曹 瑾 吳彩霞 毛建華

在哺乳動(dòng)物組織中，視網(wǎng)膜依賴于適當(dāng)?shù)?NAD+穩(wěn)態(tài)來維持生存和發(fā)揮功能[1-3]。煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶1(NMNAT1)是一種高度保守的核定位蛋白，可催化煙酰胺單核苷酸(NMN)或煙酸單核苷酸(NaMN)的腺苷酸化形成 NAD+，這是所有哺乳動(dòng)物 NAD+生物合成途徑的收斂步驟[4]。迄今為止，已有超過30種 NMNAT1 突變被證實(shí)與嚴(yán)重致盲疾病相關(guān)[5-7]。然而NMNAT1除了影響NAD+穩(wěn)態(tài)外，還在視網(wǎng)膜中存在多種潛在作用。如NMNAT1具有去乙?；腹δ?，可以促進(jìn)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞的存活[8]，而成熟小鼠中 NMNAT1的消融導(dǎo)致由神經(jīng)退行性NADase SARM1介導(dǎo)的光感受器快速死亡[9]。此外，NMNAT1構(gòu)成神經(jīng)保護(hù)蛋白Wld(s)的大部分序列，亦可延緩軸突退化[8]。最近有研究證實(shí)，視網(wǎng)膜 NMNAT1缺失會(huì)在出生后不久引起小鼠快速和嚴(yán)重的視網(wǎng)膜變性[5,10]，但具體影響機(jī)制尚未明了。故本研究通過構(gòu)建NMNAT1條件性敲除小鼠模型，旨在深入分析NMNAT1缺失對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器NMNAT1條件敲除小鼠[NMNAT1fl/fl小鼠，采用胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)打靶技術(shù)商業(yè)化制備]和野生型 129/SV-E 小鼠(北京維通利華公司)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證：SCXK(京)2016-0011。RIPA裂解緩沖液(美國Thermo Fisher Scientific公司)；BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒(北京CoWin Biotechnology公司)；NMNAT1抗體、BRN3A抗體、Calretinin(CALR)抗體、CHX10抗體(美國Millipore公司)；恢復(fù)蛋白(RCVRN)抗體、視紫質(zhì)(RHO)抗體(美國CST公司)；Leica CM1850 低溫冰凍切片機(jī)(德國Leica Biosystems公司)；Superfrost Plus 載玻片(美國Fisher Scientific公司)；HE染色試劑盒(北京Solarbio公司)；Nikon Eclipse Ti 光學(xué)倒置顯微鏡和激光掃描共聚焦顯微鏡(日本Nikon Instruments公司)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型構(gòu)建將NMNAT1fl/fl小鼠與野生型 129/SV-E 小鼠充分回交。將loxP靶向NMNAT1基因座(NMNAT1fl/fl)的純合小鼠與Six3啟動(dòng)子下表達(dá)Cre重組酶的轉(zhuǎn)基因小鼠(NMNAT1wt/wtSix3-Cre)雜交，獲得條件敲除小鼠[11]。雜交產(chǎn)生雜合的 NMNAT1fl/wt和Six3-Cre NMNAT1fl/wt后代，它們與NMNAT1fl/fl小鼠進(jìn)一步雜交以產(chǎn)生接近孟德爾比率的條件敲除(Six3-Cre NMNAT1fl/fl)和同窩對(duì)照(NMNAT1fl/fl)小鼠。實(shí)驗(yàn)小鼠定期與野生型129/SV-E小鼠回交以保持遺傳完整性。將實(shí)驗(yàn)小鼠維持在標(biāo)準(zhǔn)的12 h光照/黑暗循環(huán)下，提供充足的食物和水。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2.2 NMNAT1敲除小鼠的鑒定使用來自耳部穿刺活檢的基因組DNA，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)檢測對(duì)小鼠進(jìn)行基因分型。Six3-Cre引物序列：上游為5’-GCCCTGGCAGTGTCTTAG-3’；下游為5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’。NMNAT1引物序列：上游為5’- CCTTGTACCTGACCATGTCAACA-3’；下游為5’-CCTGGGAGGCATAGACCATGTA-3’。引物以終濃度0.75 μmol·L-1添加到 PCR 反應(yīng)體系中。熱循環(huán)條件為95 ℃ 2 min，95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。

1.2.3 Western blot檢測NMNAT1蛋白表達(dá)使用RIPA裂解緩沖液從小鼠視網(wǎng)膜提取總蛋白。通過BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒檢測蛋白質(zhì)濃度。將裂解產(chǎn)物在95 ℃的十二烷基硫酸鋰上樣緩沖液中煮沸5 min。蛋白質(zhì)被Bis-Tris聚丙烯酰胺凝膠分離并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。用50 g·L-1脫脂牛奶緩沖液在室溫下封閉1 h，隨后用兔抗鼠NMNAT1抗體(11000稀釋)4 ℃孵育過夜，抗兔辣根過氧化物酶結(jié)合二級(jí)抗體(15000稀釋)孵育2 h，最后用ECL發(fā)光液進(jìn)行檢測，并計(jì)算各蛋白的表達(dá)量。

