令狐紹容 羅泓揚(yáng)

糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是我國人群致盲的主要原因之一[1]。視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細(xì)胞因受到高糖環(huán)境的影響，通過分泌各種因子和信號(hào)分子影響神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、光感受器細(xì)胞、周細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞，從而有助于DR進(jìn)展[2]。玻璃體視網(wǎng)膜交界處纖維血管性視網(wǎng)膜前膜生長所致的視網(wǎng)膜前新血管生成和細(xì)胞外間質(zhì)擴(kuò)張是增生型糖尿病視網(wǎng)膜病變(PDR)的主要特征，而人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HRMECs)發(fā)生內(nèi)皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EndoMT)在其中發(fā)揮的作用不可忽視[3-4]。轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)超家族已被證明是EndoMT的重要調(diào)節(jié)因子[5-7]。

外泌體是一類直徑為50～150 nm的微小囊泡，可由不同類型的細(xì)胞分泌，包含mRNA、微小RNA(miRNA)、蛋白質(zhì)和其他信號(hào)分子，被認(rèn)為是細(xì)胞間通訊的重要介質(zhì)[8-9]。然而，釋放外泌體的細(xì)胞類型以及它們的目標(biāo)仍然是未知的。本研究通過分析人RPE細(xì)胞系A(chǔ)RPE-19細(xì)胞分泌的外泌體中miR-4488的表達(dá)對HRMECs增殖、遷移和血管生成的影響，來確定其在EndoMT中的潛在作用，希望為尋找PDR的有效治療靶點(diǎn)提供證據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及主要試劑、儀器ARPE-19細(xì)胞和HRMECs均購自美國ATCC微生物菌種保藏中心；Dulbecco改良鷹氏培養(yǎng)基/Ham’s F-12營養(yǎng)混合物(DMEM/F-12)購自美國Sigma-Aldrich公司；內(nèi)皮細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基-2(EBM-2)購自美國Lonza公司。PKH67熒光試劑盒購自美國Sigma-Aldrich公司。鼠抗CD63(貨號(hào)：ab59479)、兔抗CD9(貨號(hào)：ab92726)、兔抗HSP70(貨號(hào)：ab79951)、兔抗β-actin(貨號(hào)：ab8227)、兔抗TGF-β受體Ⅱ(TGFβR2)(貨號(hào)：ab186838)、鼠抗α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)(貨號(hào)：ab7817)購自英國Abcam公司；兔抗p-Smad2ser467(AF3449)、兔抗Smad2(AF6449)、兔抗Desmin(AF7013)購自江蘇Affinity公司。CCK-8試劑購自美國Sigma公司；Trizol試劑、PrimeScriptRTMaster Mix試劑盒購自大連寶生物有限責(zé)任公司；TaqMan miRNA芯片(含有754個(gè)miRNAs)購自美國Thermo公司；委托上海GenePharma公司克隆野生型和突變型(MUT1～MUT4)TGFβR2-3’-UTR熒光素酶報(bào)告載體(pmirGLO-TGFβR2-3’-UTRwt和pmirGLO-TGFβR2-3’-UTRmut)。JEM-1230型透射電子顯微鏡購自日本JEOL公司。ABI 7500熱循環(huán)儀購自美國Applied Biosystems公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組將ARPE-19細(xì)胞、HRMECs分別置于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM/F-12培養(yǎng)基或EBM-2培養(yǎng)基中，于含體積分?jǐn)?shù)5% CO2、37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。選擇第5代至第10代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。將ARPE-19細(xì)胞隨機(jī)分為空白組、高糖組。將HRMECs隨機(jī)分為NG組、HG組、NG+外泌體組和HG+外泌體組?？瞻捉M、NG組和NG+外泌體組細(xì)胞用含5.5 mmol·L-1正常濃度葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h；高糖組、HG組和HG+外泌體組細(xì)胞用含30 mmol·L-1高濃度葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h；NG+外泌體組和HG+外泌體組細(xì)胞在培養(yǎng)基中分別加入空白組或高糖組培養(yǎng)的ARPE-19細(xì)胞分泌的外泌體40 μg·L-1。

