南曉潔 ，朱 敏 ，郭偉偉 ，張雅君 ，郭 尚

（1.山西農業(yè)大學山西功能食品研究院，山西 太原 030031；2.大同黃花產業(yè)發(fā)展研究院，山西 大同 037004）

蛹蟲草（Cordyceps militaris），別稱為北冬蟲夏草，與野生冬蟲夏草同屬肉座菌目（Hypocreales），是一種名貴的、可藥食兩用的中藥材[1]。現代醫(yī)學和營養(yǎng)學研究表明，蛹蟲草中含有蟲草酸、蟲草多糖、蟲草素、溶栓酶、麥角甾醇等多種活性成分[2]，已被應用到食品及保健品領域[3-4]，成為蟲草研究及產業(yè)化發(fā)展中的熱點。具有調節(jié)免疫、抗癌、抗氧化、降血糖等諸多生物活性功能的蟲草多糖作為蛹蟲草提取物的重要活性成分之一，受到越來越多學者的關注[5-7]。黃花菜（Hemerocallis citrina Baroni）又名萱草、金針菜，為百合科（Liliaceae）萱草屬（Hemerocallis）植物，含有豐富的營養(yǎng)物質，具有抗抑郁、改善睡眠、催奶等多種功效[8-10]；“小黃花大產業(yè)”，亦有良好的發(fā)展前景。

根據中醫(yī)藥學理論與現代浸提技術，利用超聲提取的空化作用使蟲草多糖最大限度地透過細胞壁分散到提取溶劑中，在此基礎上添加黃花菜；借鑒中藥“君臣佐使”配伍理論，復配3種藥食同源物料，包括可輔助降血糖和緩解疲勞的枸杞[11]，可益腎、固精、縮尿和養(yǎng)肝明目的覆盆子[12]，可抗氧化和抗病毒的桑葚[13]，以及補脾止瀉和養(yǎng)心安神的蓮子[14]；研發(fā)出一款富含蛋白質和14種氨基酸的復合飲料。在提高營養(yǎng)、豐富口感的同時，最大限度地滿足現代人對營養(yǎng)成分可快速、便捷地獲取的要求，開拓了蛹蟲草和黃花菜產品加工新途徑。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

蛹蟲草子實體[15-16]，由山西農業(yè)大學山西功能食品研究院提供；凍干黃花菜粉，山西冰華食品科技有限公司；枸杞、覆盆子、桑葚、蓮子，北京同仁堂藥店；濃硫酸、苯酚、葡萄糖均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；D-無水葡萄糖，中國食品藥品檢定研究院；木糖醇，山東龍力生物科技股份有限公司；檸檬酸、黃原膠均為食品級，鄭州百思特食品添加劑有限公司。

1.2 主要儀器與設備

AUW120D電子天平，日本島津公司；G-16C高速臺式離心機，德國賽多利斯公司；TU-1810PC紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；GWA-UN純水儀，北京普析通用儀器有限責任公司；多功能粉碎機，天津市泰斯特儀器有限公司；KQ5200DA超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；HH6-Z恒溫水浴鍋，上海一凱儀器設備有限公司；101-OS電熱鼓風干燥箱，上海力辰邦西儀器科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 蛹蟲草提取液制備工藝流程及操作要點

工藝流程：蛹蟲草→烘干→粉碎→過篩→稱重→超聲波提取→離心→取上清液備用。

操作要點：蛹蟲草子實體于60℃烘至恒重，粉碎后過60目篩；稱取子實體粉末加入水中進行超聲破碎提取；4 000 r·min-1離心10 min，取上清液即為蛹蟲草提取液。

1.3.2 蛹蟲草提取液多糖含量測定

參照苯酚-硫酸法[17]測定多糖含量。

1.3.3 蛹蟲草提取液制備工藝單因素試驗設計

準確稱取2.0 g蛹蟲草子實體粉末，在其他因子不變的條件下，將料液比分別設定為 1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70；浸提溫度分別設定為 25℃、30℃、35℃、40℃、45℃；浸提時間分別設為20 min、25 min、30 min、35 min、40 min；浸提功率分別設為100 W、200 W、300 W、400 W、500 W。通過考察多糖提取率，確定各因素較適宜水平。

