酸酯的glgC缺失突變體［52］。但也發(fā)現(xiàn)高濃度的Cas9具有毒性，可降低藍(lán)藻細(xì)胞的生存力，從而促使人們探索通過(guò)使用新的Cpf1核酸酶來(lái)克服這一障礙。2016年，Ungerer研究團(tuán)隊(duì)［53］對(duì)Cpf1和Cas9兩種蛋白的毒性評(píng)估結(jié)果顯示，Cpf1的毒性顯著低于Cas9，Cpf1是藍(lán)藻基因組編輯的較為合適的核酸酶，并首次通過(guò)2種藍(lán)藻的缺失突變、點(diǎn)突變以及插入突變，研究了Cpf1系統(tǒng)的多功能性［53］。

基因的敲除或敲入有時(shí)會(huì)損害宿主生物的生存力，但CRISPRi為藍(lán)藻工程學(xué)提供了另一種可行的方法，該方法依賴(lài)于無(wú)酶活性的dCas9，這對(duì)不能刪除而只能降低其表達(dá)的必需基因的研究尤其重要。Yao等［54］首次在藍(lán)細(xì)菌中引入了CRISPRi系統(tǒng)通過(guò)下調(diào)phaE和glgC基因，降低多羥基丁酸酯和糖原的產(chǎn)生，抑制phaE基因有效消除了集胞藻屬中的聚羥基丁酸酯（polyhydroxybutyrate，PHB）的合成，抑制glgC基因可使糖原合成大幅度降低。同樣的，Huang等［55］通過(guò)抑制glgC、sdhA和sdhB基因，下調(diào)糖原合成，使琥珀酸水平提高了12.5倍。Higo及其同事采用CRISPRi技術(shù)，通過(guò)抑制魚(yú)腥藻glnA基因不僅可高效生產(chǎn)銨鹽，還可控制細(xì)胞以誘導(dǎo)劑依賴(lài)的方式開(kāi)啟和關(guān)閉銨的產(chǎn)生［56］。然而，研究人員在2018年發(fā)現(xiàn)dCas9可改變大腸桿菌的形態(tài)，使其成異常的絲狀形態(tài)，推測(cè)dCas9影響了細(xì)菌的細(xì)胞分裂，并對(duì)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了影響［57］。這促使了研究者對(duì)不同Cas蛋白CRISPR干擾系統(tǒng)開(kāi)展了進(jìn)一步的研究。甲基-赤蘚糖醇-4-磷酸（methylerythritol-4-phosphate，MEP）途徑中關(guān)鍵酶的過(guò)度表達(dá)和融合導(dǎo)致藍(lán)藻光合角鯊烯的大量生產(chǎn)，首次藍(lán)藻中使用CRISPR/dCpf1系統(tǒng)，有效阻止了轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)，通過(guò)抑制acnB、cpcB2關(guān)鍵基因，提高了光合角鯊烯的產(chǎn)量［58］。由此可見(jiàn)，dCpf1介導(dǎo)的CRISPRi系統(tǒng)極大地促進(jìn)了藍(lán)藻代謝工程的研究，是提高藍(lán)藻生物量切實(shí)可行的技術(shù)和方法。

CRISPR的另一個(gè)功效是多路復(fù)用，即多個(gè)基因可以并行編輯而不是單獨(dú)靶向。Kaczmarzyk等［59］的研究中運(yùn)用CRISPR多路復(fù)用的作用，將脂肪?；匦露ㄏ蛑林敬己铣桑瑫r(shí)抑制了6個(gè)編碼消耗?；鵄CP途徑的酶的天然基因，使C18脂肪醇生產(chǎn)率提高了3倍左右。多路復(fù)用開(kāi)辟了應(yīng)用組合方法優(yōu)化藍(lán)藻的可能性，反過(guò)來(lái)又使藍(lán)藻代謝過(guò)程得到更大更廣的覆蓋。總之，CRISPR技術(shù)的出現(xiàn)及廣泛應(yīng)用無(wú)疑加速了藍(lán)藻代謝工程的研究和進(jìn)展。

