鄭丹蘋，錢 煒，鄭楚杰

1.江蘇大學附屬人民醫(yī)院耳鼻咽喉科，江蘇 鎮(zhèn)江 212000；2.南京中醫(yī)藥大學附屬常州市中醫(yī)院耳鼻咽喉科，江蘇 常州 21300

喉癌是發(fā)生于喉黏膜上皮組織的一種常見惡性頭頸部鱗狀細胞癌，發(fā)病率約占耳鼻咽喉科惡性腫瘤的13.9%，男性高于女性。大多數(shù)患者一般表現(xiàn)為音質、音色的改變，呼吸和吞咽功能出現(xiàn)異常，但由于早期沒有明顯臨床癥狀和惡性腫瘤的病史，臨床上60%的患者初診時即為晚期［1-3］。基于本課題組之前對納米材料的研究［4-13］，聯(lián)合壓電納米材料T-BTO和聲敏劑二氫卟吩e6（chlorin e6，Ce6）構建了新型的納米體系T-BTO@PEG@Ce6，簡稱T-G-C納米顆粒，不僅具有低毒性，而且對腫瘤具有較高的抑制率，可能為未來喉癌的多學科綜合治療提供一種新思 路。

聲動力學治療（sonodynamic therapy，SDT）是利用超聲刺激聲敏劑產生活性物質對細胞造成損傷［14］。其機制主要是由于聲敏劑在低強度周期性機械振動下產生活性氧（reactive oxygen species，ROS）或活性氮（reactive nitrogen species，RNS），另外超聲波的能量引起溫度升高和其他非熱效應，共同導致細胞的不可逆性損傷和凋亡［15］。SDT不僅有更深的組織穿透性（＞10 cm），而且減少了非治療區(qū)域的不良反應，如區(qū)域性皮炎或全身毒性，使其與傳統(tǒng)光動力學治療相比顯示出巨大優(yōu)勢［16-17］。SDT是由聲敏劑和超聲兩大部分組成的，聲敏劑可以是有機或無機聲敏劑，但是傳統(tǒng)聲敏劑存在光毒性和皮膚敏感性的限制?；诮陙砑{米醫(yī)學和材料化學的進展，人們致力于優(yōu)化和開發(fā)用于腫瘤和炎癥消除的新型聲敏劑，以提高SDT的效率。從原卟啉Ⅸ被發(fā)現(xiàn)后，我們將研究重點轉移到一些顆粒小、生物安全性好、親和度高、代謝產物低毒的新型納米聲敏劑上，超聲刺激后不僅能產生較強的細胞毒性，而且能通過接合化療藥物、靶向標志物等，對腫瘤細胞更好地定位，從而可能產生較好的療效［17-19］。

1 資料和方法

1.1 實驗動物、細胞株及試劑

30只雌性BALB/c裸小鼠（3～5周齡）購自上海斐林生物科技有限公司，體重為12～15 g，并由上海睿太莫斯生物科技有限公司在檢疫室監(jiān)測動物健康指標3 d，檢疫合格后在無特定病原體（specific pathogen free，SPF）環(huán)境中適應3 d，自由攝取水和食物。本實驗方案經江蘇大學附屬人民醫(yī)院倫理委員會審批通過。

人喉癌Tu686細胞系購自湖南豐暉生物科技有限公司。

10%胎牛血清、青霉素-鏈霉素雙抗、RPMI-1640培養(yǎng)基及含酚紅的胰蛋白酶（0.25%）均購自美國Gibco公司，4%多聚甲醛溶液、DAPI染色劑購自上海碧云天生物技術有限公司。細胞計數(shù)試劑盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）和Annexin Ⅴ-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）細胞凋亡檢測試劑盒購自東仁化學科技（上海）有限公司。本實驗超聲強度均采用1.0 MHz，1 W/cm2，50%占空比。

1.2 Tu686人喉癌細胞培養(yǎng)

從-80 ℃冰箱中取出解凍Tu686細胞，在濕化的空氣（37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%）及含有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基中恒溫培養(yǎng)，待細胞密度達到80%且狀態(tài)良好時，及時傳代。

