劉 坤，陳德春

（資陽(yáng)市雁江區(qū)中醫(yī)醫(yī)院泌尿外科，四川 資陽(yáng) 641300）

膀胱癌（bladder cancer，BC）是一種相對(duì)常見(jiàn)的癌癥，在惡性腫瘤中排名第9 位，在癌癥死亡原因中排名第13 位[1]。BC 在男性中的發(fā)病率是女性的4倍多，在全球范圍內(nèi)，男性的發(fā)病率為9.6/10 萬(wàn)，女性的發(fā)病率為2.4/10 萬(wàn)。盡管該病發(fā)病率在過(guò)去幾十年里有所下降，但自1987 年以來(lái)，BC 死亡率一直穩(wěn)定在4.4/10 萬(wàn)[2]。BC 的組織學(xué)類型包括尿路上皮癌、腺癌、小細(xì)胞癌、漿細(xì)胞樣癌和鱗癌。在工業(yè)化國(guó)家，尿路上皮癌占所有組織學(xué)類型的90%以上，根據(jù)臨床分期，患者5 年生存率在30%～70%[3]。鑒于BC 是一種高發(fā)病率、高惡性、高復(fù)發(fā)率以及花費(fèi)巨大的疾病，大量針對(duì)BC 的研究都取得了一定的進(jìn)展。隨著基因表達(dá)芯片技術(shù)的發(fā)展，人們可以更深入地研究疾病的分子機(jī)制。自消皮素（Gasdermin，GSDM）被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，根據(jù)G 家族成員的N 端和CT端保守區(qū)域，已有6 個(gè)基因被歸類為Gasdermin 家族成員，包括Gasdermin A（GSDMA）、B（GSDMB）、C（GSDMC）、D（GSDMD）、E（GSDME）/DFNA5 和DFNB59。研究表明[4]，GSDM 參與上皮細(xì)胞發(fā)育、凋亡、焦亡、致癌作用和免疫相關(guān)疾病。其中細(xì)胞焦亡是一種炎癥性、半胱天冬酶（caspase）依賴（caspase-1或caspase-4/-5/-11）的細(xì)胞死亡模式，由炎癥小體（或焦亡小體）的形成引發(fā)，以應(yīng)對(duì)感染或危險(xiǎn)信號(hào)。這種死亡形式的特征是細(xì)胞膨脹并最終溶解[5]。目前對(duì)GSDM 的生物學(xué)功能和疾病相關(guān)性仍知之甚少。有證據(jù)表明，GSDM 在腫瘤細(xì)胞中被caspase激活后介導(dǎo)腫瘤壞死可以誘導(dǎo)強(qiáng)大的抗腫瘤免疫，這暗示了一種通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞焦亡來(lái)進(jìn)行抗癌治療的潛在策略，但其在BC 中所起的作用及其具體的分子機(jī)制尚不清楚[6]。因此本研究利用生物信息學(xué)方法分析BC 患者中GSDM 基因家族的表達(dá)，探討其與臨床病理之間的聯(lián)系，旨在為了解癌細(xì)胞焦亡途徑提供幫助，為臨床的診療工作提供參考。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源 使用UCSC Xena（https://xena.ucsc.edu/）數(shù)據(jù)庫(kù)當(dāng)中的“GDC TCGA Bladder Cancer（BLCA）”鏈接下載408 例BC 的RNA-Seq 數(shù)據(jù)[該數(shù)據(jù)采用log2（FPKM+1）進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化]以及448 例BC樣本的生存數(shù)據(jù)。將二者進(jìn)行匹配并將生存信息不完整的BC 患者排除在外，最終有403 例BC 患者納入研究。

