崔忠澤，何 雙，路麗禎，吳淑華

（濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科，山東 濱州 256600）

結(jié)腸癌（colon cancer）在全球男性和女性惡性腫瘤發(fā)病率中分別排名第3（13.5%）和第2（9.5%）位，是嚴(yán)重危害人類健康的惡性腫瘤[1]。大量研究已經(jīng)明確了與結(jié)腸癌預(yù)后和患者治療反應(yīng)相關(guān)的基因突變；此外，一些靶向治療也被開發(fā)出來[2-4]。然而，結(jié)腸癌進(jìn)展的確切分子機(jī)制尚不清楚，這限制了晚期疾病的治療。因此，進(jìn)一步了解結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展過程中的基因表達(dá)，將有助于提高診斷和治療水平。目前，微陣列技術(shù)已被廣泛用于探索癌癥基因表達(dá)的變化[5，6]。高質(zhì)量的芯片和高通量測(cè)序有助于發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展過程中的基因表達(dá)變化[7-9]，甚至篩選出用于結(jié)腸癌診斷、治療和預(yù)后的生物標(biāo)志物?；驁D譜可以從公共數(shù)據(jù)庫中獲得，如基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫（GEO）和癌癥基因組圖譜（TCGA），綜合生物信息學(xué)方法的使用可以克服不同芯片平臺(tái)和小樣本量的限制。免疫療法作為一種新興的治療某些癌癥的方法已經(jīng)獲得顯著的療效[10-13]。腫瘤微環(huán)境中腫瘤細(xì)胞可以直接侵入周圍組織或通過血液和淋巴管轉(zhuǎn)移，并可以通過釋放細(xì)胞因子引起宿主的免疫反應(yīng)，直接或間接地抑制或促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的發(fā)展[14]。因此，了解腫瘤免疫微環(huán)境，尋找免疫標(biāo)記物，是提高腫瘤免疫治療效果的關(guān)鍵。基于此，本研究主要篩選了TCGA 數(shù)據(jù)集和4 個(gè)GEO數(shù)據(jù)集中結(jié)腸癌的共表達(dá)差異基因，并從中得到預(yù)后相關(guān)基因，分析目標(biāo)基因在組織中的表達(dá)情況和功能。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)收集 從GEO 數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）[15]中獲取4 個(gè)基因芯片（GSE41657、GSE74602、GSE106582、GSE110224）。GSE41657 包含12 個(gè)結(jié)腸癌樣本和25 個(gè)正常結(jié)腸組織樣本。GSE74602 包含30 個(gè)結(jié)腸癌樣本和30 個(gè)正常結(jié)腸組織樣本。GSE106582 包含117 個(gè)結(jié)腸癌樣本和77個(gè)正常結(jié)腸組織樣本。GSE110224 包含17 個(gè)結(jié)腸癌樣本和17 個(gè)正常結(jié)腸組織樣本。從TCGA 數(shù)據(jù)庫（https://portal.gdc.cancer.gov/）[16]下載結(jié)腸癌表達(dá)矩陣，包括398 個(gè)結(jié)腸癌樣本和39 個(gè)正常結(jié)腸組織樣本。

1.2 差異基因獲取 用R 語言檢測(cè)結(jié)腸癌與正常組織之間的差異基因。調(diào)整后P＜0.05 和|log2FC|≥2.0認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。然后，利用在線維恩圖分析網(wǎng)站（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）從個(gè)以上5 個(gè)數(shù)據(jù)庫中獲得共同差異基因。