1.2.4 制作冰凍切片在基因敲除小鼠出生后第0、4、10、30天(P0、P4、P10、P30),使用斷頸法處死小鼠，在手術(shù)顯微鏡下沿眼眶緣剪下小鼠眼球，并浸入40 g·L-1多聚甲醛中固定15 min，然后剪除角膜并再次固定45 min。 隨后，在 1×PBS 中清洗樣本并在脫水溶液(含有200 g·L-1蔗糖)中于4 ℃下孵育12 h。脫水后，將樣品在含有200 g·L-1蔗糖和Tissue-Tek?冷凍切片包埋劑的11 混合液中孵育1 h，然后轉(zhuǎn)移到冷凍切片包埋劑中，并放入-80 ℃凍存。使用低溫冰凍切片機(jī)切割16 μm的切片并置于Superfrost Plus 載玻片上。

1.2.5 視網(wǎng)膜組織學(xué)檢查HE 染色切片在帶有DS-Ri2 相機(jī)的尼康Eclipse Ti 型顯微鏡下拍照。使用尼康NIS-Elements軟件測量視網(wǎng)膜外邊緣至視神經(jīng)兩側(cè)4個(gè)等距離點(diǎn)的視網(wǎng)膜厚度，視網(wǎng)膜厚度定義為與視網(wǎng)膜外邊緣正交并終止于視網(wǎng)膜內(nèi)邊緣的連線的長度。每只動(dòng)物平行采集6個(gè)重復(fù)樣本，每個(gè)基因型完成 3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)檢測，計(jì)算平均厚度值。

1.2.6 免疫熒光化學(xué)染色視網(wǎng)膜切片用 1×PBS 短暫沖洗并在封閉緩沖液(含體積分?jǐn)?shù)10%山羊血清和體積分?jǐn)?shù)0.5% Triton X-100)中室溫孵育1 h。封閉后，將切片與一抗[用含有體積分?jǐn)?shù) 5% 正常山羊血清、體積分?jǐn)?shù)0.5% Triton X-100的緩沖液按1200(BRN3A抗體)、1200(CALR抗體)、1500(CHX10抗體)比例稀釋]在4 ℃下孵育過夜。次日切片用 1×PBST洗滌，并與 DAPI染色劑、山羊抗兔 Alexa Fluor-568 和(或)山羊抗小鼠 Alexa Fluor-488二抗在室溫下繼續(xù)孵育1 h。最后，將切片清洗，用Prolong Gold?抗淬滅試劑覆蓋蓋玻片，并在激光掃描共聚焦顯微鏡下拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。每只動(dòng)物平行采集6個(gè)重復(fù)樣本，每個(gè)基因型完成3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)檢測，計(jì)算視網(wǎng)膜厚度的平均值。多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 NMNAT1條件敲除小鼠模型的構(gòu)建與驗(yàn)證幾次雜交后，繼承Six3-Cre和floxed NMNAT1基因座的基因敲除小鼠在胚胎視網(wǎng)膜中表現(xiàn)出Cre介導(dǎo)的 NMNAT1前兩個(gè)外顯子切除，其中包含重要的底物結(jié)合域(圖1A)。qPCR檢測結(jié)果表明，與同窩對(duì)照小鼠相比，出生后第4天(P4)時(shí)基因敲除小鼠的視網(wǎng)膜NMNAT1表達(dá)降低了75.6%(P<0.05)。進(jìn)一步Western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)，與同窩對(duì)照小鼠相比，P0時(shí)基因敲除小鼠的視網(wǎng)膜 NMNAT1 蛋白表達(dá)水平也顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖 1B)。

圖1 NMNAT1條件敲除小鼠模型的構(gòu)建與驗(yàn)證 A：視網(wǎng)膜特異性Six3-Cre介導(dǎo)的NMNAT1基因片段切除示意圖；LP示loxP 位點(diǎn)，E1-4示外顯子1-4。B：Western blot檢測P0時(shí)基因敲除(-/-)小鼠和同窩對(duì)照(+/+)小鼠視網(wǎng)膜中NMNAT1蛋白表達(dá)水平。

