張 磊，袁彧偉，孫平平，付崇毅，馬 強(qiáng)，李正男

（1 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院，呼和浩特 010018）（2 內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所）

蘋果是國際貿(mào)易中最重要的水果作物之一[1]，在世界范圍內(nèi)廣泛種植。我國的蘋果種植面積和產(chǎn)量均是世界第一[2]。陜西省的關(guān)中和陜北部分地區(qū)是蘋果的適栽區(qū)，目前已經(jīng)發(fā)展成為我國最大的蘋果生產(chǎn)區(qū)[3]。在陜西，蘋果園多為農(nóng)民自主經(jīng)營的小型果園，農(nóng)民為了降低生產(chǎn)成本，常常采用互換接穗的方式進(jìn)行品種更新。隨著種植年限增長、種植規(guī)模擴(kuò)大，病毒、植原體、類病毒等嫁接傳播病害在蘋果上的積累也越來越多，給蘋果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展帶來嚴(yán)重影響，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

蘋果銹果病在陜西省各蘋果種植區(qū)均有發(fā)生，嚴(yán)重影響蘋果的商品性，給蘋果產(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)報(bào)道，蘋果銹果類病毒（apple scar skin viroid，ASSVd）是引起蘋果銹果病的主要病原之一。ASSVd 屬于馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒科（Pospiviroidae）蘋果銹果類病毒屬（Apscaviroid）[4]，在世界范圍內(nèi)廣泛發(fā)生。另外，2014 年在我國山東省表現(xiàn)銹果癥狀的富士蘋果上檢測到1 種類似于類病毒的RNA 分子，將其命名為似蘋果錘頭類病毒RNA（apple hammerhead viroid-like RNA，AHVd-like RNA）[5]。隨后在加拿大的太平洋嘎拉（Pacific Gala）蘋果上也發(fā)現(xiàn)了這個(gè)類病毒，并明確其為蘋果錘頭類病毒（apple hammerhead viroid，AHVd），是桃潛隱花葉類病毒屬（Pelamoviroid）的新成員[6-7]。2018年，Szostek 等[8]對不同國家的蘋果樣品進(jìn)行檢測，在來自美國、日本、西班牙、新西蘭、意大利的樣品中均發(fā)現(xiàn)了AHVd，證明AHVd 在全球廣泛分布。2019 年Sanderson 等[9]、Chiumenti 等[10]對加拿大和意大利不同品種的蘋果樣品進(jìn)行檢測，并分析了AHVd 的分子多樣性，發(fā)現(xiàn)AHVd 的分子變異較大，但是其二級結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定。

本研究對采自陜西省的秦冠銹果樣品進(jìn)行類病毒診斷，明確引起陜西秦冠銹果病的病原種類及其分子特征，為預(yù)警和防控該病害提供依據(jù)。

蘋果銹果病病果The fruits of apple scar skin symptom

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2019 年9 月，在陜西省渭南市潼關(guān)縣秦東鎮(zhèn)十里鋪村的1 個(gè)蘋果園內(nèi)觀察到了嚴(yán)重的銹果病，銹果病發(fā)病率為100%，并嚴(yán)重落果，落地果實(shí)也均表現(xiàn)為銹果（圖版1）。為明確病原，隨機(jī)選取10株發(fā)病的蘋果樹進(jìn)行取樣，各采集20 片葉片用于檢測。采集的葉片用錫箔紙包裹，液氮速凍后，干冰快遞至實(shí)驗(yàn)室，保存于-86 ℃冰箱中備用。以實(shí)驗(yàn)室保存的ASSVd 陽性金紅蘋果葉片作為陽性對照。

試驗(yàn)中使用的DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自寶生物工程（大連）有限公司。KAPA Hifi HotStart Ready Mix PCR Kit 購自北京普凱瑞生物科技有限公司?？寺≥d體Zero Background pTOPO-TA Cloning Kit、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、高純度質(zhì)粒小量快速提取試劑盒均購自艾德萊生物技術(shù)有限公司。DL2000 Plus DNA Marker 購自近岸蛋白質(zhì)科技有限公司。QIAGEN 無核糖核酸酶水購自上?；鄯f生物科技有限 公 司 。Invitrogen SuperScript III Reverse Transcriptase Kit 購自Invitrogen 公司，內(nèi)含5×First Strand Buffer、SuperSciptIII 反轉(zhuǎn)錄酶、0.1 mol/L DTT、10 mmol/L dNTPs 和RNA Inhibitor。引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 RNA 提取及反轉(zhuǎn)錄

