楊樂天，楊晨，顏曉飛，石暢，左庚鑫，陳芳

(聊城大學(xué)藥學(xué)院，山東 聊城 252059)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)，是一種常見的炎癥性腸道疾病，具有慢性、反復(fù)性、非特異性等特點(diǎn)[1-2]。該病的發(fā)病部位主要集中在大腸、結(jié)腸黏膜及黏膜下層[3]。UC的發(fā)病機(jī)制目前尚未明確，通常認(rèn)為該病的病因與遺傳、環(huán)境、免疫系統(tǒng)和腸道菌群等因素有關(guān)[4]?；颊叩呐R床癥狀主要表現(xiàn)為嚴(yán)重腹瀉、腹痛、便血和腸道菌群失衡[5]等。近年來，UC在亞洲的發(fā)病率呈增長趨勢[6]。目前用于治療UC的西藥[7]存在治療效果不穩(wěn)定及其副產(chǎn)物對肝腎有毒性等問題[8]。因此，研究篩選治療效果穩(wěn)定且毒副作用小的藥物成為臨床治療UC的當(dāng)務(wù)之急。

魚腥草(HC)是一種具有特殊氣味的多年生、三白草科草本植物，在日本、韓國、中國都有分布[9]。HC具有較高的食用和藥用價(jià)值，它在傳統(tǒng)保健[10]和治療中發(fā)揮著重要的作用。目前大量的科學(xué)數(shù)據(jù)也證實(shí)了HC提取物擁有潛在的價(jià)值[11-14]。魚腥草總黃酮為魚腥草活性成分之一，具有抑菌、抗過敏和延緩衰老等作用[15]。本研究選取魚腥草總黃酮作為本實(shí)驗(yàn)的研究對象，建立小鼠結(jié)腸炎模型，通過分析魚腥草總黃酮對結(jié)腸炎小鼠體重變化、炎癥因子等指標(biāo)的影響，探索魚腥草總黃酮對小鼠UC的治療作用，克服目前臨床主流藥物效果不穩(wěn)定及毒副作用等問題，為今后UC的臨床治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性ICR小鼠，SPF級(jí)，體重16～20 g。購自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司[生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK9(魯)20190003]。單籠飼養(yǎng)(29 cm×18 cm×16 cm),光照12L∶12D，溫度(23±1)℃，適應(yīng)環(huán)境7 d，自由取食(北京科澳協(xié)力飼料有限公司生產(chǎn)的小鼠飼料)和飲水。

1.2 主要試劑與儀器設(shè)備 魚腥草提取物(10∶1，西安瑞林生物科技有限公司)；纖維素酶(10 000 U·L-1，南寧東恒華道生物科技有限公司)；葡聚糖硫酸鈉鹽(MW36000-50000，上海翊圣生物科技有限公司)；免疫試劑盒(TNF-α、IL-1α、IP10和IFN-γ，武漢云克隆科技有限公司)；免疫試劑盒(Cr、BUN、ALT和AST，南京建成生物工程研究所)；磷酸緩沖鹽溶液(PBS)、多聚甲醛(北京Solarbio公司)。

電子天平[奧豪斯儀器(上海)有限公司(GB/T26497)]；高速冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf公司)；立式壓力蒸汽滅菌器[濟(jì)南德強(qiáng)儀器有限公司(MJ376CD)]；優(yōu)普系列超純水儀[成都超純科技有限公司(UPR-I-10T)]；漩渦振蕩器[大龍生物科技有限公司(MX-E)]；海信冰箱[海信(北京)電器(BCD-230F/WS)]。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 魚腥草總黃酮的制備及檢測 稱取魚腥草提取物5 g，加入纖維素酶至終濃度300 U·mL-1，參考梁燕妮等[16]的提取魚腥草總黃酮工藝條件,本實(shí)驗(yàn)選用的提取條件為料液比1∶30，超聲波輔助提取18 min，超聲功率為300 W，乙醇濃度為55%，溫度為室溫。過濾后取上清液用石油醚1∶1萃取，40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干燥，用60%乙醇溶出，采用冷凍干燥的方法得到總黃酮凍干粉。以含量較高的蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品對照，采用高效液相色譜法測定魚腥草總黃酮溶液的含量。