1.3.4 蛹蟲草提取液制備工藝正交試驗設計

以多糖提取率為考察指標，在單因素試驗的基礎上，采用L9（34）正交試驗設計，篩選各因素的水平，對蛹蟲草提取液制備的最佳工藝條件進行科學確定，見表1。

表1 正交試驗因素及水平Tab.1 Factors and levels of orthogonal test

1.3.5 混合提取液制備工藝流程及操作要點

工藝流程：黃花粉、枸杞、覆盆子、桑葚、蓮子+水→冷浸→沸水浸提2次→過濾→取上清→合并濾液。

操作要點：稱取凍干黃花粉20 g、枸杞5 g、覆盆子5 g、桑葚8 g、蓮子3 g，加入質量體積比為1∶8的水，冷浸40 min，沸水煮20 min，采用4層紗布過濾，取上部清液備用；將所得濾渣再加入質量體積比為1∶6的水，沸水煮15 min，過濾后與第一次過濾所得上清液混合即為混合提取液，用于后續(xù)試驗。

1.3.6 復合飲料制備工藝流程及操作要點

工藝流程：蛹蟲草提取液+混合提取液→混合→調配→離心→灌裝→殺菌→冷卻→成品。

操作要點：將蛹蟲草提取液與黃花菜、枸杞、覆盆子、桑葚、蓮子的混合提取液進行混合，加入一定量的木糖醇、黃原膠、檸檬酸調配口感；攪拌均勻后，于6 000 r·min-1離心5 min，取上清液；分裝到經滅菌處理的100 mL玻璃瓶中，加蓋但不旋緊；放入水浴鍋中加熱脫氣，水沸騰以后把瓶蓋旋緊，沸水滅菌20 min，冷卻，儲藏。

1.3.7 復合飲料配方單因素試驗設計

將蛹蟲草提取液與黃花菜、枸杞、覆盆子、桑葚、蓮子的混合提取液進行混合，在其他因子不變的條件下，木糖醇濃度分別設定為5%、6%、7%、8%、9%；檸檬酸濃度分別設定為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%；黃原膠濃度分別設定為0.05%、0.06%、0.07%、0.08%、0.09%。通過考察感官評分，確定各因素較適宜水平。

1.3.8 復合飲料配方響應面試驗設計

將木糖醇濃度（A）、檸檬酸濃度（B）、黃原膠濃度（C）作為考察因素，在單因素試驗的基礎上，以產品的感官評價為考察指標，采用Box-Benhnken中心組合試驗設計，進行3因素3水平試驗來優(yōu)化蛹蟲草黃花復合飲料配方，并對試驗結果進行響應面分析。響應面試驗設計的因素水平設計見表2。

表2 響應面試驗設計的因素水平Tab.2 Factors and levels of response surface experiment

1.3.9 復合飲料感官評價方法

將飲料樣品進行隨機編號，請10位感官評價人員對產品色澤、氣味、口感、組織狀態(tài)進行綜合判定[18-19]，結果去掉最高分和最低分，取平均值作為樣品最終得分，滿分為100分。感官評定標準見表3。

表3 感官評價標準Tab.3 The sensory evaluation criteria

1.3.10 復合飲料營養(yǎng)成分檢測

參照GB 5009.5-2016食品安全國家標準食品中蛋白質的測定[20]進行蛋白質含量的測定；參照GB 5009.124-2016食品安全國家標準食品中氨基酸的測定[21]進行氨基酸含量的測定。

1.4 數據處理

數據處理采用 Excel 2010軟件；正交試驗設計與分析采用正交小助手軟件；響應面設計和方差分析采用Design Expert 8.06軟件。

2 結果與分析

2.1 葡萄糖標準曲線

以D-葡萄糖作為標準品，得到的葡萄糖標準液線性回歸方程為：

該回歸方程的相關系數R2為0.999 9，說明葡萄糖在規(guī)定范圍內線性良好。

2.2 蛹蟲草提取液制備工藝單因素試驗結果

2.2.1 料液比對多糖提取率的影響

不同料液比對多糖提取率的影響結果見圖1。

圖1 料液比對多糖提取率的影響Fig.1 Effect of material-to-liquid ratio on extraction rate of polysaccharide

由圖1可知，當溶劑增加至料液比為1∶40時，多糖提取率最高，達到1.47%；一定范圍內提取率隨溶劑的增加而增加可能是由于超聲的空化、機械效應以及引起體系溫度的上升，提高了液相體積的效能[22]。料液比1∶40之后隨著溶劑的增加，多糖提取率呈現下降趨勢；說明當溶劑過少時原料的溶解度低，使多糖提取率有所降低，溶劑過多時也會對多糖提取率產生影響。因此確定料液比為1∶40左右為宜。