2.3 硅藻

硅藻是單細(xì)胞真核生物，在全球海洋中碳和硅的循環(huán)利用中起著至關(guān)重要的作用。同時(shí)，由于脂質(zhì)的高水平積累，硅藻被認(rèn)為是生物燃料生產(chǎn)的重要候選者，在藥物，化妝品，營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑和生物燃料中具有潛在應(yīng)用價(jià)值。因此，了解CRISPR技術(shù)在硅藻工業(yè)上的開(kāi)發(fā)應(yīng)用也極為必要。

2016年，Nymark等［60］首次在硅藻中報(bào)道了基于Cas9的基因組編輯技術(shù)，通過(guò)轉(zhuǎn)化Cas9-gRNA質(zhì)粒，對(duì)8個(gè)突變體的高光敏性生長(zhǎng)測(cè)定和qRT PCR進(jìn)行了表征，獲得了生長(zhǎng)緩慢，對(duì)高光的敏感性增強(qiáng)的CpSRP54突變菌株。同年，Hopes等［61］使用兩個(gè)sgRNAs誘導(dǎo)脲酶基因的精確刪除，證明在硅藻Thalassiosira pseudonana進(jìn)行基因編輯的可行性。

然而，CRISPR / Cas9技術(shù)在硅藻中的優(yōu)化改進(jìn)仍在進(jìn)行中，以求突變型菌株的生產(chǎn)不被時(shí)間、步驟、脫靶等限制住。2018年，Stukenberg等［62］通過(guò)優(yōu)化CRISPR/Cas9載體構(gòu)建，簡(jiǎn)化了篩選步驟，并誘導(dǎo)了單等位基因和雙等位基因突變。此外，通過(guò)CRISPR / Cas9切口酶進(jìn)行基因組編輯是另一種改良方法。2020年，在海洋硅藻中使用Cas9切口酶進(jìn)行基因組編輯誘變，靶向TpθCA3基因編輯［63］。通過(guò)這種修飾，使得Cas9誘變中潛在的脫靶頻率被最小化。同樣的，Moosburner等［64］通過(guò)將Cas9轉(zhuǎn)錄融合到2A肽的選擇標(biāo)記上，為Cas9基因選擇抗生素，減少了生產(chǎn)和驗(yàn)證突變細(xì)胞系的時(shí)間。然而，Cas9切口酶僅適用于少數(shù)幾種模式生物，在微藻的應(yīng)用報(bào)道較少。

2.4 其他

微藻具有巨大的物種多樣性，在生態(tài)系統(tǒng)、水產(chǎn)養(yǎng)殖以及生物能源，糧食和飼料部門(mén)中都發(fā)揮著重要作用。除了上述藻類(lèi)，CRISPR技術(shù)也在不斷地的探索性地應(yīng)用在其他非模式藻類(lèi)上。2016年，以工業(yè)產(chǎn)油微藻Nannochloropsis oceanica菌株IMET1為模型，建立了一種有效的基于CRISPR / Cas的微藻靶向基因敲除方法［65］，從靶向基因敲除的突變菌株中獲得了大約1/1 000-1/100的成功率，比之前報(bào)道的［43］編輯效率高了幾個(gè)數(shù)量級(jí)。2017年，Ajjawi等［66］通過(guò)刪除在脂質(zhì)生物合成中充當(dāng)負(fù)調(diào)節(jié)劑的轉(zhuǎn)錄因子，使Nannochloropsis gaditana脂質(zhì)產(chǎn)量增加了一倍。2019年，CRISPR / Cas9系統(tǒng)首次應(yīng)用于小球藻FSP-E中，通過(guò)編輯fad3基因，達(dá)到脂質(zhì)積累增加的結(jié)果［67］。盡管目前應(yīng)用在非模式藻類(lèi)的種類(lèi)還不夠多，但隨著研究的深入，相信在不久的未來(lái)，CRISPR/Cas技術(shù)在藻類(lèi)的潛力將得到更充分的發(fā)揮和利用（表2）。

表2 CRISPR技術(shù)在微藻中的應(yīng)用研究Table 2 Research on the application of CRISPR technology in microalgae