1.2.2 外泌體純化和鑒定取空白組和高糖組ARPE-19細(xì)胞，在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h后，以2000 r·min-1離心10 min，10 000 r·min-1離心30 min，經(jīng)0.22 μm微型過濾器過濾。采用超速離心法，在4 ℃以120 000 r·min-1超速離心70 min，用0.1 mol·L-1磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸，透射電鏡下觀察。用納米顆粒追蹤儀分析粒子直徑和分布。Western blot檢測外泌體特征標(biāo)志物CD63(1200)、CD9(1150)和HSP70(1200)的表達(dá)。

1.2.3 PKH67綠色熒光標(biāo)記分別取空白組和高糖組ARPE-19細(xì)胞分泌的外泌體顆粒，用PKH67(1 μmol·L-1)染色，不含外泌體的混合物用作陰性對照，37 ℃下培養(yǎng)5 min后，使用ExoQuick-TC收集外泌體。用鬼筆環(huán)肽-iFluro594對用EBM-2培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)1%去除外泌體的胎牛血清)培養(yǎng)的NG組和HG組HRMECs染色，然后與PKH67標(biāo)記的外泌體在37 ℃下孵育24 h，40 g·L-1多聚甲醛固定30 min，4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色細(xì)胞核。共焦顯微鏡下觀察HRMECs對外泌體的攝取。

1.2.4 細(xì)胞遷移和促血管形成實(shí)驗(yàn)將HRMECs(1×105個(gè)細(xì)胞)置于Transwell小室下層，分組處理后，用200 mL移液槍頭尖端劃出一道均勻痕跡。Transwell小室上層加入同樣葡萄糖培養(yǎng)基的ARPE-19細(xì)胞，在0 h和24 h時(shí)捕捉圖像。傷口距離是從至少3個(gè)隨機(jī)選擇的區(qū)域測量的。另外，將Transwell小室下層涂抹250 μL 10 g·L-1基質(zhì)凝膠后接種HRMECs，分組處理后，同上方法處理細(xì)胞，培養(yǎng)6 h后，顯微鏡下觀察，并用Imagepro plus軟件掃描血管結(jié)點(diǎn)數(shù)和血管總長度。

1.2.5 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)將HRMECs按每孔3×103個(gè)接種到96孔板中，過夜培養(yǎng)，分組處理后，加入CCK-8試劑孵育1 h，記錄各組細(xì)胞在450 nm波長的光密度。

1.2.6 miRNA微陣列分析取空白組和高糖組ARPE-19細(xì)胞外泌體，用Trizol試劑提取總RNA，用PrimeScriptRTMaster Mix試劑盒合成cDNA。采用TaqMan miRNA芯片對2組ARPE-19細(xì)胞進(jìn)行miRNA表達(dá)譜分析。用DataAssist v3.01軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測目標(biāo)基因表達(dá)，用2-ΔΔCt法計(jì)算目標(biāo)基因的相對表達(dá)量，U6作為miRNA的小分子內(nèi)參。為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR-4488相對表達(dá)量，使用RiboTMmRNA/lncRNA qRT-PCR Starter試劑盒和ABI 7500熱循環(huán)儀對cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。最終反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min，1個(gè)循環(huán)；94 ℃變性30 s，55～62 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，36個(gè)循環(huán)。引入序列如下：miR-4488正向引物為5’-AGGGGGCGGGCUCCGGCG-3’，反向引物為5’-GAACATGTCTGCGTATCTC-3’；U6 mRNA正向引物為5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，反向引物為5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’。

1.2.7 miR-4488靶標(biāo)預(yù)測及雙熒光素酶報(bào)告分析miR-4488靶標(biāo)預(yù)測和分析采用TargetScan(http://www.targetscan.org/)、 miRWalk(http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/)和miRanda(http://www.microrna.org/)在線工具進(jìn)行。發(fā)現(xiàn)了4個(gè)潛在的結(jié)合位點(diǎn)。為了確定 miR-202-5p與TGFβR2基因周圍序列的結(jié)合特異性，在HEK293T細(xì)胞中進(jìn)行了雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞接種到24孔板中，用脂質(zhì)體法將20 pmol miR-4488模擬物或?qū)φ漳M物與800 ng TGFβR2wt或TGFβR2mut共轉(zhuǎn)染，分為miR-4488模擬物+TGFβR2wt組、miR-4488模擬物+TGFβR2mut組、對照模擬物+TGFβR2wt組、對照模擬物+TGFβR2mut組。轉(zhuǎn)染48 h后洗滌細(xì)胞，用雙熒光素酶報(bào)告基因分析系統(tǒng)測定細(xì)胞內(nèi)熒光素酶活性。