1.3 差異基因的KEGG 和GO 富集分析 為分析差異基因的功能，使用R 語言對(duì)差異基因進(jìn)行KEGG與GO 富集分析。KEGG 是一個(gè)數(shù)據(jù)庫資源，用于大規(guī)模的分子數(shù)據(jù)收集，以了解生物系統(tǒng)和功能[17]。GO 是分析基因的生物學(xué)過程（BP）、分子功能（MF）和細(xì)胞成分（CC）的生物信息學(xué)工具[18]。P＜0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4 免疫相關(guān)預(yù)后差異基因篩選 將差異基因?qū)隚EPIA 數(shù)據(jù)庫（http://gepia.cancer-pku.cn/）[19]，篩選預(yù)后相關(guān)基因。將得到的預(yù)后相關(guān)基因?qū)隩IMER 數(shù)據(jù)庫（https://cistrome.shinyapps.io/timer/）分析其與免疫細(xì)胞之間的關(guān)系，篩選免疫相關(guān)性高的基因，定義為免疫相關(guān)基因。P＜0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.5 預(yù)后相關(guān)樞紐基因篩選 利用互作基因檢索工具（STRING v11.5；http://string-db.org）的在線數(shù)據(jù)庫構(gòu)建差異基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。Cytoscape（v3.8.2）是一個(gè)用于可視化蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的開放生物信息學(xué)工具。Cytoscape 的插件MCODE 是一個(gè)應(yīng)用程序，它可以對(duì)給定的網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行聚類，以找到緊密連接的區(qū)域。用Cytoscape 繪制蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，用MCODE 確定蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中的重要模塊，將最重要模塊中的基因認(rèn)定為樞紐基因，然后，將樞紐基因中的預(yù)后相關(guān)基因篩選出來。

1.6 分析目標(biāo)基因 將預(yù)后相關(guān)樞紐基因和免疫相關(guān)基因作為目標(biāo)基因進(jìn)一步分析?；赥CGA 數(shù)據(jù)庫基因表達(dá)數(shù)據(jù)，對(duì)目標(biāo)基因表達(dá)量進(jìn)行可視化。利用HPA 數(shù)據(jù)庫（http://www.proteinatlas.org）[20]觀察目標(biāo)基因在結(jié)腸癌及正常結(jié)腸組織的表達(dá)情況?；贕SEA 數(shù)據(jù)庫（https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp）[21]中c5.bp.V7.1，symbols，gmt 數(shù)據(jù)集，用R軟件對(duì)其進(jìn)行單基因GO 富集分析，推測(cè)其在結(jié)腸癌中可能發(fā)揮的作用，P＜0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸癌中差異基因的鑒定 在GSE41657 中，共鑒定出4712 個(gè)差異基因，其中2502 個(gè)上調(diào)基因和2210 個(gè)下調(diào)基因。在GSE74602 中，共鑒定出2878個(gè)差異基因，其中1543 個(gè)上調(diào)基因和1335 個(gè)下調(diào)基因。在GSE106582 中，共鑒定出504 個(gè)差異基因，其中176 個(gè)上調(diào)基因和328 個(gè)下調(diào)基因。在GSE110224 中，共鑒定出519 個(gè)差異基因，其中223個(gè)上調(diào)基因和296 個(gè)下調(diào)基因。在TCGA 中，共鑒定出3572 個(gè)差異基因，其中1343 個(gè)上調(diào)基因和2229個(gè)下調(diào)基因。使用維恩圖網(wǎng)站分析5 個(gè)基因芯片的差異基因，共鑒定出102 個(gè)差異基因，其中24 個(gè)上調(diào)基因和78 個(gè)下調(diào)基因，見圖1A～圖1C。

2.2 富集分析 對(duì)102 個(gè)差異基因進(jìn)行GO 和KEGG通路富集分析。在BP 類中，差異基因主要富集于“激素代謝”“核分裂的正調(diào)控”“白細(xì)胞趨化性”和“離子跨膜運(yùn)輸”等。在CC 類中，“細(xì)胞頂部”和“頂端質(zhì)膜”占主導(dǎo)地位。在MF 類別中，“受體配體活性”和“激素活性”是主要的。KEGG 分析顯示，差異基因主要參與“藥物代謝”“致病性大腸桿菌感染”和“視黃醇代謝”等，見圖1D、圖1E。