3 轉(zhuǎn)化方法

植物的轉(zhuǎn)化技術(shù)滯后于動(dòng)物，而微藻的轉(zhuǎn)化又是在植物轉(zhuǎn)化技術(shù)基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)的。正如Altpeter所指出的，成功的基因編輯是基于生物體的轉(zhuǎn)化技術(shù)的［68］。因此，此部分總結(jié)了微藻的轉(zhuǎn)化技術(shù)。

微藻轉(zhuǎn)化技術(shù)的滯后，可能與藻體細(xì)胞較小，以及存在保護(hù)細(xì)胞的細(xì)胞壁阻礙有關(guān)。藻類(lèi)細(xì)胞壁是阻止外來(lái)DNA通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入的物理屏障，因此，許多轉(zhuǎn)化的方案依賴(lài)于細(xì)胞壁缺陷的衣藻細(xì)胞。目前，微藻常用的核轉(zhuǎn)化方法有粒子槍介導(dǎo)的生物轉(zhuǎn)化、玻璃珠方法和電穿孔等3種。1988 年首次使用包被DNA的鎢微粒轟擊萊茵衣藻細(xì)胞葉綠體［69］。粒子槍介導(dǎo)的生物轉(zhuǎn)化是利用微粒輸送系統(tǒng)，將含有外源基因的金屬微粒輸送整合到藻類(lèi)細(xì)胞中，從而越過(guò)了細(xì)胞壁的生理屏障。但這種方法效率低下，獲得的轉(zhuǎn)化體少且需要專(zhuān)門(mén)的設(shè)備。玻璃珠核轉(zhuǎn)化是一種借助質(zhì)粒和玻璃珠的存在，攪動(dòng)細(xì)胞壁缺陷的衣藻細(xì)胞的方法［70］。玻璃珠方法僅適用于沒(méi)有細(xì)胞壁的菌株，否則會(huì)限制轉(zhuǎn)入細(xì)胞核的DNA量。雖然玻璃珠方法操作簡(jiǎn)單，不需要專(zhuān)門(mén)的設(shè)備，但它的限制性是需要在轉(zhuǎn)化前用自溶素處理以去除菌株的細(xì)胞壁，使這種缺陷的衣藻細(xì)胞很難雜交，進(jìn)而增加了遺傳分析的困難。盡管后期改良的玻璃珠技術(shù)（碳化硅代替玻璃珠）可以轉(zhuǎn)化具有細(xì)胞壁的微藻［71］，但這種技術(shù)形成的毒副產(chǎn)物仍需謹(jǐn)慎處理。

電穿孔是使用最廣泛的轉(zhuǎn)染方法之一，因?yàn)樗哂泻芨叩男屎捅憷?。電穿孔轉(zhuǎn)化方法，可以用一個(gè)或幾個(gè)DNA分子將具有完整壁的細(xì)胞瞬時(shí)或穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，不需要特殊的細(xì)胞壁缺陷菌株或去除細(xì)胞壁的處理方法［72］，也不會(huì)產(chǎn)生有毒的副產(chǎn)物。電脈沖在細(xì)胞的質(zhì)膜上形成瞬時(shí)孔后，緊鄰質(zhì)膜的帶電分子被嵌入膜中，幾小時(shí)后，帶電分子會(huì)完全穿過(guò)質(zhì)膜并進(jìn)入細(xì)胞，是一種快速簡(jiǎn)便的方法。此外，電穿孔技術(shù)也是建立篩選目標(biāo)表型的突變體文庫(kù)的簡(jiǎn)便方法，其產(chǎn)生的突變體數(shù)量比玻璃珠方法高100倍左右，這是其他方法無(wú)法比擬的。然而，其所需的設(shè)備也比較昂貴。

4 編輯效率的提高

合成生物學(xué)時(shí)代，依賴(lài)于藻類(lèi)基因工程有望生產(chǎn)如色素、油和脂類(lèi)、甾醇、淀粉、多糖化合物等新型代謝物，在其中，CRISPR/Cas 系統(tǒng)已逐漸成為主要的基因組編輯工具。目前，提高微藻基因編輯效率可從兩方面入手：（1）合適的轉(zhuǎn)化方法；（2）CRISPR/Cas 系統(tǒng)引入微藻的模式。