1.2 GSDM 基因在BC 組織及正常組織中的表達(dá)GEPIA2（http://gepia2.cancer-pku.cn/）數(shù)據(jù)庫(kù)是一個(gè)交互式的網(wǎng)絡(luò)工具，收錄了癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)中的癌癥數(shù)據(jù)以及GTEx 中的正常組織數(shù)據(jù)[7]。本研究利用“Expression DIY”模塊中的“Box Plot”功能探索GSDM 基因家族在BC 組織及正常組織中的差異表達(dá)。在疾病選擇當(dāng)中選取“BLCA（膀胱癌）”并選擇“Match TCGA normal and GTEx data”按鈕，依次輸入GSDM 家族各基因后運(yùn)行得出GSDM家族在BC 和正常膀胱組織當(dāng)中的差異表達(dá)?！癝tage Plot”功能用以探索GSDM 基因家族與BC 患者TNM 分期的關(guān)系，同樣在疾病選擇中選取“BLCA”并依次輸入GSDM 家族各基因，運(yùn)行后得出結(jié)果。

1.3 GSDMD 基因在BC 腫瘤微環(huán)境中各細(xì)胞的表達(dá)TISCH（http://tisch.comp-genomics.org）數(shù)據(jù)庫(kù)整合了27 種癌癥的單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)，在單細(xì)胞水平上提供基因表達(dá)可視化[8]。本研究使用TISCH 數(shù)據(jù)庫(kù)的“Gene”模塊在單細(xì)胞水平探索GSDMB 以及GSDMD 在BC 腫瘤微環(huán)境中各細(xì)胞的表達(dá)情況并用熱圖進(jìn)行展示。

1.4 生存分析 根據(jù)GSDM 各家族基因表達(dá)量的中位值將所得到的403 例BC 樣本分為高、低表達(dá)組，進(jìn)行Kaplan-Meier 分析并使用Logrank 檢驗(yàn)。Kaplan-Meier Plotter（https://kmplot.com/analysis/）是 一個(gè)用于分析基因表達(dá)量與癌癥預(yù)后的在線工具，其中包含了多種來(lái)自于TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)以及GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)當(dāng)中的癌癥測(cè)序數(shù)據(jù)及芯片數(shù)據(jù)。隨后使用Kaplan-Meier Plotter 數(shù)據(jù)庫(kù)的“Pan-cancer RNAseq”模塊探索GSDM 基因家族與BC 患者的總體生存期之間的關(guān)系。該模塊中包含404 個(gè)來(lái)自于TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)的BC 測(cè)序數(shù)據(jù)及生存數(shù)據(jù)，采用工具默認(rèn)的“Auto select best cutoff”按鈕以最佳截?cái)嘀捣謩e將BC 患者根據(jù)GSDM 各家族表達(dá)量分為高低表達(dá)兩組并進(jìn)行生存分析及可視化。

1.5 單因素和多因素Cox 回歸分析 通過(guò)單因素和多因素Cox 回歸分析探索GSDM 家族在BC 當(dāng)中是否具有獨(dú)立預(yù)測(cè)能力，將臨床特征如性別、年齡、T分期、TNM 分期和分級(jí)納入分析。去除臨床信息不完整的患者后剩余308 例患者進(jìn)行單因素和多因素Cox 回歸分析。

1.6 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 利用GeneMANIA（http://genemania.org）數(shù)據(jù)庫(kù)和STRING（https://string-db.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，以尋找與GSDM 家族相互作用的蛋白[9]。在STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)當(dāng)中，選取與GSDM 家族相互作用的前50 條可信度為0.4 的互作關(guān)系，其中物種選擇為人類。隨后用GeneMANIA探索了與GSDM 基因家族在人類當(dāng)中互相作用的基因。選擇物種為人類，并一次輸入GSDM 家族所有基因，運(yùn)行后得出基因互作網(wǎng)絡(luò)。

1.7 功能富集分析 Metascape（https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1）是一個(gè)提供基因注釋和功能富集分析并可視化的數(shù)據(jù)庫(kù)[10]。在Metascape 當(dāng)中輸入GSDM 家族及與GSDM 家族相互作用的所有基因，并選擇物種為人類，點(diǎn)擊“Expression analysis”后得出富集結(jié)果。LinkedOmics 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.linkedomics.org）包含32 種癌癥類型的多組學(xué)數(shù)據(jù)和來(lái)自TCGA 項(xiàng)目的11158 例患者的臨床數(shù)據(jù)，可以使研究人員探索感興趣的分子或臨床特點(diǎn)與所有其它特征之間的關(guān)聯(lián)并提供分析和可視化[11]。在本次研究當(dāng)中，使用LinkedOmics 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)GSDM 家族各基因進(jìn)行基因集富集分析（GSEA）。