參照Li 等[11]的方法，提取采集的蘋果葉片樣品和陽性對照樣品總RNA，提取的總RNA 溶解于50 μL 無核糖核酸酶水中，測定濃度并檢測完整性后保存于-86 ℃冰箱中備用。以提取的總RNA 為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄：總RNA 1 μg 作為模板，隨機(jī)引物（2 μmol/L）1 μL，無核糖核酸酶水補(bǔ)齊至13 μL，65 ℃5 min；再加入M-MLV 5×Reaction Buffer 4 μL、RNA Inhibitor 1 μL、dNTPs（10 mmol/L）1 μL、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶（200 U/μL）1 μL，總體積20 μL，42 ℃70 min，70 ℃15 min，所得cDNA 保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 類病毒全基因擴(kuò)增

參照NCBI GenBank 數(shù)據(jù)庫中ASSVd 和AHVd基因組序列，設(shè)計(jì)ASSVd 的檢測引物對ASSVd-F（5′-GGTAAACACCGTGCGGTTC-3′）、ASSVd-R（5′-GGGAAACACCTATTGTGTTT-3′）和AHVd 的檢測引物對AHVd-F（5′-GGAGTCTATTAGGCTCCC TGATG-3′）/AHVd-R（5′-GACCGTCACGGGGGTGT TAAAAC-3′）。以cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃3 min 預(yù)變性；94 ℃30 s，56 ℃30 s，72 ℃30 s，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃2 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離。

1.4 類病毒全基因克隆

使用DNA 凝膠回收試劑盒純化回收目標(biāo)基因組片段，將目標(biāo)片段與pMD 18-T 載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。篩選陽性克隆提取質(zhì)粒送至上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

1.5 序列分析、系統(tǒng)發(fā)育分析、重組分析及二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

本試驗(yàn)獲取了AHVd 陜西秦冠分離物全長序列，通過NCBI BLASTn（https://blast.ncbi.nlm.nih.g ov/Blast.cgi）進(jìn)行同源序列檢索。使用SDTv1.2 軟件的MUSCLE 序列比對程序[12]將AHVd 基因序列與NCBI GenBank 中公布的其他71 個(gè)AHVd 全基因序列進(jìn)行兩兩比對。利用MEGA 6.0 軟件[13]構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，建樹方法為比鄰法（neighbor-joining，NJ），自展校正值設(shè)定為1 000，閾值為50%。利用RDP 軟件[14]的RDP、GENECONV、Bootscan、MaxC hi、Chimaera、SiScan 和3Seq 方法檢測72 個(gè)AHVd全長基因組序列中的重組事件；各個(gè)檢測方法的參數(shù)都設(shè)為默認(rèn)值，勾選“線性序列”和“絕對復(fù)制”選項(xiàng)，同時(shí)P值設(shè)為P＜10-5。有至少5 種方法檢測到的重組事件被認(rèn)定為顯著重組事件。基于AHVd陜西秦冠分離物的基因組序列，利用RNA 二級結(jié)構(gòu)在線預(yù)測工具RNA Folding Form（http://www.una fold.org/mfold/applications/rna-folding-form.php）[15]對其二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測；RNA 序列選擇環(huán)形，其他參數(shù)默認(rèn)。

2 材料與方法

2.1 AHVd 全長序列擴(kuò)增及序列分析

對采集的陜西秦冠銹果葉片樣品進(jìn)行ASSVd 和AHVd 檢測。利用引物對ASSVd-F/-R 沒有擴(kuò)增到預(yù)期片段，但陽性對照獲得了預(yù)期片段；利用引物對AHVd-F/-R 從2 份葉片樣品中均擴(kuò)增到了大小約430 bp 的預(yù)期片段。測序結(jié)果顯示，從10 株發(fā)病秦冠蘋果樹采集的葉片樣品中擴(kuò)增到的片段序列一致性為100%，該序列在NCBI GenBank 的登錄號為MT127883。NCBI BLASTn 檢索到了71 個(gè)同源序列（表1），均為AHVd 基因組序列。AHVd 秦冠分離物基因組序列與該71 個(gè)序列的一致性為85.6%～95.6%，其中，與AHVd 中國富士分離物（GenBank 登錄號為KR605506）的序列一致性最高，為95.6%；與意大利‘Agostinella’分離物（MH643697）和加拿大旭蘋果分離物（MK188699）的一致性最低，為85.6%。以上結(jié)果表明采集的陜西秦冠銹果病與AHVd 侵染相關(guān)。