圖1 VENN 圖和富集柱形圖

2.3 免疫相關(guān)預(yù)后差異基因篩選 使用GEPIA 數(shù)據(jù)庫對(duì)102 個(gè)差異基因進(jìn)行預(yù)后分析，共得到15 個(gè)預(yù)后相關(guān)基因（NR3C2、ETFDH、AQP8、CLDN23、SLC17A4、TIMP1、BGN、TESC、LRRC19、BEST2、NAT2、SULT1B1、SCG2、SELENBP1、IL1B），見圖2。在TIMER 數(shù)據(jù)庫分析這些基因與6 種免疫細(xì)胞（B細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞）的相關(guān)性，結(jié)果顯示，有6 個(gè)基因（NR3C2、ETFDH、TIMP1、BGN、SCG2、IL1B）在結(jié)腸癌中與腫瘤免疫微環(huán)境密切相關(guān)，其中3 個(gè)基因（ETFDH、NR3C2、SCG2）在結(jié)腸癌腫瘤微環(huán)境中的作用鮮見報(bào)道，見圖3。

圖2 預(yù)后相關(guān)基因在結(jié)腸癌中的Kaplan-Meier 生存分析

圖3 免疫相關(guān)基因與免疫細(xì)胞的相關(guān)性分析

2.4 預(yù)后相關(guān)樞紐基因篩選 在STRING 網(wǎng)站構(gòu)建差異基因的PPI 網(wǎng)絡(luò)后，運(yùn)用Cytoscape 的MCODE篩選顯著模塊，見圖4A。將最顯著模塊中的16 個(gè)基因（MEP1A、SCGN、SLC17A4、SI、MYO1A、TSPAN7、SLC26A2、STMN2、UGT2A3、CHGB、ADH1C、VSNL1、MS4A12、WNT2、ADAMDEC1、CEACAM7）定義為樞紐基因，見圖4B。其中僅有SLC17A4 為預(yù)后相關(guān)基因，但SLC17A4 在結(jié)腸癌中鮮見報(bào)道。

圖4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析圖

2.5 目標(biāo)基因分析 將3 個(gè)免疫相關(guān)預(yù)后基因（ETFDH、NR3C2、SCG2）和預(yù)后相關(guān)樞紐基因（SLC17A4）作為目標(biāo)基因進(jìn)一步分析。通過對(duì)其表達(dá)量的可視化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常組織相比，其在腫瘤組織中均呈低表達(dá)，見圖5A；通過其他4 個(gè)GEO數(shù)據(jù)集的驗(yàn)證，均符合這一結(jié)論。通過HPA 數(shù)據(jù)庫下載的免疫組化圖發(fā)現(xiàn)，ETFDH 主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，NR3C2 在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中大量表達(dá)，SCG2 在細(xì)胞質(zhì)中有少量表達(dá)，SLC17A4 主要表達(dá)于細(xì)胞膜，見圖5B、圖5C。通過GEEA 單基因富集分析發(fā)現(xiàn)，ETFDH 主要富集到“RNA 沉默”等功能，NR3C2 主要富集到“腫瘤壞死因子分泌”“血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖”等功能，SCG2 主要富集到“細(xì)胞周期相變的正調(diào)控”“RNA 聚合酶結(jié)合”等功能，SLC17A4 主要富集到“細(xì)胞周期G1S 期轉(zhuǎn)變的負(fù)調(diào)控”等功能，見圖6。

