孫 迪 ，孫郁青 ，張 鑫 ，黃麗莎，林巖松

1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，疑難重癥及罕見病國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100730；2.核醫(yī)學(xué)分子靶向診療北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100730；3.浙江紹興鼎晶生物醫(yī)藥科技股份有限公司，上海 201318

甲狀腺癌是兒童及青少年內(nèi)分泌系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，近年來其發(fā)病率逐年上升，分化型甲狀腺癌（differentiated thyroid cancer，DTC）是其最主要類型，其中甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）占比90%以上，甲狀腺濾泡癌（follicular thyroid carcinoma，F(xiàn)TC）占比不到10%［1-3］。國外相關(guān)研究［4-9］顯示，相較于成人，兒童及青少年甲狀腺癌往往侵襲性更強(qiáng)，具有多灶性、易包膜外侵犯等特點(diǎn)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的發(fā)生率也更高，但絕大多數(shù)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患兒可以從131I治療中獲益，放射性碘難治性DTC（radioactive iodine-refractory DTC，RAIRDTC）患兒較成人少見，且多呈穩(wěn)定狀態(tài)，疾病特異性死亡率很低。

上述臨床病理學(xué)特征的差異與其背后的遺傳學(xué)分子特征息息相關(guān)。相比成人以BRAFⅤ600E、RAS等單點(diǎn)突變?yōu)橹鲗?dǎo)的基因分型，兒童及青少年甲狀腺癌以RET/PTC為代表的基因融合占比更高［5，10-12］。然而受限于較少的病例數(shù)及良好的預(yù)后，現(xiàn)有研究對(duì)兒童及青少年甲狀腺癌的分子特征與臨床病理學(xué)特征關(guān)系的討論多局限于局部及遠(yuǎn)處侵襲性，而有關(guān)攝碘特征與分子背景關(guān)系的探索仍處于空白。另外，目前針對(duì)中國兒童及青少年DTC尤其是局部晚期或轉(zhuǎn)移性DTC的研究相對(duì)較少，基因突變數(shù)據(jù)則更為匱乏［13］。因此，本研究對(duì)局部晚期或轉(zhuǎn)移性兒童及青少年DTC隊(duì)列的腫瘤樣本進(jìn)行二代測(cè)序，并對(duì)其臨床資料進(jìn)行回顧分析，初步描繪了中國局部晚期或轉(zhuǎn)移性兒童及青少年DTC的基因突變分布及其相應(yīng)臨床病理學(xué)特征，并探索了可能影響攝碘特征的關(guān)鍵基因及分型。

1 資料和方法

1.1 納入和排除標(biāo)準(zhǔn)

納入2020年12月—2021年7月就診于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科進(jìn)行131I治療前后評(píng)估的兒童及青少年患兒。入組標(biāo)準(zhǔn)：①確診年齡≤18歲；② 病理學(xué)診斷為DTC，存在局部晚期或轉(zhuǎn)移病灶。排除標(biāo)準(zhǔn)：臨床資料嚴(yán)重缺失者。

1.2 臨床病理學(xué)資料收集

回顧性收集患兒手術(shù)、病理學(xué)檢查、131I治療、其他治療及臨床隨訪數(shù)據(jù)（甲狀腺功能水平、影像學(xué)檢查等）。如果本院資料不完整，經(jīng)患者同意后收集外院就診資料。

1.3 相關(guān)定義

確診日期為原發(fā)灶手術(shù)或原發(fā)/轉(zhuǎn)移灶活組織病理學(xué)檢查證實(shí)為DTC的日期。依據(jù)美國癌癥聯(lián)合會(huì)（American Joint Committee on Cancer，AJCC）DTC的TNM分期（第8版）系統(tǒng)［14］判定病理學(xué)分期，并以全病程中最高分期為最終分期。RAIR-DTC的判定依據(jù)2015年美國甲狀腺學(xué)會(huì)（American Thyroid Association，ATA）指南［15］，包括以下4種情形：①病灶初始即無攝碘功能；② 病灶在131I治療中逐漸喪失攝碘功能；③部分病灶攝碘，部分病灶不攝碘；④ 攝碘良好，但治療后病灶仍進(jìn)展。治療后疾病狀態(tài)評(píng)估亦參照2015年ATA指南［15］的動(dòng)態(tài)評(píng)估體系，分為療效滿意（excellent response，ER）、療效不確切（indeterminate response，IDR）、生化療效不佳（biochemical incomplete response，BIR）及結(jié)構(gòu)性療效不佳（structural incomplete response，SIR）。

