李一凡，周振輝，陳東梅，黎 鋼，張 智

（廣東粵微食用菌技術(shù)有限公司，廣東 廣州 510663）

靈芝（Ganoderma spp.）來(lái)源于多孔菌科（Polyporaceae）靈芝屬（Ganoderma），具有養(yǎng)心安神、止咳平喘的功效[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明靈芝具有抗炎、抗腫瘤、降血壓、降血糖、免疫調(diào)節(jié)等藥理活性[2-4]。隨著靈芝顯著的藥效作用為大眾熟知，人們對(duì)靈芝的應(yīng)用從治療病癥轉(zhuǎn)向預(yù)防和保??；使用切片的子實(shí)體煮水或煲湯，破壁孢子粉直接售賣或提取孢子油；相較而言，靈芝子實(shí)體更易獲得，且售價(jià)遠(yuǎn)低于孢子粉加工產(chǎn)品。在民間使用最多的靈芝為赤芝（G.lucidum），但赤芝苦味重，大眾接受度差，這對(duì)靈芝子實(shí)體的推廣利用產(chǎn)生了一定影響。甜靈芝為1989年從日本引入的新品種[5]，其苦味較淡，味偏甜，口感優(yōu)于赤芝，大眾接受度較佳，食用評(píng)價(jià)高于赤芝，具有很高的市場(chǎng)開(kāi)發(fā)價(jià)值。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，甜靈芝早期被認(rèn)為屬于赤芝的變種[5]，但具體的品種鑒定結(jié)果以及該品種的拉丁名，至今未有報(bào)道。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的研究者通過(guò)結(jié)合形態(tài)學(xué)與分子技術(shù)進(jìn)行品種分類鑒定，以確定種屬及來(lái)源。近年來(lái)，隨著各方面研究的深入，大眾在生物學(xué)及生理學(xué)特性[6]、菌種制作[7]、培養(yǎng)方式[8-9]、功能成分分析[10]、木質(zhì)素降解酶活性[11]等方面對(duì)甜靈芝有了更多的了解。其栽培、生產(chǎn)目前已初具規(guī)模，掌握不同生長(zhǎng)階段的產(chǎn)量及品質(zhì)可以更好地確定最佳采收時(shí)期及子實(shí)體開(kāi)發(fā)方向，從而最大程度地提高菇農(nóng)及企業(yè)的效益。通過(guò)分析、比較不同生長(zhǎng)階段甜靈芝子實(shí)體的產(chǎn)量、多糖及三萜含量、孢子粉產(chǎn)量、收粉后子實(shí)體的品質(zhì)等數(shù)據(jù)，以為甜靈芝的規(guī)?；耘嗵峁﹨⒖家罁?jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株

所用甜靈芝菌株為廣東粵微食用菌技術(shù)有限公司保藏管（編號(hào)GL-AS）。由廣東省科學(xué)院微生物研究所食用菌研究中心進(jìn)行分子鑒定，采用試劑盒法提取其DNA，以ITS序列為引物進(jìn)行擴(kuò)增，再結(jié)合其宏觀及微觀形態(tài)，結(jié)果表明該甜靈芝菌株為無(wú)柄靈芝（G.resinaceum）。

1.1.2 儀器與試劑

磁珠法真菌DNA提取試劑盒B，廣州邁寶生物科技有限公司；SHHL-1.2液壓翻斗培養(yǎng)料混合機(jī)、SZDY-1000食用菌培養(yǎng)料沖壓裝袋機(jī)，漳州市興寶機(jī)械有限公司；YXQ.WF22-800SZ臥式矩形壓力蒸汽滅菌器，湖南共創(chuàng)醫(yī)療設(shè)備有限公司；HK-C2D雙人垂直雙面潔凈工作臺(tái)，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；葡萄糖、蛋白胨，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；麩皮，五得利集團(tuán)商丘面粉有限公司；高粱，本地超市采購(gòu)；木屑，產(chǎn)自佛山南海；棉籽殼，產(chǎn)自廣州市白云區(qū)、新疆；碳酸鈣，產(chǎn)自廣州市白云區(qū)；17 cm×35 cm×0.005 cm聚丙烯折角袋，漳州天珍塑料制品有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基配方及制作

母種培養(yǎng)基：土豆200 g·L-1（去皮，切成小塊后水煮，過(guò)濾，濾液備用）、葡萄糖20 g·L-1、瓊脂20 g·L-1、蛋白胨 5 g·L-1、硫酸鎂 1.5 g·L-1、磷酸二氫鉀 3 g·L-1、VB11 mg·L-1，pH 自然。