1.3.2 小鼠DSS模型建立及藥物治療 將小鼠隨機(jī)分為6個(gè)組：空白對照組、DSS模型組、柳氮磺胺吡啶組、魚腥草總黃酮中劑量組、魚腥草總黃酮高劑量組、蘆丁組，每組10只小鼠。小鼠適應(yīng)環(huán)境7 d，正常組小鼠自由飲用二次水，給予足量的鼠糧；其他組小鼠參考藥量為0.1～0.3 mL/10 g[17]，每天定時(shí)用3.5% DSS溶液自由飲水處理，連續(xù)飲用9 d，接著與正常組小鼠一樣，連續(xù)3 d自由飲用二次水，整個(gè)建模周期為12 d。每天記錄小鼠體重、糞便黏稠度和糞便隱血情況。誘導(dǎo)期結(jié)束后，除空白對照組和DSS模型組外，其他4個(gè)組用對應(yīng)藥物對小鼠進(jìn)行灌胃處理，藥物處理時(shí)間為6 d。

1.3.3 疾病活動(dòng)指數(shù) 小鼠DAI指數(shù)，又稱為疾病活動(dòng)指數(shù)，即DAI Score=體重下降評分+糞便黏稠度評分+糞便隱血評分[18]。體重下降評分標(biāo)準(zhǔn)：0～5% 1分，5%～10% 2分，10%～15% 3分，>15% 4分。糞便黏稠度評分標(biāo)準(zhǔn)：正常0分，稀便2分，腹瀉3分。糞便隱血評分標(biāo)準(zhǔn)：正常0分，陽性2分，血便3分。每天按照小鼠編號(hào)記錄小鼠體重、糞便黏稠度和糞便隱血情況。

1.3.4 肝腎系數(shù)、結(jié)腸系數(shù)和組織病理學(xué)切片 取出小鼠肝腎和結(jié)腸，做好稱重記錄。結(jié)腸系數(shù)=結(jié)腸長度/體重；肝腎系數(shù)=肝腎質(zhì)量/體重。結(jié)腸病理切片的石蠟包埋、切片、HE染色等工作由濟(jì)南賽維爾公司完成。

1.3.5 炎癥因子和肝腎功能因子測定 小鼠眼球取血，離心取血清-80 ℃保存?zhèn)溆茫糜谘装Y因子和肝腎功能因子的測定，炎癥因子的測定采用酶聯(lián)免疫吸附試劑盒測定，肝腎功能因子肌酐、血尿素氮、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶均采用試劑盒測定。

1.3.6 腸道菌群的測定 收集小鼠糞便進(jìn)行16S rRNA V4區(qū)擴(kuò)增構(gòu)建測序文庫，相關(guān)工作由天津諾禾致源生物信息科學(xué)有限公司完成。

1.3.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法 采用IBM SPSS 24.0軟件對組間數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析，各組數(shù)據(jù)結(jié)果都以Mean±SD的形式表示，組內(nèi)采用ANOVA單因素方差分析，P≤0.05，表示有顯著性差異。運(yùn)用GraphPad Prism 8.0進(jìn)行作圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 魚腥草總黃酮的制備及檢測 本實(shí)驗(yàn)以魚腥草葉片純提取物為原料，采用HPLC對魚腥草總黃酮提取物與蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測。在283 nm處，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品100 mg·L-1的保留時(shí)間在14.764 min，魚腥草總黃酮提取物保留時(shí)間在13.249 min，可以判斷魚腥草總黃酮中含有蘆丁這種物質(zhì)，并且根據(jù)峰形可看出，提取效果良好。圖1～2為蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液與魚腥草總黃酮對照色譜。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