1.2.8 Western blot檢測TGFβR2、Smad2、p-Smad2ser467蛋白表達(dá)取各組HRMECs，用含有磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液對外泌體顆粒或細(xì)胞進(jìn)行酶解提取總蛋白。取等量蛋白裝載到凝膠上，經(jīng)電泳分離后，將目的條帶轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上。然后與初級抗體在室溫下孵育1 h或在4 ℃條件下孵育過夜，然后將膜洗凈，與適量辣根過氧化物酶結(jié)合的二抗在室溫下孵育1 h。使用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)可視化標(biāo)記的特定蛋白，記錄TGFβR2、Smad2、p-Smad2ser467蛋白相對表達(dá)量。

1.2.9 免疫熒光染色觀察Desmin和α-SMA表達(dá)取各組HRMECs在玻璃蓋玻片上貼壁生長，用40 g·L-1多聚甲醛固定過夜，然后用含體積分?jǐn)?shù)5%正常山羊血清、體積分?jǐn)?shù)0.1% Triton X-100的1×PBS在室溫下阻斷1 h，加入Desmin和α-SMA一抗于 4 ℃ 孵育過夜，加入二抗，用4,6-二氨基-2-苯基吲哚(1500)反染細(xì)胞核，共聚焦顯微鏡(TCS SP8)下拍攝圖像并分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 19.0軟件包對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，進(jìn)行單因素方差分析和Bonferroni或Dunnettt檢驗(yàn)兩兩比較。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 ARPE-19細(xì)胞分泌外泌體的鑒定透射電鏡下觀察可見，所提取的顆粒形態(tài)為圓形(圖1A)。經(jīng)納米顆粒追蹤儀分析，空白組和高糖組ARPE-19細(xì)胞分泌的外泌體直徑分別為(96.8±4.6)nm和(95.4±3.5)nm,直徑范圍均為 50～150 nm，兩組ARPE-19細(xì)胞分泌的外泌體直徑相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；空白組和高糖組ARPE-19細(xì)胞分泌的外泌體濃度分別為(3.78×1012±1.03×1011)個(gè)·mL-1和(5.35×1012±1.07×1011)個(gè)·mL-1，高糖組ARPE-19細(xì)胞分泌的外泌體濃度略高于空白組(P<0.05)(圖1B)。Western blot檢測結(jié)果顯示，這些顆粒存在外泌體特征標(biāo)記，包括CD63、CD9、HSP70蛋白表達(dá)陽性(圖1C)。

圖1 空白組和高糖組ARPE-19細(xì)胞分泌的外泌體的鑒定 A：透射電鏡下觀察結(jié)果；B：納米顆粒追蹤分析； C：Western blot檢測外泌體標(biāo)志蛋白表達(dá)。1：NG組；2：HG組。

2.2 HRMECs對ARPE-19細(xì)胞分泌外泌體的吸收空白組和高糖組ARPE-19細(xì)胞分泌的外泌體被PKH67標(biāo)記后加入EBM-2培養(yǎng)基,都可被其內(nèi)培養(yǎng)的HRMECs吸收(圖2)。

圖2 熒光分析檢測NG組和HG組HRMECs(藍(lán)色)可吸收PKH67標(biāo)記(綠色)的ARPE-19細(xì)胞分泌的外泌體

2.3 ARPE-19細(xì)胞分泌的外泌體對HRMECs增殖、遷移和血管生成的影響與NG組相比，HG組HRMECs細(xì)胞光密度由0.673±0.044增加至0.786±0.051，細(xì)胞遷移率由45.57%±4.30%增加至67.22%±6.50%，血管結(jié)點(diǎn)數(shù)由(9±2)個(gè)增加至(29±5)個(gè)，血管總長度由(7250±332)μm增加至(15 000±582)μm，兩組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。與HG組相比，HG+外泌體組HRMECs細(xì)胞光密度、細(xì)胞遷移率、血管結(jié)點(diǎn)數(shù)和血管總長度分別減少至0.720±0.033、59.30%±3.17%、(20±3)個(gè)和(10 500±579)μm(均為P<0.05)；NG+外泌體組HRMECs細(xì)胞光密度、細(xì)胞遷移率、血管結(jié)點(diǎn)數(shù)和血管總長度分別為0.668±0.043、43.26%±4.09%、(8±2)個(gè)和(7025±405) μm，與NG組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)。