圖5 目標(biāo)基因的表達(dá)和免疫組化

圖6 目標(biāo)基因的GO 功能富集分析

3 討論

結(jié)腸癌是最常見的惡性腫瘤之一。近年來，生物標(biāo)記物已被廣泛用于癌癥的診斷、治療和預(yù)后評(píng)估中，其對(duì)揭示癌癥的發(fā)生發(fā)展具有重要的意義[22，23]。盡管已有結(jié)腸癌病因?qū)W相關(guān)研究，但其發(fā)生發(fā)展的確切機(jī)制仍未完全明確，因此尋找可靠有效的生物標(biāo)記物對(duì)結(jié)腸癌的診斷、治療和預(yù)后具有重要意義。結(jié)腸癌的治療策略包括化療、手術(shù)、放療和靶向治療，而免疫療法作為一種新的治療方法已用于部分結(jié)腸癌治療中[24，25]，這讓尋找新的可靠免疫靶點(diǎn)變得尤為重要。本研究通過生物信息學(xué)分析，篩選結(jié)腸癌預(yù)后相關(guān)樞紐基因和免疫相關(guān)生物標(biāo)記物，旨在為進(jìn)一步揭示結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制和鑒定新的免疫治療潛在靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

本研究為了克服不同芯片平臺(tái)和小樣本量的限制，獲得具有更高可信度的差異基因，下載了多個(gè)數(shù)據(jù)集（TCGA、GSE41657、GSE74602、GSE106582、GSE110224），分別進(jìn)行差異分析，獲得102 個(gè)共同的差異基因。對(duì)這些基因進(jìn)行了通路和功能的富集，結(jié)果顯示這些基因富集到了許多癌癥相關(guān)的通路與功能——“激素代謝”“核分裂的正調(diào)控”“白細(xì)胞趨化性”“藥物代謝”“致病性大腸桿菌感染”和“視黃醇代謝”等。研究顯示，甲狀腺激素能夠促進(jìn)結(jié)腸癌干細(xì)胞分化[26]，糖皮質(zhì)激素-GR-CDK1 信號(hào)傳導(dǎo)誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲[27]。而免疫細(xì)胞與結(jié)腸癌的診斷、臨床治療敏感性和預(yù)后相關(guān)[28-30]。大量研究表明[31，32]，藥物代謝與結(jié)腸癌治療預(yù)后密切相關(guān)。另外，現(xiàn)在已有研究證明致病性大腸桿菌可促進(jìn)結(jié)腸癌的發(fā)生[33，34]。

為了尋找差異基因中可作為結(jié)腸癌預(yù)后靶點(diǎn)的生物標(biāo)記物，通過GEPIA 數(shù)據(jù)庫從102 個(gè)差異基因中篩選出了15 個(gè)在結(jié)腸癌5 年生存曲線具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的基因——NR3C2、ETFDH、AQP8、CLDN23、SLC17A4、TIMP1、BGN、TESC、LRRC19、BEST2、NAT2、SULT1B1、SCG2、SELENBP1、IL1B，這些預(yù)后相關(guān)基因具有成為結(jié)腸癌生物標(biāo)記物的潛力。

為了得到預(yù)后相關(guān)基因中與腫瘤免疫相關(guān)的基因，通過TIMER 數(shù)據(jù)庫，對(duì)其與不同的免疫細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)性分析，最終得到6 個(gè)免疫相關(guān)基因NR3C2、ETFDH、TIMP1、BGN、SCG2、IL1B，其中TIMP1、BGN、IL1B 已被用于結(jié)腸癌腫瘤微環(huán)境或免疫相關(guān)研究[35-38]。但NR3C2、ETFDH、SCG2 在結(jié)腸癌免疫微環(huán)境中的作用鮮見報(bào)道。分析這3 個(gè)基因與6 種免疫細(xì)胞的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)NR3C2 與這6 種免疫細(xì)胞均成正相關(guān)，并且與B 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞關(guān)系更為密切，ETFDH 與除巨噬細(xì)胞外其他5 種免疫細(xì)胞呈相關(guān)性，其與B 細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞關(guān)系更為密切，SCG2 與B 細(xì)胞不具有相關(guān)性，與其他免疫細(xì)胞呈正相關(guān)，并且與CD4+T 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞均密切相關(guān)。