在藻類(lèi)物種中利用 CRISPR/Cas 的主要限制之一是缺乏高效和穩(wěn)健的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。轉(zhuǎn)化方法的選擇極大地影響了目標(biāo)宿主工程策略的整體有效性。電穿孔是首選方法，其增加了 DNA 傳遞的數(shù)量，缺點(diǎn)在于由于機(jī)械損傷導(dǎo)致細(xì)胞死亡率較高。除了上述3種傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)化方法，另一種克服細(xì)胞壁障礙的策略是利用農(nóng)桿菌或者細(xì)菌結(jié)合來(lái)介導(dǎo)轉(zhuǎn)化使 DNA 轉(zhuǎn)移通過(guò)細(xì)胞壁。將環(huán)狀自我復(fù)制附加型質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到硅藻中，細(xì)菌結(jié)合方法顯示出在某些微藻物種中進(jìn)行染色體整合的前景［73］。此外，藍(lán)藻在沒(méi)有表面活性劑的情況下可從周?chē)h(huán)境中自然吸收 DNA［74］。除了這些經(jīng)典方法之外，基于細(xì)胞穿透肽、細(xì)胞穿透聚合物、金屬有機(jī)框架、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化已在非藻類(lèi)宿主中得到證實(shí)［75］，這些尚未廣泛應(yīng)用于藻類(lèi)的新興轉(zhuǎn)化技術(shù)可能為DNA表達(dá)構(gòu)建體傳遞到藻類(lèi)基因組開(kāi)辟新的途徑。總體而言，DNA 遞送和細(xì)胞壁透化的方法根據(jù)宿主生物體和目標(biāo)細(xì)胞區(qū)室（細(xì)胞器或細(xì)胞核）而異，不存在一刀切的轉(zhuǎn)化策略。每個(gè)宿主生物都有自己的特性，尤其是細(xì)胞壁的存在與否的情況。大多數(shù)藻類(lèi)系統(tǒng)的主要限制是在轉(zhuǎn)化中提供多組轉(zhuǎn)基因，而這些新型轉(zhuǎn)化技術(shù)是否有助于在單個(gè)轉(zhuǎn)化步驟中穩(wěn)定轉(zhuǎn)化包含多基因途徑的較大 DNA 片段還有待觀(guān)察。

另一個(gè)決定編輯效率的重要因素是 CRISPR/Cas系統(tǒng)引入微藻的模式。最常用的方法是基于載體的傳遞，Cas9 與sgRNA 一起置于啟動(dòng)子和終止子的控制之下。生物之間缺乏相容性是合成生物學(xué)工具擴(kuò)展受限的原因之一，尤其是密碼子優(yōu)化。盡管外源基因整合到微藻中，但轉(zhuǎn)基因表達(dá)通常很弱，根據(jù)目標(biāo)藻體的密碼子偏好性，對(duì)Cas基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，以確保有效表達(dá)。另外，有報(bào)道稱(chēng)Cas9組成型表達(dá)對(duì)衣藻細(xì)胞有毒性，可利用誘導(dǎo)型的啟動(dòng)子和終止子來(lái)解決［43，60］。另一種方法是 Cas9 和 sgRNA 的附加體遞送［76］。附加體，即自我復(fù)制且不整合到染色體中的環(huán)狀質(zhì)粒。附加體避免了非目標(biāo)位置的插入和敲除，并獨(dú)立于染色體進(jìn)行復(fù)制，使用附加體表達(dá)載體的優(yōu)勢(shì)是，一旦去除選擇壓力，轉(zhuǎn)化細(xì)胞就會(huì)逐漸擺脫附加體。與電穿孔、微粒轟擊和玻璃珠攪拌相比，通過(guò)細(xì)菌結(jié)合轉(zhuǎn)化方法在遞送更大的 DNA 片段方面具有優(yōu)勢(shì)。細(xì)菌結(jié)合轉(zhuǎn)化微藻的附加型載體提供了多基因途徑轉(zhuǎn)移的有效手段。第三種Cas遞送方法是通過(guò) Cas9 核酸酶蛋白和 sgRNA 形成的核糖核蛋白復(fù)合物（RNP）。將純化的 Cas9 和體外合成的 sgRNA 孵育以促進(jìn)復(fù)合物的形成并引入靶細(xì)胞。RNP 復(fù)合物執(zhí)行 DNA 切割的功能，并在進(jìn)入細(xì)胞后數(shù)小時(shí)內(nèi)降解。由于在細(xì)胞內(nèi)的停留時(shí)間較短，其具有較小的脫靶率［77］。