2.4 miRNA微陣列分析與空白組相比，高糖組ARPE-19細(xì)胞分泌的外泌體顆粒中36個(gè)miRNA表達(dá)上調(diào)，包括miR-4488、miR-199b-5p和miR-708-5p；有70個(gè)miRNA表達(dá)下調(diào)(圖3)。其中miR-4488上調(diào)最明顯(變化倍數(shù)超過20倍)。利用qRT-PCR驗(yàn)證，與空白組相比，高糖組ARPE-19細(xì)胞外泌體中miR-4488相對表達(dá)量分別由1.00±0.08增加至1.45±0.10。

圖3 ARPE-19細(xì)胞分泌的外泌體miRNAs微陣列確定候選miRNA的火山圖

2.5 HRMECs中TGF/Smad信號(hào)通路變化與NG組相比，HG組HRMECs中TGFβR2、p-Smad2ser467蛋白相對表達(dá)量分別由1.011±0.150、0.468±0.072增加至2.985±0.117、1.226±0.085(均為P<0.05)，而與HG組相比，HG+外泌體組HRMECs中TGFβR2、p-Smad2ser467蛋白相對表達(dá)量降低至1.705±0.106、1.014±0.051(均為P<0.05)。NG+外泌體組HRMECs中TGFβR2、p-Smad2ser467蛋白相對表達(dá)量分別為0.985±0.147、0.501±0.100，與NG組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)。Smad2蛋白相對表達(dá)量4組間相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)(圖4)。

圖4 Western blot檢測各組TGFβR2、Smad2、p-Smad2ser467蛋白表達(dá)

2.6 miR-4488靶基因預(yù)測及生物信息學(xué)分析結(jié)果經(jīng)在線工具檢索，TGFβR2的3’UTR區(qū)域含有2個(gè)miR-4488的結(jié)合位點(diǎn)(圖5)，經(jīng)雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，與對照模擬物+TGFβR2wt組相比，miR-4488模擬物+TGFβR2wt組2個(gè)位點(diǎn)的雙熒光素酶活性由1.00±0.081、1.00±0.083分別降低至0.512±0.044、0.623±0.064(均為P<0.05)，而與對照模擬物+TGFβR2mut組2個(gè)位點(diǎn)的雙熒光素酶活性(1.01±0.07、1.00±0.07)相比，miR-4488模擬物+TGFβR2mut組雙熒光素酶活性基本不變,分別為0.97±0.10、0.98±0.10,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)。

圖5 TGFβR2的3’UTR區(qū)域miR-4488的結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測

2.7 ARPE-19細(xì)胞分泌的外泌體通過miR-4488調(diào)節(jié)HRMECs EndoMT進(jìn)程與NG組(設(shè)為1.00)相比，HG組HRMECs的間充質(zhì)表型標(biāo)志物Desmin和α-SMA蛋白熒光強(qiáng)度均明顯增加，分別為37.12±4.70和9.82±1.74,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)；而與HG組相比，HG+外泌體組HRMECs細(xì)胞中Desmin和α-SMA蛋白熒光強(qiáng)度均降低，分別為11.30±2.13和0.50±0.46，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。此外，NG+外泌體組HRMECs中Desmin和α-SMA蛋白熒光強(qiáng)度與NG組相比基本一致，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)(圖6)。

圖6 免疫熒光染色檢測各組HRMECs中Desmin和α-SMA蛋白表達(dá)

