鐘曉嬌 劉麗娜 王磊 肖婷婷 黃靜

(貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴州 貴陽 550025)

羧甲司坦是一種黏液調(diào)節(jié)劑，具有明顯抗炎、抑制氧化反應(yīng)等作用[1]，目前廣泛用于改善呼吸系統(tǒng)疾病[2]。由于羧甲司坦半衰期短，當(dāng)前市售劑型均需一天多次給藥，極大地降低了患者的順應(yīng)性和依從性，尤其是老年患者[3]。將羧甲司坦制成緩釋劑型，不僅能減少患者服藥次數(shù)，提高病患順從性，同時(shí)也能使其在體內(nèi)緩慢平穩(wěn)的釋放藥物，避免出現(xiàn)峰谷現(xiàn)象，降低毒副作用，提高臨床用藥的安全性。本課題在前期研究基礎(chǔ)上以羧甲司坦緩釋片作為研究對(duì)象，采用UV測(cè)定其吸光度值，對(duì)其精密度、穩(wěn)定性、專屬性等進(jìn)行考察；在含量測(cè)定方法建立的基礎(chǔ)上對(duì)釋放度測(cè)定方法進(jìn)行選擇，考察釋放介質(zhì)及pH、取樣時(shí)間點(diǎn)及釋放度，為羧甲司坦緩釋片的處方篩選提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并與市售羧甲司坦普通片的釋放百分率比較，為羧甲司坦新制劑的研制提供參考。

1 儀器與材料

1.1實(shí)驗(yàn)儀器 UV-2700紫外可見分光光度計(jì)(島津儀器(蘇州)有限公司)，ZRS-8G 釋放度試驗(yàn)儀(天津盛達(dá)三合光學(xué)儀器有限公司)，TD6 低速離心機(jī)(上海盧湘儀離心機(jī)有限公司)

1.2試藥 羧甲司坦標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(批號(hào)：100246-201503，廠家：中國食品藥品研究院)，羧甲司坦片(批號(hào)：161202，廠家：廣東南國藥業(yè)有限公司)，磷酸氫二鉀(批號(hào)：20200322，廠家：廣東·汕頭市西隴化工廠)，磷酸二氫鈉(批號(hào)：20200616，廠家：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)

1.3方法

1.3.1溶液配制 (1)pH=5.8磷酸鹽緩沖液配制：稱取磷酸二氫鉀8.34 g與磷酸氫二鉀0.87 g，加蒸餾水使混合溶解成1000 mL，即得。(2)人工胃液的配制：量取稀鹽酸16.4 mL，加蒸餾水約800 mL與胃蛋白酶10 g，充分搖勻后，加蒸餾水稀釋成1000 mL，即得。(3)pH=6.6磷酸鹽緩沖溶液配制：分別稱取磷酸二氫鈉1.74 g，磷酸氫二鈉2.70 g，氯化鈉1.70 g，加蒸餾水至400 mL，溶解混勻即得。(4)pH=7.8磷酸鹽緩沖溶液配制：取磷酸二氫鈉2.76 g，加水溶解，并用蒸餾水稀釋至100 mL，配成甲液。取磷酸氫二鈉35.90 g，加水溶解，并用蒸餾水稀釋至500 mL，配成乙液。取上述甲液17 mL與乙液183 mL混合，搖勻，即得。(5)對(duì)照品溶液的配制：精密稱定羧甲司坦對(duì)照品10 mg，放入50 mL容量瓶中，加適量pH=6.6的磷酸鹽緩沖液溶解，用磷酸鹽緩沖溶液定容至刻度線，制得每1 mL中約含200 μg的溶液，即得。(6)空白溶液的配制：按處方比例精密稱定各輔料適量，混勻，置250 mL容量瓶中，加緩沖液定容至刻度，超聲10 min，以5 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，離心兩次。取5 mL超聲后的溶液置于50 mL容量瓶中，加緩沖液稀釋至刻度。即得。(7)供試品溶液的制備：取自制羧甲司坦緩釋片10片，研成細(xì)粉，取細(xì)粉適量。放入250 mL容量瓶中，加入pH=6.6的磷酸鹽緩沖液定容至刻度，超聲10 min，在5000 r/min，10 min的條件下離心，離心兩次。取5 mL超聲后的溶液置于50 mL容量瓶中，加入磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度線制成每1 mL中約含200 μg的溶液。(8)2.0%茚三酮溶液配制：稱取茚三酮2.00 g于100 mL量瓶，加適量乙醇溶解，定容，混勻即得。