1.8 免疫浸潤(rùn)分析 ImmuCellAI（http://bioinfo.life.hust.edu.cn/ImmuCellAI#!/）是一個(gè)可根據(jù)基因表達(dá)譜和ssGSEA 算法對(duì)樣本當(dāng)中24 種免疫細(xì)胞含量進(jìn)行評(píng)估的在線工具及數(shù)據(jù)庫(kù)，該數(shù)據(jù)庫(kù)計(jì)算并儲(chǔ)存了TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)當(dāng)中各癌癥樣本腫瘤微環(huán)境的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)情況[12]。本研究從ImmuCellAI 中下載了BC 樣本的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)據(jù)并與BC 的轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)進(jìn)行匹配，使用Spearman 相關(guān)性分析探索GSDM 家族各基因與24 種免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 GSDM 在BC 及正常膀胱組織中的表達(dá)情況 相較于正常膀胱組織，GSDMB、GSDMC 及GSDMD 在BC 中高表達(dá)，而GSDME（DFNA5）以及DFNB59（PJVK）在BC 中低表達(dá)，見(jiàn)圖1。進(jìn)一步在單細(xì)胞水平探索GSDM 家族的基因在BC 腫瘤微環(huán)境當(dāng)中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)GSDMB 主要表達(dá)于BC 腫瘤微環(huán)境當(dāng)中的內(nèi)皮細(xì)胞以及上皮細(xì)胞，GSDMD 主要表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞，上皮細(xì)胞以及成纖維細(xì)胞當(dāng)中，而它們?cè)诿庖呒?xì)胞當(dāng)中則未見(jiàn)顯著表達(dá)。

圖1 GSDM 基因家族在BC 及正常組織中的表達(dá)

2.2 GSDM 家族與BC TNM 分期之間的關(guān)系 GSDM家族各成員與BC TNM 分期間的關(guān)系見(jiàn)圖2，隨著TNM 分期的增加，GSDMB 以及GSDME 的表達(dá)量遞減（P＜0.05），而GSDM 家族其它成員未表現(xiàn)出與BC TNM 分期相關(guān)（P＞0.05）。

圖2 GSDM 家族與BC TMN 分期的關(guān)系

2.3 GSDM 的表達(dá)量與BC 預(yù)后的關(guān)系 Kaplan-Meier 分析顯示，GSDMB 和GSDMD 高表達(dá)的BC 患者預(yù)后更佳，見(jiàn)圖3。使用Kaplan-Meier Plotter 工具進(jìn)一步驗(yàn)證，結(jié)果顯示GSDMA、GSDMB、GSDMD、PJVK 高表達(dá)的BC 患者預(yù)后更佳，而GSDM 家族其它基因則與BC 患者預(yù)后無(wú)明顯相關(guān)性。單因素分析顯示，GSDMB 和GSDMD 是BC 患者預(yù)后的保護(hù)性因素（風(fēng)險(xiǎn)比＜1），而年齡、T 分期和TNM 分期是BC 患者預(yù)后的高危因素（風(fēng)險(xiǎn)比＞1）。多因素分析顯示，GSDMB 是BC 患者預(yù)后的保護(hù)性因素，而年齡、T 分期和TNM 分期是BC 患者預(yù)后的高危因素，見(jiàn)表1。