1.3 細胞攝取材料評估

將對數(shù)生長期的Tu686細胞以2×105個細胞/孔的濃度接種于1 mL的共聚焦培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24 h后，培養(yǎng)至80%密度。分別與T-G-C溫育2、4、6、8 h，用磷酸緩沖鹽溶液（phosphatebuffered saline，PBS）洗滌3次，去除多余材料。將500 μL 4%多聚甲醛溶液加入培養(yǎng)皿中，固定15 min后用100 μL 4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色，溫育20 min后在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察細胞內的攝取情況。

1.4 細胞治療效果評估

為確定納米材料的安全性，首先進行T-G-C納米材料安全性的預實驗檢測。將對數(shù)生長期的Tu686細胞以104個細胞/孔的密度接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h。然后，以4孔為1組，將細胞與不同濃度的T-G-C納米顆粒溶液溫育24 h，接著用PBS洗滌3次。接著每孔加入100 μL CCK-8溶液與細胞恒溫溫育30 min，接著用全自動檢測酶標儀在450 nm處評估不同藥物濃度下細胞的存活情況。將Tu686細胞接種于6孔板中，培養(yǎng)2 d。細胞分6組，1～2組、3～4組、5～6組分別用PBS、80 μg/mL T-BTO、80 μg/mL T-G-C溶液溫育24 h，其中第2、4、6組細胞用超聲處理3 min。超聲處理結束后所有細胞再溫育6 h，PBS洗滌3次。胰蛋白酶處理后收集細胞，1 000 r/min離心5 min，PBS分散。每組取100 μL細胞懸液，加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC和10 μL碘化丙啶（propidium iodide，PI）在室溫下避光培養(yǎng)20 min。反應結束后1 h內上樣檢測。

1.5 構建BALB/c裸小鼠Tu686皮下移植瘤模型

Tu686細胞經傳代4次后，取生長狀況良好的對數(shù)生長期細胞，消化分離細胞后采集細胞并用0.9%的NaCl溶液制成細胞懸液，調整其密度至2×106個細胞/0.2 mL，取細胞懸液約0.2 mL皮下注射到BALB/c裸小鼠后腿部，約21 d后進行后續(xù)治療。在治療期間每隔1 d記錄動物的體重及動物瘤體變化，測定動物瘤體的長（a）、寬（b），對喉癌移植瘤體積測量采用自動讀數(shù)的電子游標卡尺，隔天記錄拍照并分別測量瘤體的長、寬，腫瘤體積計算公式為V=（a×b2）/2。小鼠體重、腫瘤重量采用精密天平稱重。待治療過程結束采用頸椎脫臼法處死動物，取瘤，冷凍包埋腫瘤切片。

1.6 小鼠的分組

將荷瘤小鼠按照每組5只，隨機分為6組，所有小鼠均在SPF環(huán)境中飼養(yǎng)。待每組小鼠成瘤后向瘤內注射100 μL藥物，第1組（G1）小鼠注射0.9%的NaCl溶液作為對照；第2組（G2）小鼠瘤內不注射藥物，僅超聲處理；第3組（G3）小鼠按體重瘤內注射100 μL 2.5 mg/kg T-BTO溶液，在注射前接合PEG并且充分混勻增加納米顆粒水溶性；第4組（G4）按體重瘤內注射100 μL 2.5 mg/kg T-BTOPEG溶液并進行超聲處理；第5組（G5）按體重瘤內注射100 μL 2.5 mg/ kg T-G-C溶液；第6組（G6）按體重瘤內注射100 μL 2.5 mg/kg T-G-C溶液并進行超聲處 理。