1.4 基因變異檢測(cè)

收集兒童及青少年DTC患者的原發(fā)灶組織樣本，采用甲狀腺癌相關(guān)基因panel（ThyroLead?，浙江紹興鼎晶生物醫(yī)藥科技股份有限公司）進(jìn)行二代測(cè)序，覆蓋24個(gè)基因、7類融合基因和1項(xiàng)其他分子標(biāo)志物。檢測(cè)步驟：通過Qiagen柱（德國Dusseldorf公司）提取技術(shù)，從FFPE樣本中獲取DNA，并對(duì)提取的DNA進(jìn)行質(zhì)檢，用KAPA建庫試劑盒（瑞士Roche公司）構(gòu)建預(yù)文庫，用ThyroLead?探針進(jìn)行文庫雜交得到測(cè)序文庫，用Agilent 2100生物分析儀（美國Agilent公司）對(duì)測(cè)序文庫進(jìn)行質(zhì)檢，并利用NextSeq 2000測(cè)序儀（美國Illumina公司）進(jìn)行檢測(cè)、數(shù)據(jù)分析與數(shù)據(jù)質(zhì)控，綜合分析獲取樣本突變信息。

所有樣本均使用Nova-seq（美國Illumina公司）進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序數(shù)據(jù)先通過Fastp軟件進(jìn)行過濾，以去除接頭序列及低質(zhì)量序列。隨后使用Bwa-mem算法將其比對(duì)至hg19參考基因組上，并使用Picard MarkDuplicates標(biāo)記出聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）重復(fù)序列。應(yīng)用Sentieon TnSeq工具對(duì)去重后的bam文件進(jìn)行突變檢測(cè)。使用人群數(shù)據(jù)庫如千人基因組、gnomAD中的常見多態(tài)性位點(diǎn)對(duì)突變進(jìn)行過濾（MAF＞1%），并將Clinvar數(shù)據(jù)庫中認(rèn)定為Benign或Likely benign的突變過濾掉。所有突變均在IGⅤ軟件中經(jīng)過人工審核。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 26.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。定量資料以中位數(shù)［四分位數(shù)間距（inter quartile range，IQR）］表示；定性資料以數(shù)目及百分比表示。采用費(fèi)希爾精確檢驗(yàn)、獨(dú)立樣本Mann-WhitneyU檢驗(yàn)分析組間差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料

本研究共納入39例局部晚期或轉(zhuǎn)移性兒童及青少年DTC患兒，其中男性18例，女性21例，中位確診年齡為12.1（9.1，16.2）歲。以13歲為界，兒童（＜13歲）患者21例（男女比例為1.0∶0.9），青少年（≥13歲）患者18例（男女比例為1.0∶1.6）。所有患兒均完成全甲狀腺切除，中位手術(shù)次數(shù)為2（1，2）次，中位原發(fā)灶大小為2.7（1.5，3.9）cm。術(shù)后病理學(xué)檢查提示PTC 38例，F(xiàn)TC 1例。PTC中經(jīng)典型占比最高，為39.5%（15/38）?？杉皵?shù)據(jù)中AJCC T3或T4期占51.5%（17/33），全部患兒均存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，91.4%（32/35）伴有頸側(cè)方區(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（N1b期），61.5%（24/39）存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（M1期），包括肺轉(zhuǎn)移23例、肺合并骨轉(zhuǎn)移1 例。

截至2021年7月底，本隊(duì)列的中位隨訪時(shí)間為40.0（21.0，57.0）個(gè)月，至隨訪結(jié)束未出現(xiàn)死亡病例。94.8%（37/39）的患兒經(jīng)治療前評(píng)估進(jìn)行了131I治療，中位治療2（1，2）次，中位累計(jì)治療劑量為180（125，300）mCi；5.1%（2/39）的患兒術(shù)后評(píng)估考慮呈無疾病狀態(tài)，故未行131I治療。末次隨訪療效反應(yīng)SIR、BIR、IDR和ER分別占56.4%（22/39）、10.3%（4/39）、20.5%（8/39）和12.8%（5/39），詳見表1。

伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患兒中，1例在2次131I治療后達(dá)ER，1例在1次131I治療后達(dá)IDR，其余22例患兒截至隨訪結(jié)束，均為SIR。9例（9/24，37.5%）患兒呈RAIR-DTC狀態(tài)（圖1），目前仍在促甲狀腺激素（thyroid-stimulating hormone，TSH）抑制治療下密切隨診。其攝碘特征存在差異，5例表現(xiàn)為病灶攝碘良好但治療后仍進(jìn)展，3例表現(xiàn)為轉(zhuǎn)移灶初始即不攝碘，1例表現(xiàn)為轉(zhuǎn)移灶在重復(fù)碘治療中逐漸不攝碘（表2）。