表1 GSDM 的表達(dá)量與BC 預(yù)后的單因素和多因素Cox 回歸分析

圖3 GSDM 的表達(dá)與BC 預(yù)后的關(guān)系

2.4 GSDM 家族基因互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及互作基因的生物學(xué)功能 GeneMANIA 數(shù)據(jù)庫(kù)和STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)中與GSDM 家族相互作用的基因及其互作網(wǎng)絡(luò)見(jiàn)圖4A、圖4B。Metasape 數(shù)據(jù)庫(kù)的功能富集分析結(jié)果顯示，這些基因主要富集于中性粒細(xì)胞脫顆粒，NOD樣受體信號(hào)通路，細(xì)胞焦亡等免疫相關(guān)的生物過(guò)程，見(jiàn)圖4C。

圖4 GSDM 家族的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

2.5 GSDM 家族各成員的功能富集分析 通過(guò)GSEA進(jìn)一步探索GSDM 家族各成員相關(guān)的KEGG 通路，GSDMA 主要與NOD 樣受體信號(hào)通路、NF-kappa B信號(hào)通路、IL-17 信號(hào)通路以及其他免疫相關(guān)的信號(hào)通路有關(guān)；GSDMB 主要與含苯氧化物代謝過(guò)程相關(guān)；GSDMC 主要與NOD 樣受體信號(hào)通路、JAKSTAT 信號(hào)通路、腫瘤壞死因子信號(hào)通路、IL17 信號(hào)通路、NK 細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用以及其他免疫相關(guān)的信號(hào)通路有關(guān)；GSDMD 主要與細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用，NK 細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用、NF-kappa B 信號(hào)通路以及Th1 和Th2 細(xì)胞的分化有關(guān)；GSDME 主要與NOD 樣受體信號(hào)通路、細(xì)胞基質(zhì)-受體間相互作用、腫瘤壞死因子信號(hào)通路、JAK-STAT 信號(hào)通路、Toll 樣受體信號(hào)通路、Th1 和Th2 細(xì)胞的分化、Th17 細(xì)胞的分化有關(guān)；而PJVK 主要與氧化磷酸化、脂肪酸代謝等有關(guān)。

2.6 GSDM 家族各成員與膀胱癌免疫特征之間的關(guān)系 相關(guān)性分析顯示，GSDMB 的表達(dá)與CD4+T 細(xì)胞、Th17 細(xì)胞以及γδT 細(xì)胞呈正相關(guān)；與自然殺傷性T 細(xì)胞（NKT）、樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）、巨噬細(xì)胞、適應(yīng)性調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（iTreg）、Ⅰ型調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Tr1）、細(xì)胞毒性T 細(xì)胞（Tc）、耗竭性T 細(xì)胞（Tex）負(fù)相關(guān)；GSDMC 與Tc、Tex、iTreg、效應(yīng)記憶性T 細(xì)胞（Tem）、樹(shù)突狀細(xì)胞細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、自然殺傷性細(xì)胞（NK）正相關(guān)；與原始CD4 細(xì)胞（CD4 naive）、原始CD8 細(xì)胞（CD8 naive）、B 細(xì)胞、γδT 細(xì)胞以及CD4+T 細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)；GSDMD 與Tc、Tex、Th1 細(xì)胞、Th2 細(xì)胞、輔助濾泡性T 細(xì)胞（Tfh）、NKT、巨噬細(xì)胞、NK 細(xì)胞以及CD8+T 細(xì)胞呈正相關(guān)，而與CD4 naive、CD8 naive、Th17 細(xì)胞以及中性粒細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)；GSDME與Tc、NKT 細(xì)胞呈正相關(guān)，而與樹(shù)突狀細(xì)胞、γδT 細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)；PJVK 與CD4+T 細(xì)胞呈正相關(guān)，而與Tc、Tex、iTreg、Th1 細(xì)胞、中央記憶性T 細(xì)胞（Tcm）、樹(shù)突狀細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)。GSDMC 以及GSDMD 的表達(dá)量與浸潤(rùn)評(píng)分呈正相關(guān)，而GSDMB以及PJVK 與浸潤(rùn)評(píng)分呈負(fù)相關(guān)。