原種培養(yǎng)料：高粱98%（浸泡過(guò)夜，煮至無(wú)白心），碳酸鈣2%。

栽培種培養(yǎng)料及菌袋：木屑62%、棉籽殼27%、麩皮10%、碳酸鈣1%，含水量63%～65%，pH 6.2～6.4，每袋裝濕料1 kg。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)菌培養(yǎng)

將接種好的試驗(yàn)菌袋放置在發(fā)菌房中黑暗培養(yǎng)，期間保證發(fā)菌房的環(huán)境參數(shù)為溫度22℃～24℃、濕度60%～70%、CO2體積分?jǐn)?shù)0.2%～0.3%。在發(fā)菌期間觀測(cè)記錄試驗(yàn)菇包的菌種萌發(fā)時(shí)間、長(zhǎng)至袋肩時(shí)間、滿袋時(shí)間、袋間溫度以及其他生長(zhǎng)情況。

1.2.2 出菇培養(yǎng)

待菌袋長(zhǎng)滿白色菌絲且海綿蓋可見(jiàn)少量原基時(shí)在菌袋上開(kāi)小口，之后立即移入出菇房中進(jìn)行出菇生長(zhǎng)情況觀測(cè)，管理參數(shù)在黃毅[12]、陳鋒平[13]的參數(shù)基礎(chǔ)上稍作調(diào)整。期間保證出菇房的環(huán)境參數(shù)為溫度26℃～27℃、濕度80%～90%、光照200 lx～600 lx；生長(zhǎng)前期維持CO2體積分?jǐn)?shù)0.1%～0.2%，待菌柄長(zhǎng)至4 cm～5 cm時(shí)修枝，修枝后CO2體積分?jǐn)?shù)降低至0.06%～0.08%，繼續(xù)培養(yǎng)。在出芝管理過(guò)程中記錄現(xiàn)蕾時(shí)間、菌柄長(zhǎng)度變化、開(kāi)傘情況。

1.2.3 采收

此菌株菌蓋為橢圓形，在開(kāi)傘過(guò)程中，根據(jù)菌蓋大小設(shè)置3個(gè)生長(zhǎng)階段（S1：菌蓋長(zhǎng)直徑為4 cm～6 cm；S2：菌蓋長(zhǎng)直徑為6 cm～8cm；S3：菌蓋長(zhǎng)直徑為8 cm～10 cm）采收子實(shí)體，測(cè)定并記錄采收子實(shí)體的菌蓋長(zhǎng)直徑及短直徑、鮮重及干重、含水量、三萜及多糖的含量。

1.2.4 孢子粉產(chǎn)量

當(dāng)子實(shí)體邊緣的白色生長(zhǎng)圈消失，菌蓋表面出現(xiàn)少量孢子粉時(shí)將其放入特定的收粉裝置中，進(jìn)行孢子粉產(chǎn)量測(cè)定試驗(yàn)，收粉裝置見(jiàn)圖1。

如圖1所示，收粉裝置為規(guī)格40.5 cm×40.5 cm×28.0 cm的紙箱，內(nèi)固定規(guī)格為80 cm×70 cm×0.005 cm的聚丙烯袋，箱口處固定1層無(wú)紡布，再外置1層塑料膜，每個(gè)收粉箱內(nèi)放置4個(gè)菌袋。收粉完成時(shí)，用小刷子將子實(shí)體及菌袋表面的孢子粉輕輕掃入聚丙烯袋中，剪下子實(shí)體稱重后，菌孔朝下放置在干凈的A4紙上，隔日觀察子實(shí)體是否繼續(xù)噴粉以判斷是否達(dá)到噴粉終點(diǎn)，收集的孢子粉稱重后測(cè)定其含水量。觀測(cè)并記錄不同收粉時(shí)間（30 d、35 d、40 d、45 d、50 d、55 d）的孢子粉產(chǎn)量及子實(shí)體情況，確定最佳收粉時(shí)間。

圖1 孢子收粉裝置Fig.1 Collecting device of spore powder

1.3 多糖和三萜的含量測(cè)定

子實(shí)體60℃烘干，干品參照《中國(guó)藥典》中靈芝多糖及三萜的測(cè)定方法進(jìn)行含量測(cè)定[14]。

1.4 數(shù)據(jù)收集與分析

每個(gè)處理組觀測(cè)60包，重復(fù)3次。采用SPSS 20軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，采單因素方差分析（one-way ANOVA）和Duncan法進(jìn)行差異顯著性測(cè)驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)菌情況