1.3.2檢測(cè)波長的測(cè)定 取供試品溶液、輔料溶液、對(duì)照品溶液各1 mL于25 mL容量瓶中，加入2.0%茚三酮溶液1 mL，加pH=6.6的磷酸鹽緩沖溶液1 mL，充分搖勻，水浴加熱15 min，迅速冷卻，蒸餾水定容至刻度線，以溶劑做空白對(duì)照[4]，在400～800 nm間掃描。

1.3.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取200 μg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.4 mL、1.6 mL、1.8 mL，分別置于25 mL容量瓶中，加最終確定的釋放介質(zhì)1.8 mL，加入2.0%茚三酮溶液1 mL，加最終確定的釋放介質(zhì)1 mL，水浴加熱15 min后，取出用冰水浴迅速冷卻，蒸餾水定容至刻度線，以溶劑作空白對(duì)照，按UV在最大吸收波長處測(cè)定吸光度值。

1.3.4羧甲司坦緩釋片含量的測(cè)定 分別取三批取羧甲司坦緩釋片各10片，研細(xì)，精密稱取0.5 g，置于250 mL容量瓶中，加入適量甲醇，加入pH=6.6磷酸鹽緩沖液定容至刻度，超聲20 min，以5 000 r/min離心10 min后，取5 mL溶液至50 mL容量瓶中，加pH=6.6緩沖液定容，取1 mL溶液至25 mL容量瓶中，加1 mL 2%茚三酮，加pH=6.6緩沖液1 mL，水浴加熱15 min,迅速冷卻，蒸餾水定容，在最大吸收波長處測(cè)定吸光度值。利用回歸方程計(jì)算各樣品的羧甲司坦含量。

1.3.5精密度實(shí)驗(yàn) 分別精密吸取羧甲司坦對(duì)照品溶液稀釋成1.6、8.0和14.4 μg/mL的低、中、高濃度溶液各6份，加入2.0%茚三酮溶液0.4 mL，加入最終確定的釋放介質(zhì)1 mL，搖勻，水浴加熱15 min，迅速冷卻，蒸餾水定容，利用UV在最大吸收波長處測(cè)定吸光度值，其中日內(nèi)精密度每隔2 h重復(fù)1次，連續(xù)測(cè)量6次，日間精密度每隔24 h測(cè)量1次，連續(xù)測(cè)3次，計(jì)算RSD值。

1.3.6穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取羧甲司坦對(duì)照品溶液1 mL，置于25 mL容量瓶中，加入2.0%茚三酮溶液1 mL，加入最終確定的釋放介質(zhì)1 mL，水浴加熱15 min，迅速冷卻，加蒸餾水稀釋至刻度線，分別在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h，12 h時(shí)利用UV在最大吸收波長處測(cè)定吸光度值，并計(jì)算RSD。

1.3.7重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密吸取羧甲司坦對(duì)照品溶液6份，每份1 mL，分別置于25 mL容量瓶中，加入2.0%茚三酮溶液1 mL，加入最終確定的釋放介質(zhì)1 mL，搖勻，水浴加熱15 min，迅速冷卻，蒸餾水定容，利用UV在最大吸收波長處測(cè)定吸光度值，計(jì)算RSD值。

1.3.8回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取羧甲司坦緩釋片釋放限度的30%、60%和100%的羧甲司坦對(duì)照品各3份，置50 mL量瓶中，分別加入處方比例的空白輔料[5]，各精密量取1 mL于25 mL容量瓶中，加入2.0%茚三酮溶液1 mL，加入最終確定的釋放介質(zhì)1 mL，熱水浴加熱15 min，迅速冷卻，用蒸餾水定容，利用UV在最大吸收波長處測(cè)定吸光度值，計(jì)算RSD。