表1 72 個(gè)AHVd 分離物基因組序列及其相關(guān)信息

2.2 AHVd 系統(tǒng)發(fā)育及重組分析

根據(jù)現(xiàn)有的72 個(gè)AHVd 全基因組序列構(gòu)建進(jìn)化樹，結(jié)果顯示，現(xiàn)有的AHVd 株系可以被分為2 個(gè)組群（圖1），其中，來源于意大利‘Agostinella’（MH643696～MH643711）與粉蘋果（MH643712～MH643727）的分離物以及來源于加拿大的J-52分離物（MK188695）聚集在同一個(gè)組群；Szostek等[8]檢測的西班牙、日本、意大利、美國等不同地區(qū)的分離物（MG662372～MG662376、MH049330～MH049331），Sanderson 等[9]從加拿大多個(gè)蘋果品種上得到的分離物、Zhang 等[5]以及本研究獲得的秦冠分離物聚集在另一個(gè)組群。這些AHVd 株系的聚類與其地理來源相關(guān)性不大，但是在同一蘋果品種上獲得的分離物親緣關(guān)系較近。重組分析結(jié)果顯示在72 個(gè)AHVd 分離物中并沒有顯著的重組事件發(fā)生。

圖1 基于72 個(gè)AHVd 分離物全長基因組序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 AHVd 二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用在線工具RNA Folding Form 對二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，AHVd 秦冠分離物為環(huán)形分子，一端為桿狀，另一端包含多個(gè)分枝（圖2-A）；2 條極性鏈上都能形成錘頭狀核酶，并含有已知的13 個(gè)核苷酸殘基保守區(qū)（圖2-B）。另外，與AHVd 代表株系（KR605506）相比，AHVd 秦冠分離物（+）和（－）極性鏈上的核酶共有5 個(gè)堿基突變，但并未對核酶的二級結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。

圖2 預(yù)測的AHVd 秦冠分離物二級結(jié)構(gòu)

3 討論與結(jié)論

AHVd 秦冠分離物與中國富士上首次發(fā)現(xiàn)的AHVd（KR605506）一致性最高，表明在中國蘋果種植區(qū)傳播的AHVd 可能具有相近的來源，對此應(yīng)當(dāng)引起重視，這可能是國內(nèi)蘋果繁殖材料運(yùn)輸、交換等導(dǎo)致了AHVd 的傳播。國外研究者發(fā)現(xiàn)AHVd和蘋果莖溝病毒（ASGV）、蘋果莖痘病毒（ASPV）、蘋果褪綠葉斑病毒（ACLSV）、蘋果綠皺果相關(guān)病毒（AGCaV）等復(fù)合侵染蘋果，而且與其他病毒復(fù)合侵染時(shí)，可能會加速AHVd 的重組與分子進(jìn)化[8]?？紤]到ASGV 等病毒擁有廣泛的薔薇科寄主植物，應(yīng)當(dāng)警惕AHVd 寄主植物范圍的擴(kuò)大。

類病毒根據(jù)是否有中心保守區(qū)以及核酶活性分為鱷梨日斑類病毒科（Avsunviroidae）和馬鈴薯紡錘塊莖類病毒科（Pospiviroidae）。而鱷梨日斑類病毒科成員的一個(gè)典型特征就是順式作用的核酶自切割，通過對稱的滾圈機(jī)制在葉綠體中復(fù)制，形成2 個(gè)極性的寡聚鏈[16]。AHVd 為鱷梨日斑類病毒科成員，其核酶由中心的保守區(qū)域和兩側(cè)被小環(huán)包被的短螺旋構(gòu)成，當(dāng)相應(yīng)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)不被破壞時(shí)，即使發(fā)生堿基突變，也不會影響核酶的活性[7]。這一點(diǎn)，通過對AHVd 秦冠分離物的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，也有體現(xiàn)。

AHVd 與陜西秦冠的銹果癥狀相關(guān)，并可能引起嚴(yán)重落果。本試驗(yàn)是繼Zhang 等[5]首次發(fā)現(xiàn)AHVd之后，再次在中國蘋果上檢測到AHVd，為防控AHVd 引起的蘋果病害奠定了理論基礎(chǔ)。