2.2.2 提取溫度對多糖提取率的影響

不同提取溫度對多糖提取率的影響結果見圖2。

圖2 提取溫度對多糖提取率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on extraction rate of polysaccharide

由圖2可知，隨著溫度的升高，多糖提取率也隨之增加，35℃時達到最高，之后多糖提取率隨溫度的升高而降低。開始時，多糖提取率呈上升趨勢可能是因為多糖溶解度隨溫度的升高而增加；而后溫度超過某個閾值，導致多糖中的熱敏性物質變性、降解[22]，從而多糖提取率降低。最終確定提取溫度在35℃左右為宜。

2.2.3 提取時間對多糖提取率的影響

不同提取時間對多糖提取率的影響結果見圖3。

圖3 提取時間對多糖提取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on extraction rate of polysaccharide

由圖3可知，多糖提取率總體呈拋物線趨勢；隨著超聲時間的延長，多糖提取率上升；提取時間為35 min時，多糖提取率達到最大值；之后開始呈下降趨勢。這可能是由于長時間的超聲機械切割會破壞多糖結構，使損失增大，導致多糖提取率降低[23]。結果表明提取時間控制在35 min左右為宜。

2.2.4 提取功率對多糖提取率的影響

不同提取功率對多糖提取率的影響結果見圖4。

由圖4可知，隨著超聲提取功率的增加，多糖提取率先上升后降低；當超聲提取功率為300 W時，多糖提取率達到最大；之后繼續(xù)加大提取功率反而使多糖提取率降低。綜合考慮，提取功率過高可能導致多糖降解，且從經濟性角度出發(fā)，選擇超聲提取功率在300 W左右為宜。

圖4 提取功率對多糖提取率的影響Fig.4 Effect of extraction power on extraction rate of polysaccharide

2.3 蛹蟲草提取液制備工藝正交試驗結果

根據單因素試驗結果，進行正交試驗，優(yōu)化蛹蟲草提取液制備工藝。正交試驗結果分析見表4。

表4 蛹蟲草提取液工藝確定正交試驗結果與分析Tab.4 Results and analysis of orthogonal experimental for extraction technology of Crodyceps militaris

由表4可知，提取條件對多糖提取率影響從高到低依次為料液比（A）>提取溫度（B）>提取時間（C）>提取功率（D），最佳工藝為A2B2C3D1，多糖提取率達1.47%。

2.4 復合飲料配方單因素試驗

2.4.1 木糖醇濃度對復合飲料感官評分的影響

適當添加木糖醇有利于平衡飲料中各組分的風味，提升口感。不同木糖醇濃度對復合飲料感官評分的影響結果見圖5。

圖5 木糖醇濃度對復合飲料感官評分的影響Fig.5 Effect of xylitol concentration on sensory evaluation score of compound beverage

由圖5可知，當木糖醇為5%～7%時，復合飲料的感官評分逐漸上升，至7%達到最高，甜度適中。而后可能由于木糖醇過量導致飲料過甜，影響口感，評分反而降低。故響應面分析試驗因素水平選擇木糖醇濃度為6%、7%和8%。

2.4.2 檸檬酸濃度對復合飲料感官評分的影響

檸檬酸具有調節(jié)口感的作用，不同檸檬酸濃度對復合飲料感官評分的影響結果見圖6。

圖6 檸檬酸濃度對復合飲料感官評分的影響Fig.6 Effects of citric acid concentration on sensory evaluation score of compound beverage

由圖6可知，復合飲料的感官評分在檸檬酸為0.2%時達到最高，然后隨著檸檬酸添加口感降低。檸檬酸過少時，飲料的酸甜比失調，影響產品的風味；而添加過多時，飲料整體偏酸，亦破壞其原有風味。因此，響應面分析試驗選擇檸檬酸濃度為0.1%、0.2%和0.3%的因素水平進行。

2.4.3 黃原膠濃度對復合飲料感官評分的影響

具有乳化穩(wěn)定作用的黃原膠，可進一步提高飲料的穩(wěn)定性。不同的黃原膠濃度對復合飲料感官評分的影響結果見圖7。

圖7 黃原膠濃度對復合飲料感官評分的影響Fig.7 Effects of xanthan gum concentration on sensory evaluation score of compound beverage