1.4羧甲司坦緩釋片釋放度測(cè)定

1.4.1釋放方法的選擇 取羧甲司坦緩釋片分別按釋放度測(cè)定方法槳法和籃法操作，以最終確定的釋放介質(zhì)900 mL為釋放介質(zhì)，轉(zhuǎn)速100 r/min，分別在最終確定的取樣時(shí)間點(diǎn)時(shí)取樣4 mL[6]，離心，取上清液1 mL于25 mL容量瓶中，加入2.0%茚三酮溶液1 mL，加入最終確定的釋放介質(zhì)1 mL，充分搖勻，水浴加熱15 min，迅速冷卻，用蒸餾水定容至刻度線，利用UV在最大吸收波長處測(cè)定吸光度值。

1.4.2釋放介質(zhì)的選擇 分別以pH=5.8、pH=6.6、pH=7.8的磷酸鹽緩沖溶液、人工胃液作為釋放介質(zhì)的選擇，按照最終確定的釋放度法，轉(zhuǎn)速為100 r/min，分別在最終確定的取樣時(shí)間點(diǎn)取樣4 mL，離心，取上清液1 mL于25 mL容量瓶中，加入2.0%茚三酮溶液1 mL，各對(duì)應(yīng)的釋放介質(zhì)1 mL，充分搖勻，熱水浴加熱15 min，迅速冷卻，用蒸餾水定容，利用UV在最大吸收波長處測(cè)定吸光度值。

1.4.3時(shí)間點(diǎn)的選擇 緩釋制劑至少取3個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)，第一點(diǎn)在0.5～2 h，用于考察藥物是否存在突釋(釋放量小于30%)；第二個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)為中間取樣時(shí)間點(diǎn)，藥物釋放約50%，用于確定釋藥特性；最后一個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)在藥物釋放約80%取樣，用于考察釋藥是否基本完全[7]。本課題擬采用時(shí)間點(diǎn)1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h。將羧甲司坦緩釋片放入溶出杯中，轉(zhuǎn)速為100 r/min，分別于1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h時(shí)取樣4 mL，離心，取上清液1 mL于25 mL容量瓶中，加入2.0%茚三酮溶液1 mL，加入最終確定的釋放介質(zhì)1 mL，充分搖勻，熱水浴加熱15 min，迅速冷卻，蒸餾水定容，利用UV在最大吸收波長處測(cè)定吸光度值。

1.4.4羧甲司坦緩釋片釋放度測(cè)定 按《中國藥典》2020年版收載的第二法釋放度測(cè)定方法槳法：以pH=6.6的磷酸鹽緩沖溶液900 mL為釋放介質(zhì)，轉(zhuǎn)速100 r/min，取羧甲司坦緩釋片及市售羧甲司坦普通片4 mL，離心，取上清液1 mL于25 mL容量瓶中，加入2.0%茚三酮溶液1 mL，加入最終確定的釋放介質(zhì)1 mL，充分搖勻，熱水浴加熱15 min，迅速冷卻，蒸餾水定容至刻度線，利用UV在最大吸收波長567 nm處測(cè)定吸光度值，繪制緩釋片和普通片的釋放百分比-時(shí)間曲線圖。

2 結(jié) 果

2.1檢測(cè)波長的測(cè)定結(jié)果 羧甲司坦在567 nm處存在最大吸收，而溶劑和輔料在567 nm處無明顯吸收，所以本實(shí)驗(yàn)測(cè)定羧甲司坦的檢測(cè)波長為567 nm，見圖1。

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備結(jié)果 以吸光度值A(chǔ)為橫坐標(biāo)，以羧甲司坦?jié)舛?μg/mL)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程A=0.0695c-0.0898，相關(guān)系數(shù)r=0.9993，線性范圍：1.6～14.4 μg/mL，羧甲司坦?jié)舛仍诖司€性范圍內(nèi)與吸光度值呈良好的線性關(guān)系，結(jié)果如圖2。