1.7 對實驗小鼠的處理

上述需要超聲組的小鼠在第1、3、5和7天經過瘤內注射藥物和超聲輻照。在為期16 d的治療期內，記錄小鼠的體重和相對腫瘤大小的變化。超聲組小鼠在給藥6 h后，將2、4、6組小鼠的腫瘤用超聲照射5 min，并在每次超聲后觀察小鼠狀態(tài)。治療結束時，處死各治療組小鼠，離體腫瘤組織進行稱重記錄，取腫瘤組織和主要器官（心、肝、脾、肺、腎）進行H-E、TUNEL、Ki-67及DHE染色。

1.8 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 25.0軟件進行數(shù)據分析，計數(shù)資料的表達采用，不同濃度T-G-C納米材料對細胞存活率的影響采用χ2檢驗，不同濃度下T-G-C材料的細胞存活率采用Fisher精準概率法測定，治療期間多組間的小鼠體重比較采取單因素方差分析，小鼠腫瘤體積采用Kruskal Willis檢驗分析，所得數(shù)據分析結果采用Adobe Illustrator 2021軟件進行圖像處理。

2 結果

2.1 細胞攝取材料評估

紅色熒光代表納米材料，藍色熒光代表細胞核。細胞內的紅色熒光強度隨著納米材料孵化時間的延長而增強，2 h后細胞內就出現(xiàn)紅色熒光，4 h后紅色熒光明顯增強（圖1）。

圖1 細胞攝取T-G-C納米顆粒分析Fig.1 Cellular uptake assessment of T-G-C nanoparticle

2.2 細胞凋亡評估

即使在200 μg/mL的高濃度下，與T-G-C溫育24 h后，細胞活性也未受到明顯影響（圖2A）。當超聲處理后，細胞存活率隨藥物濃度增加而急劇下降，在200 μg/mL濃度時，細胞活力不足10%（圖2B）。25 μg/mL與200 μg/mL的細胞存活率相差不大，即使用200 μg/mL的高濃度藥物與喉癌細胞共溫育24 h后，細胞活性仍未受到明顯影響（表1）。而經超聲處理后，在T-G-C納米藥物濃度為25 μg/mL時，細胞存活率為90.63%，在T-G-C濃度為200 μg/mL時，細胞存活率為9.90%，在超聲刺激時細胞存活率與未經過超聲刺激時的細胞存活率有顯著差異，且隨著T-G-C納米材料濃度增加，細胞存活率明顯降低（表2）。

表1 不同濃度T-G-C下細胞的存活率Tab.1 Cell survival rates at different concentrations of T-G-C

表2 超聲處理不同濃度T-G-C下細胞的存活率Tab.2 Cell survival rates at different concentrations of T-G-C after irritation of ultrasound

圖2 細胞對T-G-C納米顆粒安全性和毒性分析Fig.2 Cytotoxicity and biosafety evaluation of T-G-C nanoparticle

基于Annexin Ⅴ-FITC/PI染色法的流式細胞術分析顯示，T-G-C+超聲組的細胞凋亡率為33.66%，T-BTO+超聲組的細胞凋亡率為21.37%，而未經過超聲處理的T-G-C組的細胞凋亡率僅為11.60%（圖 3）。

圖3 流式細胞術Annexin Ⅴ-FITC/PI染色分析Fig.3 Analysis of cellular apoptosis through Annexin Ⅴ-FITC/PI staining

2.3 動物移植瘤的基本情況

30只裸小鼠造模成功，因此本實驗全部納入。在體移植瘤有包膜包裹，呈橢球型，離體后瘤體表面凹凸不平。

2.4 療效評價

在治療過程中，各組小鼠接受不同的處理，治療期間各組小鼠的體重變化差異不大。通過測量治療期間的小鼠腫瘤大小，發(fā)現(xiàn)第1、2和3組的小鼠腫瘤生長速度較快，第4組小鼠腫瘤生長受到部分抑制，而第6組小鼠腫瘤增長顯著被抑制，抑瘤率為100%（圖4，表3、4）。在處死小鼠剝離腫瘤組織后發(fā)現(xiàn)，第4組的小鼠腫瘤體積小于其他組，而第6組小鼠腫瘤幾乎消除。