既往研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤浸潤(rùn)的CD20+B 淋巴細(xì)胞在結(jié)直腸癌中具有良好的預(yù)后價(jià)值[39]。研究表明[40]，大量的CD4+T 細(xì)胞浸潤(rùn)到腫瘤中與不良的臨床預(yù)后相關(guān)，而CD8+T 細(xì)胞作為腫瘤殺傷細(xì)胞，其缺失往往能促進(jìn)腫瘤的發(fā)展[41，42]。也有研究表明中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞的比值是結(jié)直腸癌患者的明確預(yù)測(cè)指標(biāo)，腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞能夠促進(jìn)腫瘤的發(fā)展[43]。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）是指被募集到腫瘤微環(huán)境中的巨噬細(xì)胞，已有研究表明腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[44-46]。本研究發(fā)現(xiàn)，預(yù)后相關(guān)基因NR3C2、ETFDH、SCG2 與這些免疫細(xì)胞密切相關(guān)，可能通過調(diào)控腫瘤免疫，在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用。

此外，本研究通過STRING 網(wǎng)站構(gòu)建了102 個(gè)差異基因的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，并用Cytoscape 軟件尋找其中最關(guān)鍵的功能模塊，最關(guān)鍵模塊中包括16 個(gè)（MEP1A、SCGN、SLC17A4、SI、MYO1A、TSPAN7、SLC26A2、STMN2、UGT2A3、CHGB、ADH1C、VSNL1、MS4A12、WNT2、ADAMDEC1、CEACAM7）樞紐基因，這些基因在102 個(gè)差異基因中發(fā)揮著最關(guān)鍵的功能。在這16 個(gè)樞紐基因中，SLC17A4 與預(yù)后相關(guān)，并在此之前尚未在結(jié)腸癌中報(bào)道過。

為了明確預(yù)后相關(guān)樞紐基因（SLC17A4）和免疫相關(guān)基因（NR3C2、ETFDH、SCG2）在結(jié)腸癌中的表達(dá)量、表達(dá)位置和可能發(fā)揮的作用，本研究基于TCGA 數(shù)據(jù)對(duì)這4 個(gè)基因表達(dá)量進(jìn)行可視化分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其在癌組織中的表達(dá)量均低于正常組織。基于HPA 數(shù)據(jù)庫的免疫組化發(fā)現(xiàn)，ETFDH 主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，NR3C2 在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中大量表達(dá)，SCG2 在細(xì)胞質(zhì)中有少量表達(dá)，SLC17A4 主要表達(dá)于細(xì)胞膜?；贕EEA 單基因富集分析發(fā)現(xiàn)，這些基因富集到許多與癌癥的發(fā)生與進(jìn)展均密切相關(guān)的功能，如ETFDH 主要富集到“RNA 沉默”等功能，NR3C2 主要富集到“腫瘤壞死因子分泌”“血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖”等功能，SCG2 主要富集到“細(xì)胞周期相變的正調(diào)控”“RNA 聚合酶結(jié)合”等功能，SLC17A4 主要富集到“細(xì)胞周期G1S 期轉(zhuǎn)變的負(fù)調(diào)控”等功能。

綜上所述，本研究共篩選出有望作為結(jié)腸癌預(yù)后靶點(diǎn)的15 個(gè)基因，通過對(duì)15 個(gè)基因進(jìn)一步分析，篩選出4 個(gè)結(jié)腸癌預(yù)后相關(guān)樞紐基因和免疫相關(guān)基因，這些基因具有重要的節(jié)點(diǎn)作用，可能與腫瘤免疫密切相關(guān)，在腫瘤免疫微環(huán)境中起著重要的作用。然而，本研究尚未進(jìn)行分子機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究，這些基因在結(jié)腸癌中具體的功能機(jī)制尚不清楚，下一步將從該方向入手，進(jìn)一步明確其在結(jié)腸癌中的作用。