圖1 39例兒童及青少年甲狀腺癌患者末次隨訪狀態(tài)及其基因特征分布Fig.1 Distribution of gene characteristics and status at the last follow-up in 39 children and adolescents thyroid cancer patients

2.2 基因特征

隊(duì)列中69.2%（27/39）的患兒檢測(cè)出體細(xì)胞突變。除去9個(gè)意義未明突變后，共24例（61.5%）患兒存在明確的突變基因，其中以融合突變?yōu)橹鳎?5.0%，18/24），點(diǎn)突變占比37.5%（9/24）。RET融合占所有融合突變的83.3%（15/18），最常見的RET融合伴侶為NCOA4（9/18，50.0%）和CCDC6（4/18，22.2%），TRIM33及TRIM27相對(duì)少見（均1/18，5.6%）；另檢出NTRK1融合2例及ALK融合1例。點(diǎn)突變中以BRAFⅤ600E出現(xiàn)頻率最高，為55.6%（5/9），其次為TP53突變，為22.2%（2/9）。

本隊(duì)列中有3例患兒同時(shí)存在點(diǎn)突變及基因融合兩種驅(qū)動(dòng)事件，分別為TP53 R213E合并NCOA4/RET、TP53 R280T合并STRN/ALK、PIK3CAH1047L合并CCDC6/RET。未發(fā)現(xiàn)存在1種以上驅(qū)動(dòng)點(diǎn)突變或基因融合的患兒。

9例RAIR-DTC患兒中8例存在基因突變，且仍以融合突變?yōu)橹鳎?/8），其中4例為NCOA4/RET融合，1例為CCDC6/RET融合，1例為TFG/NTRK1融合，1例為TP53 R213E合并NCOA4/RET融合；另有1例患兒存在BRAFⅤ600E點(diǎn)突變。

2.3 基因突變與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

以是否存在各種形式的驅(qū)動(dòng)突變分組，兩組的年齡、青春期與否、性別、治療方案（如手術(shù)次數(shù)、RAI治療次數(shù)、RAI累計(jì)劑量）、臨床病理學(xué)特征（如腫瘤大小、病理學(xué)類型、T分期、N分期、M分期、是否RAIR）及末次隨訪狀態(tài)等基本特征差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

進(jìn)一步分析占比最高的15例RET融合與臨床特征的關(guān)系，NCOA4/RET陽性患兒遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移比例（8/9，88.9%）高于其他形式融合（2/6，33%，P=0.089）；其T3-4期占66.7%（6/9），而其他形式RET融合患兒則以T1-2期為主（4/6，66.7%），提示NCOA4/RET在DTC侵襲性方面具有驅(qū)動(dòng)作用。此外，本隊(duì)列中RAIR-DTC患兒的突變?nèi)砸訬COA4/RET融合為主（5/8）（圖2）。

圖2 39例兒童及青少年甲狀腺癌患者基因及臨床特征分布Fig.2 Distribution of gene and clinical characteristics in 39 Children and adolescent thyroid cancer patients

3 討論

受限于兒童及青少年DTC較低的發(fā)病率，針對(duì)這一群體的臨床研究證據(jù)相對(duì)有限?，F(xiàn)有研究［13］顯示，兒童及青少年DTC相較于成人而言更具侵襲性，基因背景也存在明顯差異，主要以融合基因變異為主，然而目前有關(guān)中國患兒基因分子特征的證據(jù)相對(duì)匱乏。相較于其他研究，本研究隊(duì)列患兒可及數(shù)據(jù)中超半數(shù)者T分期≥3期，91.4%的患兒存在頸側(cè)區(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率高達(dá)61.5%［8，10，16］。不同于既往研究中絕大多數(shù)DTC患兒對(duì)131I治療反應(yīng)良好的特點(diǎn)，本列隊(duì)局部晚期或轉(zhuǎn)移性患兒中91.7%的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患兒經(jīng)131I治療后在末次隨訪時(shí)呈對(duì)131I治療反應(yīng)不佳的SIR狀態(tài)，且37.5%的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患兒已呈碘抵抗的RAIR狀態(tài)［7，9，17］，提示局部晚期或轉(zhuǎn)移性兒童及青少年DTC的預(yù)后并不容樂觀，深入探究并識(shí)別這部分患兒的疾病特征很有必要。