表3 不同治療方案對小鼠體重的影響Tab.3 The effect of different treatment on body weight of tumor-bearing mouse

圖4 SDT抑瘤效果評價Fig.4 The evaluation of anti-cancer therapeutic effect of SDT

2.5 腫瘤組織切片分析

與其他處理組相比，第6組小鼠腫瘤切片中凋亡、壞死細胞最多，與其他組有顯著差異（圖5）。Ki-67抗體染色試驗結果表明，與其他治療組的圖像顯示腫瘤細胞增殖明顯不同，SOT聯(lián)合納米聲敏劑治療對腫瘤增殖有明顯的抑制作用。同時采用DHE染色評價超聲治療后Tu686腫瘤細胞的ROS水平。在T-BTO+超聲處理組中，有ROS生成，而在T-G-C+超聲處理后，可見大量明顯的紅色熒光，產生的ROS量明顯比單純壓電材料多。

圖5 腫瘤組織切片H-E、TUNEL、Ki-67和DHE染色結果Fig.5 H-E,TUNEL,Ki-67 and DHE staining of tumor sections in all treatment groups

表4 不同治療方案對各組小鼠腫瘤大小的影響Tab.4 The effect of different treatment on tumor volume in each group

3 討論

喉癌是臨床上常見的頭頸部惡性腫瘤之一，發(fā)病率逐年升高，喉癌患者的預后與腫瘤分期密切相關，T1和T2期腫瘤的治愈率高達80%～90%。然而Ⅳ期患者在經過各種綜合治療后生存率仍低至40%［9，20］。目前，手術聯(lián)合放化療仍然是喉癌的主要治療方式，在臨床常采用的治療方法中，無論是經口激光顯微手術、部分或全喉切除術，還是外科放療，在維持喉部功能或總生存率方面作用不大。傳統(tǒng)治療方法可能導致患者喉功能喪失，如發(fā)聲、呼吸、吞咽困難等［21］，并且放化療增加了患其他疾病的風險。所幸隨著納米材料和生物醫(yī)學的發(fā)展，光動力學治療、SDT等新的無創(chuàng)治療方式不斷涌現(xiàn)，尤為引人注目。為此本研究采用納米聲敏劑T-G-C作為壓電治療和SDT的敏化劑，利用納米材料經超聲激發(fā)后產生的ROS，來對喉癌進行治療。這種非侵入性無創(chuàng)的SDT聯(lián)合納米材料不僅能減少患者痛苦，提高患者依從性，而且在偏酸、缺氧、高糖的腫瘤環(huán)境中，可降低腫瘤細胞的放化療抵抗，提高療效。

壓電作用是通過壓電材料接收外界震動，吸收外界能量并將其轉化為電子空穴對的分離，形成內部電場的過程［22］。作為一種新型材料，BTO最初是被應用在接收器、傳感器、有機染料的分解、外科植入材料、腫瘤治療等領域中，在納米科學和生物醫(yī)學的發(fā)展中引起了醫(yī)學界的關注［23-24］。相較于塊狀材料，尺寸在1～1 000 nm的納米材料顆粒更小，比表面積更大，生物親和性更高，通過結合化療性藥物、靶向熒光標記等，拓展了納米材料在腫瘤的定位和診斷治療中的新功能［25］。通過使用新型的納米材料，聯(lián)合壓電材料和聲敏劑構成了T-G-C，在細胞內隨時間的延長而集聚，4 h就可以在腫瘤細胞中達到高效積累，說明T-G-C納米顆粒與細胞親和力高，在腫瘤細胞中以時間依賴的方式高效積累。當細胞與T-G-C納米顆粒溫育24 h后，經過CCK-8檢測，不同濃度的T-G-C納米材料下細胞的存活率組間差異無統(tǒng)計學意義（P=0.416），即使在高濃度下對細胞也是安全的。不同濃度下，采用超聲處理細胞后的細胞存活情況有所不同。T-G-C納米材料溫育后超聲處理能降低細胞存活率（P＜0.01），且不同濃度的納米材料對細胞存活率有影響，如200 μg/mL比70 μg/mL的細胞存活率低（P＜0.05），說明存在超聲時細胞存活率與材料濃度在一定范圍內呈負相關。