供試靈芝菌株發(fā)菌情況見(jiàn)表1。

表1 無(wú)柄靈芝菌絲體生長(zhǎng)情況Tab.1 Mycelium growth Growth of Ganoderma resinaceum

如表1所示，接種后約3 d菌種萌發(fā)，7 d～8 d菌絲長(zhǎng)至袋肩，18 d～20 d滿袋，后熟2 d～3 d出現(xiàn)原基頂蓋現(xiàn)象，可以進(jìn)行出菇處理。在發(fā)菌過(guò)程中兩個(gè)菌袋間的溫度變化為22℃～25℃，菌絲長(zhǎng)至袋肩時(shí)袋間溫度最高。

2.2 出菇情況

供試靈芝菌株出菇期生長(zhǎng)情況見(jiàn)表2，開(kāi)傘前及開(kāi)傘后3個(gè)階段的子實(shí)體形態(tài)見(jiàn)圖2。

如表2、圖2所示，出菇培養(yǎng)后3 d～4 d現(xiàn)蕾，14 d～16 d菌柄長(zhǎng)度約為4 cm，此時(shí)進(jìn)行修枝，再繼續(xù)培養(yǎng)至開(kāi)傘；22 d～23 d菌蓋的長(zhǎng)直徑達(dá)4 cm～6 cm，26 d～27 d菌蓋的長(zhǎng)直徑達(dá)6 cm～8 cm，29 d～30 d菌蓋的長(zhǎng)直徑達(dá)8 cm～10 cm并出現(xiàn)輕微噴粉現(xiàn)象，子實(shí)體培養(yǎng)完成。該菌株出菇階段表現(xiàn)出原基數(shù)量較多、菌柄細(xì)長(zhǎng)、噴粉時(shí)間較早的生長(zhǎng)特點(diǎn)。

表2 無(wú)柄靈芝出菇情況Tab.2 Fruiting of Ganoderma resinaceum

圖2 不同生長(zhǎng)階段的無(wú)柄靈芝子實(shí)體Fig.2 Fruit bodies of Ganoderma resinaceum at different growth stages

按照試驗(yàn)設(shè)置的3個(gè)階段采收子實(shí)體，并對(duì)各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 開(kāi)傘后不同生長(zhǎng)階段的無(wú)柄靈芝子實(shí)體情況Tab.3 Fruit bodies of Ganoderma resinaceum at different growth stages after the pileus opening

由表3可知，在該培養(yǎng)條件下，菌蓋長(zhǎng)直徑達(dá)到（9.37±0.46）cm，短直徑達(dá)到（7.62±0.66）cm時(shí)甜靈芝子實(shí)體基本成熟，開(kāi)始出現(xiàn)輕微噴粉現(xiàn)象。對(duì)于子實(shí)體的產(chǎn)量而言，隨著子實(shí)體不斷長(zhǎng)大，其質(zhì)量不斷增加，但子實(shí)體含水量逐漸降低；子實(shí)體基本成熟時(shí)，平均單菇鮮質(zhì)量為（30.86±1.70）g，含水量約77%。分析該甜靈芝子實(shí)體的三萜和多糖含量發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，子實(shí)體的三萜含量不斷增加；在菌蓋生長(zhǎng)至最大，子實(shí)體成熟時(shí)三萜含量達(dá)到最高，為（2.46±0.64）%。與之相反，其子實(shí)體的多糖含量隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加不斷降低，在開(kāi)傘初期多糖含量最高，為（1.14±0.11）%。由此可見(jiàn)，要想獲得三萜含量高的子實(shí)體，需要培養(yǎng)至成熟后再采收，而想要獲得多糖含量高的子實(shí)體，則需要在開(kāi)傘初期采收。

2.3 孢子粉產(chǎn)量

當(dāng)邊緣白色生長(zhǎng)圈消失，出現(xiàn)輕微噴粉現(xiàn)象后將子實(shí)體放入收粉裝置中，跟蹤觀測(cè)不同采收時(shí)間的孢子粉產(chǎn)量及子實(shí)體情況，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 不同收粉時(shí)間的無(wú)柄靈芝孢子粉產(chǎn)量及子實(shí)體情況Tab.4 Spore powder yield and fruit body of Ganoderma resinaceum at different times for harvesting spore powder