3 討論

RPE層主要介導(dǎo)視網(wǎng)膜感光細(xì)胞和絨毛膜毛細(xì)血管之間的聯(lián)系，為視網(wǎng)膜提供結(jié)構(gòu)性支持，也有助于視網(wǎng)膜的完整性、新陳代謝和功能維持[3,10-11]。有研究表明，RPE細(xì)胞在高糖條件下表現(xiàn)為早期功能障礙，隨后出現(xiàn)光感受器細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞損傷[11]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)高糖組ARPE-19細(xì)胞能夠分泌大量的含有miR-4488的外泌體，而miR-4488可進(jìn)一步通過靶向TGFβR2的3’UTR，減緩或抑制了高糖誘導(dǎo)的HRMECs的EndoMT進(jìn)程。

高糖可誘導(dǎo)毛細(xì)血管變性，如血-視網(wǎng)膜屏障損傷或滲漏和細(xì)胞增殖，導(dǎo)致視網(wǎng)膜新生血管形成。腫瘤壞死因子α、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、TGF-β和成纖維細(xì)胞生長因子等都能加速這一過程[12-14]。外泌體中含有大量遺傳物質(zhì)和蛋白質(zhì)，使之成為細(xì)胞與細(xì)胞之間信息交流的關(guān)鍵介質(zhì)[8-9]。因此，我們假設(shè)RPE細(xì)胞來源的外泌體可能是內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙的原因之一。正如預(yù)期的那樣，大量的外泌體在高糖條件下由ARPE-19細(xì)胞釋放，然后由HRMECs內(nèi)化。說明外泌體通過調(diào)節(jié)血管生成相關(guān)因子的表達(dá)進(jìn)而在內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和血管生成中發(fā)揮重要的生理和病理作用[15]，這為PDR的治療提供了一個(gè)新的候選靶點(diǎn)。

在各種人類纖維性疾病中，從纖維性組織中分離出來的內(nèi)皮細(xì)胞能夠產(chǎn)生肌纖維母細(xì)胞，但這些細(xì)胞缺失內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物[16-19]。EndoMT最初是在心臟發(fā)育過程中發(fā)現(xiàn)的，隨后的研究逐漸揭示了它在肝臟、角膜、肺臟、真皮和腎臟纖維化的發(fā)展和進(jìn)程中的重要作用[17-18]。TGF-β超家族被認(rèn)為是EndoMT的重要調(diào)節(jié)者，通過Smad依賴和非依賴途徑，直接調(diào)節(jié)EndoMT誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子。內(nèi)皮功能障礙是糖尿病慢性并發(fā)癥的主要病變基礎(chǔ)，先前的研究已經(jīng)證實(shí)，EndoMT與PDR相關(guān)的纖維化進(jìn)展有關(guān)[19]。本研究我們發(fā)現(xiàn)，在高糖條件下，HRMECs中TGF-β/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被激活，且這種激活狀態(tài)可被ARPE-19細(xì)胞分泌的外泌體顯著逆轉(zhuǎn)。此外我們還發(fā)現(xiàn)，高糖可誘導(dǎo)外泌體中miR-4488高表達(dá)，而這又與TGF-β/Smad信號(hào)通路的失活有關(guān)。說明ARPE-19細(xì)胞分泌的外泌體也介導(dǎo)了miR-4488的細(xì)胞間傳遞，進(jìn)而抑制高糖誘導(dǎo)的HRMECs的間充質(zhì)表型標(biāo)志物Desmin和α-SMA蛋白表達(dá)上調(diào)。這些數(shù)據(jù)均證實(shí)，高糖環(huán)境中ARPE-19細(xì)胞分泌的外泌體逆轉(zhuǎn)高糖誘導(dǎo)EndoMT進(jìn)程的作用機(jī)制之一可能與上調(diào)miR-4488表達(dá)有關(guān)。因此，促進(jìn)RPE細(xì)胞釋放包含大量miR-4488的外泌體和抑制HRMECs EndoMT進(jìn)程可能是阻止或延緩PDR患者視網(wǎng)膜纖維化的必要條件。

綜上，HRMECs EndoMT進(jìn)程和RPE細(xì)胞之間存在著重要的相互影響，提示在高糖條件下，ARPE-19細(xì)胞釋放的外泌體可通過miR-4488/TGFβR2/Smad介導(dǎo)的機(jī)制抑制HRMECs EndoMT進(jìn)程。我們認(rèn)為，RPE細(xì)胞可能在高糖調(diào)節(jié)HRMECs表型中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。