2.2 視網(wǎng)膜組織病理學(xué)檢查HE染色結(jié)果顯示(圖2)，P0時(shí)基因敲除小鼠和同窩對(duì)照小鼠的視網(wǎng)膜組織橫截面沒有明顯的形態(tài)差異(圖2A)，視網(wǎng)膜厚度比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖2E)； 然而，P4時(shí)基因敲除小鼠距離視神經(jīng)500 μm、1000 μm、1250 μm的視網(wǎng)膜厚度均明顯低于同窩對(duì)照小鼠(均為P<0.05)，并表現(xiàn)出視網(wǎng)膜內(nèi)層和外層中的分層破壞以及大規(guī)模細(xì)胞死亡的證據(jù)，視網(wǎng)膜外叢狀層(包含光感受器和雙極細(xì)胞神經(jīng)元突觸結(jié)構(gòu))已經(jīng)出現(xiàn)損傷，在中央視網(wǎng)膜中部最為嚴(yán)重(圖2B)。周邊視網(wǎng)膜厚度(距離視神經(jīng)1750 μm)尚未受影響(P>0.05，圖2F)。而P10時(shí)基因敲除小鼠距離視神經(jīng)500 μm、1000 μm、1250 μm、1750 μm的視網(wǎng)膜厚度與同窩對(duì)照小鼠相比均減少(均為P<0.05)，然而仍然可見內(nèi)層和外層視網(wǎng)膜神經(jīng)元的分界(圖2C、2G)。 P30時(shí)基因敲除小鼠全部視網(wǎng)膜內(nèi)外層的退化幾乎完成(圖 2D)。

圖2 NMNAT1缺失導(dǎo)致兩組小鼠視網(wǎng)膜出現(xiàn)組織學(xué)損傷(標(biāo)尺：20 μm) A、B、C、D分別為不同時(shí)期兩組小鼠視網(wǎng)膜橫截面HE染色；E、F、G分別為不同時(shí)期兩組小鼠視網(wǎng)膜厚度差異(與同窩對(duì)照小鼠相比，*P<0.05)。GCL：神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層；NBL：神經(jīng)母細(xì)胞層；IPL：內(nèi)叢狀層；OPL：外叢狀層；INL：內(nèi)核層；ONL：外核層；IS/OS：感光器內(nèi)段/外段層。+/+:同窩對(duì)照小鼠，-/-：基因敲除小鼠。

2.3 視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、雙極細(xì)胞和無長突細(xì)胞的存活狀態(tài)經(jīng)免疫熒光染色檢測P4和P10時(shí)基因敲除小鼠(P4和P10分別代表視網(wǎng)膜退化的早期和晚期階段)的視網(wǎng)膜切片，結(jié)果顯示(圖3)：P4和P10時(shí)，NMNAT1基因敲除小鼠[P4：(36±6)個(gè)，P10：(31±5)個(gè)]和同窩對(duì)照小鼠[P4：(29±5)個(gè)，P10：(29±4)個(gè)]的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的相對(duì)數(shù)量差異均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)(圖3A)。此外，P4時(shí)基因敲除小鼠與同窩對(duì)照小鼠相比，視網(wǎng)膜雙極細(xì)胞[(26±4)個(gè)、(28±3)個(gè)]和無長突細(xì)胞[(97±12)個(gè)、(168±19)個(gè)]的數(shù)量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)，但在P10時(shí)基因敲除小鼠視網(wǎng)膜中雙極細(xì)胞數(shù)量[(42±4)個(gè)]較同窩對(duì)照小鼠[(168±19)個(gè)]減少了約 75%(P<0.05)(圖3B)，視網(wǎng)膜無長突細(xì)胞的數(shù)量[(23±3)個(gè)]較同窩對(duì)照小鼠[(47±7)個(gè)]減少了約 51%(P<0.05)(圖3C)。

圖3 NMNAT1 缺失對(duì)兩組小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、雙極細(xì)胞和無長突細(xì)胞存活的影響(標(biāo)尺：20 μm) A：BRN3A熒光抗體陽性染色的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞；B：CALR熒光抗體陽性染色的無長突細(xì)胞；C：CHX10熒光抗體陽性染色的雙極細(xì)胞。

2.4 光感受器RCVRN和RHO的表達(dá)采用免疫熒光染色法定量小鼠光感受器的RCVRN和RHO表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與同窩對(duì)照小鼠相比，P4時(shí)基因敲除小鼠幾乎不表達(dá)RCVRN(圖4A)和RHO(均為P<0.05)(圖4B)。

圖4 NMNAT1缺失對(duì)P4時(shí)兩組小鼠RCVRN(A)和RHO(B)表達(dá)的影響(標(biāo)尺：20 μm)

3 討論

哺乳動(dòng)物的NMNAT存在3種亞型：NMNAT1、NMNAT2、NMNAT3[12-14]。而人類與嚙齒類動(dòng)物NMNAT的同源異構(gòu)體之間氨基酸序列的相似性很高。如人類NMNAT1與小鼠NMNAT1的氨基酸序列有80%左右的同源性[11-18]。因此，NMNAT1選擇性敲除小鼠是探索人類NMNAT1相關(guān)性眼病的理想模型。