3 討論

BC 是全球第9 大常見(jiàn)的惡性腫瘤，每年新診斷的病例超過(guò)40 萬(wàn)例，特別是在男性和老年人中，居癌癥死亡原因的第13 位[13]。早期BC 患者的5 年存活率達(dá)到95.7%，而轉(zhuǎn)移性患者的5 年存活率僅為5%[14]。目前的診斷基于膀胱鏡、鏡檢、尿細(xì)胞學(xué)、尿液血液檢測(cè)以及尿液腫瘤標(biāo)志物的評(píng)估，然而這些標(biāo)記物的敏感性和特異性在樣本中存在炎癥細(xì)胞和其他污染細(xì)胞時(shí)會(huì)有所降低[15]。因此，最近的主要研究目標(biāo)是尋找新的預(yù)測(cè)性評(píng)估預(yù)后的生物標(biāo)記物和治療靶點(diǎn)[16]。GSDM 基因家族主要在胃腸道、皮膚和免疫細(xì)胞中表達(dá)，并與許多疾病有關(guān)，包括炎癥性疾病和癌癥。在人類中，GSDM 基因家族有6 個(gè)成員，從GSDMA 到GSDMF[17]。由于GDSM 家族的幾個(gè)成員在不同形式的調(diào)節(jié)性壞死中表現(xiàn)出了質(zhì)膜通透性，因此引起了人們對(duì)其在炎癥和宿主防御中的作用的關(guān)注[18，19]。

本研究發(fā)現(xiàn)，GSDMB 和GSDMD 在BC 中呈高表達(dá)，使用TISCH 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)一步在單細(xì)胞水平探索了GSDM 家族中差異表達(dá)的基因在BC 微環(huán)境中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)GSDMB 和GSDMD 主要表達(dá)于惡性細(xì)胞中，且GSDMB 和GSDMD 的高表達(dá)都與更好的預(yù)后相關(guān)，體現(xiàn)為生存時(shí)間顯著延長(zhǎng)。Cox 分析顯示，GSDMB、年齡、T 分期和TNM 分期可作為預(yù)測(cè)BC 患者預(yù)后的獨(dú)立因素。

本研究分析了GSDM 家族基因的表達(dá)與BC 腫瘤分期的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)隨著TNM 分期的增加，GSDMB以及GSDME 的表達(dá)量遞減。進(jìn)一步研究其潛在機(jī)制，對(duì)GSDM 家族成員及其互作蛋白進(jìn)行功能富集分析，結(jié)果表明這些基因主要富集于中性粒細(xì)胞脫顆粒，NOD 樣受體信號(hào)通路，細(xì)胞焦亡等免疫相關(guān)的生物過(guò)程。另外，本研究發(fā)現(xiàn)GSDMB 主要與含苯氧化物代謝過(guò)程相關(guān)，GSDMD 主要與細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、NK 細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用、NF-kappa B 信號(hào)通路以及Th1 和Th2 細(xì)胞的分化有關(guān)。鑒于這兩個(gè)基因都在BC 中高表達(dá)，猜測(cè)這兩個(gè)基因可能是作為抑癌基因，在癌癥發(fā)生后啟動(dòng)抗腫瘤免疫，通過(guò)誘導(dǎo)癌細(xì)胞的焦亡而發(fā)揮抗癌作用。因此，根據(jù)GSDM 基因的功能開(kāi)發(fā)治療策略是一種很有前途的方法，如使用DNA 甲基化抑制劑地西他濱，或者使用GSDM 和免疫檢查點(diǎn)阻斷（ICB）的聯(lián)合療法，以便通過(guò)最終激活強(qiáng)大的抗腫瘤免疫來(lái)根除腫瘤[20]。

綜上所述，GSDM 基因家族與BC 的發(fā)生發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)，其中的GSDMB 和GSDMD 在BC組織中顯著高表達(dá)，并且主要定位于惡性細(xì)胞，同時(shí)其高表達(dá)與更好的預(yù)后相關(guān)，分析可能是通過(guò)誘導(dǎo)癌細(xì)胞的焦亡而發(fā)揮抗癌作用，然而其具體的分子機(jī)制還需要后續(xù)進(jìn)一步的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)來(lái)證實(shí)。