由表4可知，隨著收粉時(shí)間的增加，孢子粉產(chǎn)量不斷上升；到第40天時(shí)孢子粉干重為16.36 g/袋，產(chǎn)量變化幅度達(dá)到最大；到第50天時(shí)雖然孢子粉產(chǎn)量最高（16.53 g/袋），但從第40天之后產(chǎn)量的變化幅度開(kāi)始減小，且持續(xù)降低。孢子粉的含水量在收粉初期最高。收粉后子實(shí)體的單菇鮮質(zhì)量逐漸下降，與子實(shí)體的干燥程度呈正相關(guān)，收粉50天后子實(shí)體較輕且質(zhì)脆，與烘干后的靈芝相似。觀察發(fā)現(xiàn)收粉40 d時(shí)僅有極少數(shù)子實(shí)體可繼續(xù)產(chǎn)生少量孢子粉，結(jié)合時(shí)間、成本以及收粉末期會(huì)出現(xiàn)孢子粉顆粒不飽滿、品質(zhì)差的情況，考慮孢子粉收集時(shí)間約40 d為宜，此時(shí)基本達(dá)到孢子粉采收的終點(diǎn)。

3 討論與結(jié)論

甜靈芝為商品名，目前市售甜靈芝可能存在品種混雜的情況。通過(guò)鑒定發(fā)現(xiàn)供試的甜靈芝品種為無(wú)柄靈芝?？卤箝臶15]曾對(duì)中國(guó)部分靈芝產(chǎn)區(qū)種質(zhì)資源進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)目前栽培的靈芝品種主要有3類，包括赤芝菌株13個(gè)、紫芝（G.sinense）菌株1個(gè)、無(wú)柄靈芝菌株4個(gè)。由此可見(jiàn)，無(wú)柄靈芝早已被廣泛栽培和使用。盡管無(wú)柄靈芝與赤芝在形態(tài)上存在一定差異，但二者親緣關(guān)系十分接近，經(jīng)常容易混淆[16]。對(duì)無(wú)柄靈芝的有效成分測(cè)定結(jié)果表明，無(wú)柄靈芝子實(shí)體內(nèi)三萜含量較赤芝高[17]。此外，彭惺蓉[18]從無(wú)柄靈芝中分離獲得了18個(gè)化合物，主要為可能起到保肝作用的三萜類化合物。Ding等[19]對(duì)無(wú)柄靈芝三萜類化合物進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其含有試驗(yàn)中作為標(biāo)準(zhǔn)品參照所用的8種靈芝酸?？梢?jiàn)無(wú)柄靈芝內(nèi)三萜類化合物豐富，作為子實(shí)體推廣或保健品原材料進(jìn)行開(kāi)發(fā)利用，均具有很好的潛力。

供試甜靈芝子實(shí)體的三萜含量隨著培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)的增加而不斷上升，但多糖含量隨著培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)的增加而降低，這與林應(yīng)興[20]、付立忠[21]等對(duì)赤芝的研究結(jié)果相一致，說(shuō)明此甜靈芝菌株與赤芝有相似的生長(zhǎng)規(guī)律。相較而言，甜靈芝在三萜含量上較其他靈芝菌株（霍芝1號(hào)、韓芝、日芝）更具優(yōu)勢(shì)[22]，因此更適合用于提取三萜類成分。

在收粉40天后此甜靈芝菌株基本已達(dá)到了噴粉終點(diǎn)，且子實(shí)體較干燥，考慮到成本問(wèn)題，甜靈芝的收粉時(shí)間建議以40 d～50 d為宜。此外，該甜靈芝菌株的噴粉時(shí)間較早；且相較于已被報(bào)道的其他靈芝菌株（龍芝二號(hào)、滬農(nóng)一號(hào)、南韓靈芝、美國(guó)大靈芝、中華紅芝等）[23-24]，此菌株孢子粉產(chǎn)量較大，收粉時(shí)間適宜；因此該甜靈芝也可以作為一個(gè)收粉的品種進(jìn)行開(kāi)發(fā)利用。

在目前關(guān)于無(wú)柄靈芝的研究中，暫未發(fā)現(xiàn)有關(guān)其味道偏甜的報(bào)道，此甜靈芝菌株可能為無(wú)柄靈芝里較為特殊的一個(gè)品種。無(wú)柄靈芝與赤芝的親緣關(guān)系十分接近，并具有相似的生長(zhǎng)規(guī)律，且在三萜種類及含量上較赤芝有一定的優(yōu)勢(shì)。此外，此次供試菌株作為無(wú)柄靈芝中的一種，在孢子粉產(chǎn)量上也具有很好的表現(xiàn)，說(shuō)明無(wú)柄靈芝也具有開(kāi)發(fā)成產(chǎn)孢靈芝的潛能。雖然目前無(wú)柄靈芝已被廣泛栽培，但因未被列入《中國(guó)藥典》而導(dǎo)致其在加工利用中受到一定的限制，因此，推動(dòng)該品種進(jìn)入新食品原料名錄對(duì)更充分地利用無(wú)柄靈芝的優(yōu)勢(shì)、豐富靈芝栽培產(chǎn)業(yè)及靈芝保健品行業(yè)都具有重要的意義。