2.3羧甲司坦緩釋片含量測(cè)定結(jié)果 三批自制羧甲司坦緩釋片的含量測(cè)定結(jié)果顯示，不同批次羧甲司坦緩釋片含量均在98%以上，表明羧甲司坦緩釋片的含量符合要求，所建立的羧甲司坦緩釋片的含量測(cè)定方法可靠。見表1。

表1 羧甲司坦緩釋片含量的測(cè)定結(jié)果

2.4精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果 羧甲司坦溶液高中低濃度的平均吸光度值分別為0.028 μg/mL，0.466 μg/mL，0.921 μg/mL，RSD分別為1.87%，0.81%，0.74%，表明日內(nèi)精密度良好。見表2。羧甲司坦溶液高中低濃度的平均吸光度值分別為0.027 μg/mL，0.465 μg/mL，0.920 μg/mL，RSD分別為2.0%，0.45%，0.17%，表明日間精密度良好。見表3。

表2 羧甲司坦緩釋片日內(nèi)精密度實(shí)驗(yàn)吸光度測(cè)定(μg/mL)

表3 羧甲司坦緩釋片日間精密度實(shí)驗(yàn)吸光度測(cè)定(μg/mL)

2.5穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 羧甲司坦溶液的吸光度值的平均值為0.464，RSD值為0.42%，表明羧甲司坦樣品溶液在放置12 h內(nèi)測(cè)定，具有較好的穩(wěn)定性。見表4。

表4 羧甲司坦穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.6重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 羧甲司坦溶液的吸光度值的平均值為0.465，RSD值為0.35%，表明該檢測(cè)方法的重復(fù)性良好。見表5。

表5 羧甲司坦重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.7回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果 平均回收率為99.05%，RSD為1.8%，說明該方法測(cè)定羧甲司坦緩釋片釋放度的回收率良好，結(jié)果準(zhǔn)確。見表6。

表6 羧甲司坦回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=9)

2.8羧甲司坦緩釋片釋放度測(cè)定結(jié)果

2.8.1釋放方法選擇的結(jié)果 由圖3結(jié)果可知，用籃法作為釋放方法時(shí)，釋放較緩慢，可能因羧甲司坦緩釋片粘性較高，容易堵塞轉(zhuǎn)籃的孔造成釋放緩慢，而槳法釋放速度相對(duì)轉(zhuǎn)籃法快，而且釋放速度相對(duì)穩(wěn)定，因此選擇用槳法作為測(cè)定羧甲司坦緩釋片的釋放方法。

2.8.2釋放介質(zhì)的選擇結(jié)果 由圖4結(jié)果可知人工胃液作為羧甲司坦釋放介質(zhì)時(shí)，吸光度值幾乎為0，表明羧甲司坦在人工胃液中幾乎不釋放，而用磷酸鹽緩沖溶液作為釋放介質(zhì)時(shí)吸光度值變化較大，說明羧甲司坦在磷酸鹽緩沖溶液中釋放，根據(jù)結(jié)果可知，當(dāng)磷酸鹽緩沖溶液pH=5.8和7.8時(shí)，吸光度值偏低，釋放緩慢，當(dāng)磷酸鹽緩沖溶液的pH=6.6時(shí)，吸光度值較正常，符合藥典要求，因此選擇pH=6.6的磷酸鹽緩沖溶液作為釋放介質(zhì)。

2.8.3時(shí)間點(diǎn)的選擇結(jié)果 由表7結(jié)果可知，由于緩釋制劑至少取3個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)，第一點(diǎn)是開始0.5～2 h的取樣時(shí)間點(diǎn)，第一個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)定為1 h，第二個(gè)為2 h；中間取樣時(shí)間點(diǎn)為4 h，用于確定釋放是否完全的時(shí)間點(diǎn)是8 h，而4～8 h之間的吸光度值相差較大，所以中間加一個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)6 h。由于10 h和12 h的釋放百分比接近，因此10 h這個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)舍去，最后一個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)為12 h，此時(shí)藥物釋放接近100%。