圖2 魚腥草總黃酮提取物蘆丁成分色譜圖

2.2 小鼠體重變化及DAI指數(shù)測定 表1為圖1對應(yīng)的小鼠體重變化數(shù)據(jù)。建模成功后，從第13天開始給藥，第15天、第18天時(shí)，與治療組小鼠相比較，DSS模型組小鼠的體重極顯著下降，空白對照組與DSS模型組相比，體重極顯著增加(見圖3)，P<0.01。其中，魚腥草總黃酮中、高劑量在改善體重下降的治療效果上沒有顯著差異，魚腥草總黃酮高劑量比蘆丁改善效果好，但不如SASP效果好?？梢婔~腥草總黃酮對DSS誘導(dǎo)小鼠腸炎所致的體重下降有一定的改善作用。

表1 小鼠體重變化(Mean±SD，n=10)

圖3 小鼠體重變化

由圖4可知，魚腥草總黃酮中、高劑量治療組的小鼠DAI評分相比DSS模型組小鼠顯著降低，并且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；蘆丁組和SASP組小鼠DAI評分極顯著降低(P<0.01)。但魚腥草總黃酮中、高劑量組的DAI評分與蘆丁組DAI評分差異不顯著，因此可判斷總黃酮在治療DSS小鼠腸炎的過程中效果與蘆丁相當(dāng)。

圖4 魚腥草總黃酮對小鼠DAI指數(shù)的影響

2.3 結(jié)腸外觀和結(jié)腸系數(shù) 由圖5可知，魚腥草總黃酮可以改善DSS導(dǎo)致的結(jié)腸腫脹，并且可以顯著減少DSS小鼠結(jié)腸縮短的程度(P<0.05)。由圖6可知，與DSS組相比，魚腥草總黃酮高劑量組的結(jié)腸系數(shù)降低有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；魚腥草總黃酮中劑量組的結(jié)腸系數(shù)降低有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

圖5 魚腥草總黃酮對小鼠結(jié)腸外觀形態(tài)的影響

圖6 魚腥草總黃酮對小鼠結(jié)腸系數(shù)的影響(Mean±SD，n=10)

2.4 肝腎系數(shù) 由圖7可知，DSS誘導(dǎo)的小鼠肝腎系數(shù)會(huì)極顯著增加(P<0.01)，SASP組略高于空白對照組，考慮到可能是連續(xù)服用SASP產(chǎn)生的副產(chǎn)物對小鼠肝腎代謝帶來多余的負(fù)擔(dān)，使得SASP組的肝腎系數(shù)相對增加。

2.5 組織病理學(xué)切片 從圖8腸切片可以看出，DSS模型組腸黏膜外壁和內(nèi)壁厚薄不均，黏膜內(nèi)層有潰瘍面形成，炎性細(xì)胞增多，隠窩變形粘連；空白組小鼠腸黏膜完整且上皮排列有序，無炎性細(xì)胞浸潤，隠窩清晰；中劑量黃酮組還存在著少量的潰瘍面和炎性細(xì)胞浸潤，相比DSS組病變程度減輕了很多；高劑量黃酮組未見明顯的潰瘍面，隠窩結(jié)構(gòu)和黏膜壁厚度也較為清晰，但是恢復(fù)效果不如SASP組，蘆丁組切片中，還存在著少量的炎性細(xì)胞，但是腺體結(jié)構(gòu)較為完整，比中劑量組要改善很多。這說明魚腥草總黃酮可以改善DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸潰瘍，并且治療效果呈劑量依賴關(guān)系。

圖8 小鼠結(jié)腸病理組織切片分析

2.6 炎癥因子 由表2所示，DSS模型組中IFN-γ、IL-1α、IP10和TNF-α 4種炎癥因子的含量都遠(yuǎn)高于空白對照組，統(tǒng)計(jì)分析，兩組之間差異極顯著P<0.01；對比給藥組和DSS模型組可以發(fā)現(xiàn)，給藥組的炎癥因子含量要低于DSS模型組，并且差異極顯著，P<0.01；但是給藥組炎癥因子含量整體水平都要高于空白對照組，其中魚腥草總黃酮高劑量組和SASP組降低炎癥因子的效果較好。