本研究證明了小鼠視網(wǎng)膜NMNAT1缺陷會(huì)導(dǎo)致出生后不久光感受器、雙極細(xì)胞和無長突細(xì)胞的嚴(yán)重退化?？偟膩碚f，這種表型與文獻(xiàn)報(bào)道的視網(wǎng)膜NMNAT1 部分或完全抑制的研究一致，文獻(xiàn)指出在出生后第1周內(nèi)開始出現(xiàn)視網(wǎng)膜變性，并在1個(gè)月時(shí)基本完成[6]。雖然本研究描述的NMNAT1相關(guān)的視網(wǎng)膜變性的進(jìn)展相對(duì)更為迅速，但本研究在兩方面進(jìn)一步表征了這種表型：首先，評(píng)估了NMNAT1敲除后特定視網(wǎng)膜神經(jīng)元亞型的存活；其次，評(píng)估了NMNAT1敲除后光感受器的功能改變。

對(duì)NMNAT1敲除視網(wǎng)膜中特定細(xì)胞類型的檢查表明，NMNAT1敲除視網(wǎng)膜中存在嚴(yán)重的光感受器變性，也表明特定內(nèi)部視網(wǎng)膜神經(jīng)元群的喪失。雖然光感受器可能是NMNAT1相關(guān)病理學(xué)的主要目標(biāo)，但視網(wǎng)膜雙極細(xì)胞和無長突細(xì)胞在視網(wǎng)膜發(fā)育過程中也受到NMNAT1敲除的顯著影響。而神經(jīng)節(jié)細(xì)胞似乎在初期發(fā)育過程中不受NMNAT1敲除的影響，直到后期才顯示出受到NMNAT1敲除的影響。說明視網(wǎng)膜雙極細(xì)胞和無長突細(xì)胞亦為NMNAT1敲除相關(guān)視網(wǎng)膜變性的靶細(xì)胞，并且雙極細(xì)胞對(duì)NMNAT1敲除比無長突細(xì)胞更敏感。這些結(jié)果與最近的研究形成了部分對(duì)比，Kuribayashi等[13]和 Sasaki 等[14]在視網(wǎng)膜體外培養(yǎng)模型中敲除NMNAT1的研究中報(bào)道了更薄的INL，但在NMNAT1敲除的體外模型中表達(dá)HuC/D的無長突細(xì)胞或表達(dá)蛋白激酶Ca的雙極細(xì)胞的數(shù)量沒有變化。然而，這項(xiàng)研究確實(shí)報(bào)道了NMNAT1敲除體外模型中初級(jí)硝酸鹽反應(yīng)陽性的光感受器細(xì)胞的數(shù)量減少。在整個(gè)視網(wǎng)膜中，Six3啟動(dòng)子于胚胎第9.5天(E9.5)左右激活，并在 E12.5 時(shí)顯示出顯著增強(qiáng)的活性[17]。我們認(rèn)為，與Six3-Cre的E9.5激活相比，在體外模型中的NMNAT1在發(fā)育過程中被敲除的相對(duì)較晚[4,19]，這可以解釋無長突細(xì)胞和雙極細(xì)胞的結(jié)果差異。

來自共同祖細(xì)胞的各視網(wǎng)膜神經(jīng)元亞型的分化流程和緊密協(xié)調(diào)已經(jīng)得到廣泛研究與證實(shí)，最近的研究已經(jīng)開始探索哺乳動(dòng)物視網(wǎng)膜發(fā)育所需的大量表觀遺傳調(diào)控[2,20-23]。本研究創(chuàng)新之一是P4時(shí)NMNAT1敲除小鼠視網(wǎng)膜中幾乎不表達(dá)RHO和RCVRN。RHO是人眼中的視錐細(xì)胞所含的三種色覺感光色素中的一種，在光的作用下起色覺作用[20]，其他兩種是視藍(lán)質(zhì)、視青質(zhì)。RCVRN選擇性定位在視網(wǎng)膜中的鈣結(jié)合蛋白，參與RHO對(duì)視桿鳥苷酸環(huán)化酶的激活，可促進(jìn)環(huán)鳥苷酸的再合成、鈣通道的重開放及暗狀態(tài)的恢復(fù)[21-22]。雖然我們未使用NMNAT1抗體確定視網(wǎng)膜中 NMNAT1的表達(dá)分布，但先前的研究顯示，RT-qPCR結(jié)果證明NMNAT1是視桿細(xì)胞中NMNAT的主要表達(dá)亞型[10,13,24]。

總之，本研究表明了 NMNAT1缺失相關(guān)的早期和嚴(yán)重的視網(wǎng)膜變性涉及多種類型細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能損傷。NMNAT1 對(duì)光感受器、雙極細(xì)胞和無長突細(xì)胞的早期存活至關(guān)重要。