5 挑戰(zhàn)與展望

采用 CRISPR/Cas 的編輯系統(tǒng)是一種新興的綠色微藻技術(shù)。對(duì)CRISPR/Cas的理解和優(yōu)化使這種生物技術(shù)成為一個(gè)有前途的手段，可以操縱一些淡水和海洋微藻的基因組。在兩種不同類(lèi)別和6種不同類(lèi)型的 CRISPR 系統(tǒng)中，以Cas9 驅(qū)動(dòng)的II型系統(tǒng)在微藻的 CRISPR 研究中使用最多。本文除了回顧C(jī)RISPR的機(jī)制分類(lèi)、一些經(jīng)典的轉(zhuǎn)化方法外，還重點(diǎn)總結(jié)了CRISPR技術(shù)在藻類(lèi)的應(yīng)用，以期這些新興的轉(zhuǎn)化方法和不同的遞送方式，為提高轉(zhuǎn)化效率和轉(zhuǎn)基因的表達(dá)水平提供一些思路和方法。

從目前的報(bào)道來(lái)看，雖然CRISPR技術(shù)已經(jīng)在藻類(lèi)的研究中取得了一定成效，但其在應(yīng)用過(guò)程中也存在諸多問(wèn)題：（1）由于藻類(lèi)存在細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，很難將遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)化到微藻中。藻類(lèi)電穿孔轉(zhuǎn)化應(yīng)用最廣泛，但轉(zhuǎn)化效率還有待進(jìn)一步的提升。而目前脂質(zhì)轉(zhuǎn)染與電穿孔相結(jié)合是提高轉(zhuǎn)化效率的較好選擇。（2）Cas9 RNP的方法雖比載體驅(qū)動(dòng)的Cas9更有效率，但高質(zhì)量的無(wú)毒的重組Cas9蛋白不容易制備，購(gòu)買(mǎi)成本也較為高昂。（3）微藻可能存在沉默系統(tǒng)［78］，在轉(zhuǎn)錄之后的水平上對(duì)抗遺傳物質(zhì)。沉默組件的暫時(shí)關(guān)閉可能會(huì)提高轉(zhuǎn)換效率。（4）精確的基因組編輯技術(shù)需要精確的誘變而不會(huì)產(chǎn)生脫靶事件，這在微藻類(lèi)中尚未建立良好的誘變體系。總體而言，CRISPR技術(shù)還存在一定的局限性，仍需后期的改進(jìn)，以在微藻進(jìn)行精準(zhǔn)基因編輯。

與其他基因編輯技術(shù)相比，CRISPR技術(shù)在微藻中的應(yīng)用進(jìn)展較緩。隨著全基因組測(cè)序技術(shù)的更新，CRISPR技術(shù)有望加深我們對(duì)微藻基因功能和代謝機(jī)制的認(rèn)識(shí)，提高對(duì)微藻生物燃料和其化學(xué)品的開(kāi)發(fā)，為解決能源短缺和環(huán)境污染等問(wèn)題提供了新思路。同時(shí)，應(yīng)警惕基因突變帶來(lái)不可預(yù)知的風(fēng)險(xiǎn)和潛在的生物安全危機(jī)［79］，在將CRISPR技術(shù)應(yīng)用于商業(yè)用途之前，須考慮CRISPR轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品對(duì)環(huán)境和生物遏制問(wèn)題的影響。