表2 TNF-α、IL-1α、IP10和IFN-γ水平

2.7 肝腎功能因子 由表3所示，DSS模型組在ALT、AST、CR和BUN水平上表達(dá)量上調(diào)，并且顯著高于空白對照組，兩組之間差異極顯著，P<0.01；對比給藥組和DSS組，可以發(fā)現(xiàn)，魚腥草總黃酮中、高劑量組在ALT、AST、CR水平上，極顯著低于DSS模型組，P<0.01；在BUN水平上，魚腥草總黃酮高劑量組顯著低于DSS模型組，P<0.05；SASP組在ALT和CR水平上略高于給藥組，考慮可能為SASP對肝腎帶來的副作用。結(jié)果表明，魚腥草總黃酮可以減輕DSS帶來的小鼠肝腎指標(biāo)異常，對肝腎起到了一定的保護(hù)作用。

表3 小鼠血清中ALT、AST、CR和BUN水平檢測

2.8 腸道菌群的測定 從圖9可看出，樣品量較少時(shí)，箱型圖的增勢較陡，表明樣本量不足，不能完全反應(yīng)物種豐富度，但隨著樣本量的增多，箱型圖陡勢減弱并逐漸趨于平緩，表明樣本量充足，沒有新的物種出現(xiàn)，可以進(jìn)行樣本分析。

圖9 物種累積箱型圖

擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、變形桿菌門(Proteobacteria)均為優(yōu)勢菌群，它們是腸道內(nèi)普遍存在的主要菌群。由圖10表明，與空白對照組相比，其他組的厚壁菌門所占腸道菌群的比例顯著減小，而擬桿菌門和變形菌門占比增加。除DSS組以外，可以直觀地看到魚腥草總黃酮中、高劑量組的腸道菌群構(gòu)成比例接近空白對照組，可見魚腥草總黃酮可以改善小鼠腸道內(nèi)菌群的分布。其中G2改善效果最好，其次是G1，最后是G3。SASP雖然可以治療小鼠結(jié)腸炎，但對小鼠腸道菌群的分布有不利的影響，這一點(diǎn)可以看魚腥草總黃酮在治療腸炎和改善腸道內(nèi)菌群分布具有一定的優(yōu)勢。

圖10 小鼠腸道菌群門水平上的物種相對豐度柱形圖

3 結(jié)論

近年來，黃酮類化合物因其抗炎、抗氧化和增強(qiáng)機(jī)體免疫機(jī)能等活性[19]，在防治潰瘍性結(jié)腸炎方面逐漸成為研究的熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)探索了魚腥草總黃酮對小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的治療作用。綜上所述，魚腥草總黃酮提取物可有效改善結(jié)腸炎造成的小鼠體重下降、便血、腸梗阻和腸黏膜損傷等病理現(xiàn)象，降低疾病指數(shù)、結(jié)腸系數(shù)和肝腎系數(shù)，有效抑制炎癥因子和肝腎因子的提高，并且在一定程度上呈劑量依賴性。另外通過小鼠腸道菌群宏基因組分析可得，魚腥草總黃酮可以從不同程度上改善菌群種類的比例分布，維持腸道微生態(tài)穩(wěn)定。因此，魚腥草總黃酮的作用機(jī)制可能是抑制炎癥因子的表達(dá)量上調(diào)，調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)紊亂，其具體的作用機(jī)制需要進(jìn)一步研究與證實(shí)。這些發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步研究魚腥草黃酮的藥理作用提供了新的思路，同時(shí)魚腥草是一種藥食同源的植物，種植成本低且?guī)缀鯚o毒副作用。因此，魚腥草黃酮可以作為一種新的結(jié)腸炎防治候選藥物進(jìn)行開發(fā)利用。