由圖7可知，飲料的感官評分隨著黃原膠添加而上升，0.08%時達到最高?？赡苁怯捎邳S原膠含量上升促進植物蛋白疏水基團不斷暴露，增強乳化性，使體系清亮透明[24]。繼續(xù)添加黃原膠后沉淀率趨于穩(wěn)定，綜合考慮生產成本，選取黃原膠的最優(yōu)濃度為0.08%。故響應面分析試驗選擇黃原膠濃度為0.07%、0.08%、0.09%進行。

2.5 復合飲料感官評定響應面試驗結果與方差分析

根據單因素試驗結果，建立Box-Behnken模型設計方案，進行復合飲料配比優(yōu)化試驗，響應面試驗設計及結果見表5。

對表5數據進行多元回歸擬合分析，建立回歸模型，并得到各因素水平與感官得分的二次多項回歸方程為：

表5 響應面分析方案及試驗結果Tab.5 Response surface design arrangement and corresponding experimental result

對上述方程進行方差分析，結果見表6。

表6 響應面方差分析Tab.6 The variance analysis of response surface experiment

交互因素對復合飲料感官評分的影響見圖8。

圖8 交互因素對感官評分的響應曲面Fig.8 Response surface of sensory score by interaction factors

由圖8可以看出，檸檬酸濃度與黃原膠濃度的交互作用顯著。

通過對二次多項式回歸模型分析，確定復合飲料的最佳配方為：木糖醇7.14%、檸檬酸0.21%、黃原膠0.08%，模型預測感官得分為92.76。

2.6 驗證試驗

為了進一步驗證該工藝的可行性及可操作性，擬定驗證試驗配方為：木糖醇7.0%、檸檬酸0.2%、黃原膠0.08%。在此條件下進行3次平行試驗，所得實際感官得分為92.86，表明該回歸模型的預測性好。按照此配方生產的復合飲料呈紅棕色，色澤均勻，口感圓潤，酸甜適中，蛹蟲草和黃花菜混合香味協調，風味獨特，無明顯沉淀物。

2.7 蛋白質及氨基酸檢測結果

采用最佳配方（木糖醇7.0%、檸檬酸0.2%、黃原膠0.08%）生產復合飲料，檢測其蛋白質含量，結果表明該飲料的蛋白質含量為750 mg·100-1mL-1。因為游離的氨基酸具有良好的呈味能力，于是進一步測定該復合飲料中的14種氨基酸，氨基酸檢測結果見表7。

表7 復合飲料氨基酸檢測結果Tab.7 The detection results of amino acid in compound beverage

由表7可知，此復合飲料含有14種氨基酸；其中絲氨酸、甘氨酸、蘇氨酸和丙氨酸為甜味氨基酸，含量分別為 6.13 mg·100-1mL-1、0.56 mg·100-1mL-1、2.84 mg·100-1mL-1和 5.19 mg·100-1mL-1；天門冬氨酸和谷氨酸為鮮味氨基酸，含量分別為1.78 mg·100-1mL-1和2.10 mg·100-1mL-1；屬于苦味氨基酸的有組氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸，含量分別為 4.90 mg·100-1mL-1、1.47 mg·100-1mL-1、0.83 mg·100-1mL-1、1.51 mg·100-1mL-1。綜合蛋白質和氨基酸檢測結果，該復合飲料營養(yǎng)豐富，口感飽滿，整體風味協調。

3 結論

通過單因素試驗、正交試驗、響應面分析法研究了蛹蟲草黃花復合飲料的加工工藝。先以單因素試驗及正交試驗確定蛹蟲草提取液的制備工藝，再通過單因素試驗及響應面試驗優(yōu)化該復合飲料的最佳配方，得到蛹蟲草提取液的最佳工藝（料液比1∶40、提取溫度35℃、提取時間40 min、提取功率200 W）以及蛹蟲草黃花復合飲料的最佳配方（木糖醇7.0%、檸檬酸0.20%、黃原膠0.08%）。在此配方下制作的蛹蟲草黃花復合飲料飲料富含蛋白質和14種氨基酸，口感細膩豐滿，色澤均勻，符合大眾口味。通過此研究，有助于提升蛹蟲草、黃花菜的經濟價值，推動相關產業(yè)發(fā)展，為蛹蟲草和黃花菜產品開發(fā)提供參考，具有廣闊的市場前景。