為研究細胞凋亡情況，采用AnnexinⅤ-FITC/PI染色法的流式細胞術分析后發(fā)現(xiàn)，超聲會引起實驗組細胞的早期和晚期凋亡，而在僅超聲輻照組未見明顯的細胞損傷，T-G-C+超聲組的細胞凋亡率為33.66%，T-BTO+超聲組的細胞凋亡率為21.37%，而未經過超聲處理的T-G-C組的細胞凋亡率僅為11.60%，驗證了T-G-C+超聲聯(lián)合治療的有效性。

在體內實驗中發(fā)現(xiàn)，當T-G-C納米顆粒注射到小鼠體內時，對小鼠的體重增長和主要器官并沒有明顯損傷，說明材料對小鼠來說較為安全（P＞0.05）。且在聯(lián)合聲敏劑和壓電材料的實驗組中，腫瘤的增長得到完全抑制，說明T-G-C+超聲組小鼠的腫瘤生長受到抑制，療效優(yōu)于其他治療組（P＜0.05）。在動物治療DHE切片中發(fā)現(xiàn)，T-BTO聯(lián)合超聲產生的ROS量遠小于T-G-C聯(lián)合SDT，同時也證實了T-G-C在超聲處理后產生抑瘤作用的核心是大量ROS的產生。ROS不僅參與許多生理過程，而且低水平的自由基還參與調節(jié)細胞自噬及自噬與凋亡之間的蛋白激酶［26］，當ROS平衡被打破時對細胞產生氧化損傷引起細胞凋亡。ROS包括單線態(tài)氧、脂質過氧化氫等，這些都可以損傷細胞膜、線粒體、內質網及細胞核，參與核苷酸代謝、檸檬酸循環(huán)及AMPK通路等，誘導腫瘤細胞表現(xiàn)出凋亡特征［27］。AMPK通路作為維持線粒體穩(wěn)態(tài)的關鍵通路，在能量穩(wěn)態(tài)、細胞生長和凋亡過程中有重要意義。AMPK通路可以監(jiān)測腺苷一磷酸/腺苷二磷酸的量，維持腺苷三磷酸穩(wěn)態(tài)；在線粒體損傷時，參與線粒體生物發(fā)生，調節(jié)線粒體動力學；還可以調節(jié)線粒體網格形態(tài)，調節(jié)氧化磷酸化和線粒體自噬過程，而ROS過量產生不僅會打破氧化平衡狀態(tài)，而且與主要的抗凋亡因子AKT2和AKT3相關的相鄰蛋白被激活，與AMPK有拮抗作用，增加癌細胞對治療的敏感性［28］。

基于聲動力學和納米材料，本研究研制出了新型納米聲敏劑T-G-C作為壓電治療和SDT的敏化劑，經超聲輻照刺激后在體外有較高的壓電催化活性。納米材料僅經4 h即可在細胞內高度聚集，生物安全性高，經超聲后在腫瘤細胞內激發(fā)了SDT和壓電治療的協(xié)同作用，且生物相容性高，經過實驗驗證了材料的安全性和抑瘤的有效性，是一種非常有潛力的治療方法。此外，基于對納米醫(yī)學在腫瘤治療中的研究，頭頸部腫瘤的治療在聯(lián)合納米醫(yī)學的基礎上，如何聯(lián)合免疫治療、如何進一步構建具有靶向性和定位診斷意義的新型納米材料也是下一步的研究方向。總之，本研究結果有助于拓寬納米生物醫(yī)學在耳鼻咽喉科中的應用，促進多學科聯(lián)合治療在耳鼻咽喉科疾病無創(chuàng)治療中的發(fā)展，為喉癌等頭頸部惡性腫瘤患者的治療提供新的思路。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。