表7 時(shí)間點(diǎn)的選擇結(jié)果

2.8.4羧甲司坦緩釋片釋放度測(cè)定結(jié)果 利用UV在最大吸收波長567 nm處測(cè)定吸光度值。繪制緩釋片和普通片的釋放百分比-時(shí)間曲線圖，見圖5。與上市普通片相比，自制羧甲司坦緩釋片體外緩釋效果明顯，推測(cè)緩釋片可能延長羧甲司坦在體內(nèi)的釋放時(shí)間，減少用藥次數(shù)，提高其生物利用度。同時(shí)，也表明試驗(yàn)制備的羧甲司坦緩釋片體外釋放特征良好，符合緩釋片制備的有關(guān)要求。

用一級(jí)方程、Higuchi方程及零級(jí)方程對(duì)自制羧甲司坦緩釋片的釋放結(jié)果進(jìn)行擬合結(jié)果，如表8所示。結(jié)果表明羧甲司坦緩釋片的釋放結(jié)果與一級(jí)方程方程擬合性最好，擬合方程為：ln(1-Mt/M∞)=-0.3102t+0.3082，相關(guān)系數(shù)r=0.9901。

表8 羧甲司坦緩釋片的釋藥方程擬合結(jié)果

3 討 論

緩釋制劑的釋藥機(jī)制與其所用的緩釋材料具有密切關(guān)系，其釋藥過程是緩釋材料、水和藥物等多重因素相互作用的結(jié)果。溶解度大的藥物，釋藥機(jī)制主要表現(xiàn)為擴(kuò)散；溶解度小的藥物，釋藥機(jī)制主要表現(xiàn)為凝膠層的溶蝕，因此藥物在水中的溶解性影響骨架片的釋藥過程[8]。

在釋放度實(shí)驗(yàn)中，羧甲司坦緩釋片相較于市售普通片，羧甲司坦緩釋片可延緩釋藥速度，從而延長釋藥時(shí)間。其中，在釋藥前2 h時(shí)，羧甲司坦普通片的釋藥百分率已經(jīng)達(dá)到95%以上，而羧甲司坦緩釋片的釋藥百分率僅接近30%。羧甲司坦緩釋片直到12 h 時(shí)釋放百分比才到95%以上，說明釋藥時(shí)間明顯延長，達(dá)到了緩釋制劑的要求，且在這個(gè)釋藥過程中沒有出現(xiàn)“突釋”現(xiàn)象，達(dá)到藥物緩慢釋放的目的。

研究緩控釋制劑藥物釋放機(jī)制時(shí)，通常采用數(shù)學(xué)模型對(duì)藥物釋放曲線進(jìn)行擬合，然后根據(jù)擬合結(jié)果對(duì)釋藥機(jī)制進(jìn)行推斷[9]。一般可用零級(jí)方程、一級(jí)方程及Higuchi方程等擬合[10]，擬合時(shí)以相關(guān)系數(shù)r最大者為最佳擬合結(jié)果。由結(jié)果可知，一級(jí)方程的相關(guān)系數(shù)r最大(r=0.9901)，故自制羧甲司坦緩釋片在釋放介質(zhì)中的釋放機(jī)制接近一級(jí)釋藥模型。而零級(jí)方程的擬合相關(guān)性較差(r=0.9584)，說明該制劑釋藥方式不是單純的擴(kuò)散機(jī)制，可能為擴(kuò)散與骨架溶蝕相協(xié)同的釋藥機(jī)制。

本課題建立的羧甲司坦緩釋片的釋放度測(cè)定及含量測(cè)定方法操作簡單，方便，穩(wěn)定，可靠，重現(xiàn)性好，可用于羧甲司坦緩釋片釋放度測(cè)定，自制羧甲司坦緩釋片釋放速度明顯低于市售羧甲司坦片，其研發(fā)和生產(chǎn)成本較低，適合工業(yè)化生產(chǎn)，體外緩釋效果明顯，具有較大的臨床應(yīng)用價(jià)值，但其體內(nèi)外相關(guān)性仍需進(jìn)一步研究。