分子背景的差異可能是導(dǎo)致DTC侵襲性差異的深層原因。融合突變?yōu)閮和扒嗌倌闐TC中最主要的分子事件，具有更強(qiáng)的侵襲性，其中RET融合發(fā)生頻率最高，而點(diǎn)突變頻率則明顯低于成人隊(duì)列，以BRAFⅤ600E點(diǎn)突變（0%～63%）最常見［18-22］。現(xiàn)有研究［19］認(rèn)為，RET重排會(huì)持續(xù)激活下游絲裂原激活蛋白激酶（mitogen-activation protein kinase，MAPK）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，導(dǎo)致甲狀腺腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，與甲狀腺外侵犯、淋巴結(jié)/遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、高危病理學(xué)亞型及不良預(yù)后等相關(guān)。整體來看，本隊(duì)列中DTC驅(qū)動(dòng)事件發(fā)生頻率與國外最新報(bào)道相符，RET融合檢出率最高（38.4%），以NCOA4/RET重排形式最為多見（23.1%），本研究中的CCDC6/RET亞型相對(duì)較少（10.3%）［10，12］。在上述亞型分布差異的提示下細(xì)化RET變異患兒分組，發(fā)現(xiàn)NCOA4/RET融合陽性腫瘤表現(xiàn)出更強(qiáng)的侵襲性，多數(shù)NCOA4/RET融合陽性患兒為T3-4期，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移比例亦高于其他類型的RET融合（88.9%vs33.3%）。兒童RAIR狀態(tài)在其他研究中相對(duì)罕見，多為個(gè)案報(bào)道［16，23］，而本研究RAIR-DTC患兒則多達(dá)23.1%，其中55.6%的RAIR-DTC患兒呈NCOA4/RET融合突變，提示NCOA4/RET融合突變這一分子事件可能與DTC對(duì)131I療效反應(yīng)不佳及侵襲性高度相關(guān)。同時(shí)，高NCOA4/RET占比亦佐證了本隊(duì)列患兒病情偏重的特點(diǎn)。除RET融合突變外，本隊(duì)列中BRAFⅤ600E突變?yōu)樽畛Ｒ姷狞c(diǎn)突變形式（12.8%），患兒確診年齡均大于13歲，顯示出與較大年齡相關(guān)的趨勢(shì)，與現(xiàn)有研究［21，24］結(jié)果基本一致。此外，本隊(duì)列RAIR-DTC患兒的其他突變形式（NTRK融合、TP53、STRN/ALK重排等）均可見于既往兒童及青少年RAIR-DTC患者的個(gè)案報(bào)道［19，25-27］，然而受小樣本量及低發(fā)生率限制，其與兒童及青少年DTC的攝碘、發(fā)生、發(fā)展等表現(xiàn)的關(guān)系及機(jī)制仍待更大樣本量的研究進(jìn)一步驗(yàn)證。

雖然大多數(shù)兒童及青少年DTC對(duì)131I治療的反應(yīng)較理想，但其較高的輻射敏感性所致的繼發(fā)腫瘤可能性及并發(fā)癥（唾液腺損傷、生殖系統(tǒng)損傷、骨髓抑制、肺纖維化等）也不容忽視［28］。因此，如何平衡風(fēng)險(xiǎn)與獲益、識(shí)別合適的治療對(duì)象，避免過度治療，是當(dāng)下131I治療的難點(diǎn)及重點(diǎn)，而基因突變特征或可成為個(gè)體化131I治療方案決策中的重要依據(jù)。雖然本研究受樣本量小、缺失數(shù)據(jù)偏多、隨訪時(shí)間短等限制，但仍觀察到與國際最新研究基本一致的分布趨勢(shì)，且進(jìn)一步分析突變亞型與臨床病理學(xué)特征后發(fā)現(xiàn)NCOA4/RET陽性腫瘤的高侵襲性傾向，提示細(xì)化基因突變分層在兒童及青少年甲狀腺癌個(gè)體化診療中的重要價(jià)值。

綜上所述，本研究使用二代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)了局部晚期或轉(zhuǎn)移性兒童及青少年DTC的基因突變，初步描繪了該隊(duì)列患兒的基因特征。NCOA4/RET是其中最常見的突變亞型，與腫瘤侵襲性、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及RAIR-DTC高度相關(guān)。這一結(jié)果初步提示細(xì)化基因突變分層在兒童及青少年DTC尤其是局部晚期或轉(zhuǎn)移性患兒臨床管理中的意義。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。