朱海俠 陳 雷 查代燦 張惠云 胡曉涵 包松英

（兆豐華生物科技（福州）有限公司 福州 350014）

豬瘟（Classical swine fever，CSF）是由豬瘟病毒（CSFV）引起的豬和野豬高接觸性、高致病性的傳染病[1]，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。該病一年四季均可發(fā)生，但以春、夏等多雨季節(jié)多發(fā)。不同日齡、不同品種的家豬和野豬對(duì)豬瘟病毒均易感。該病被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織列為A類烈性傳染病，被我國(guó)農(nóng)業(yè)部列為一類傳染病，是目前阻礙我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的首要?jiǎng)游飩魅静2]。疫苗免疫接種是防控該病的主要措施，豬瘟大流行現(xiàn)狀已經(jīng)得到根除，但仍存在區(qū)域性、點(diǎn)狀散發(fā)性流行[3]。究其原因，豬瘟疫苗的抗原含量是影響豬群免疫效果的重要因素之一。

目前針對(duì)豬瘟病毒的檢測(cè)主要有RT-PCR檢測(cè)技術(shù)、熒光定量PCR檢測(cè)方法、LAMP方法、免疫熒光技術(shù)（IFA）、兔體定型熱反應(yīng)等。PCR相關(guān)技術(shù)主要針對(duì)的是病毒核酸，因此，在弱毒疫苗的評(píng)定過(guò)程中很難準(zhǔn)確確定其活病毒的含量。由于豬瘟病毒感染細(xì)胞后不產(chǎn)生細(xì)胞病變，其病毒含量的測(cè)定主要依賴于傳統(tǒng)的免疫熒光技術(shù)或兔體定型熱反應(yīng)進(jìn)行判定。兔體定型熱反應(yīng)作為一種檢測(cè)豬瘟弱毒疫苗效價(jià)的傳統(tǒng)方法，受大兔個(gè)體差異影響較大，且耗時(shí)較長(zhǎng)，費(fèi)用較高。IFA檢測(cè)方法是目前檢測(cè)CSFV的一種重要的輔助方法，但該方法對(duì)設(shè)備要求較高，不利于推廣應(yīng)用。

免疫過(guò)氧化物酶單層細(xì)胞試驗(yàn)（IPMA），其主要原理是通過(guò)抗原抗體的相互作用，產(chǎn)生特異性顯色反應(yīng)，通過(guò)光學(xué)顯微鏡肉眼即可觀察并判定結(jié)果[4]。此外，制備的細(xì)胞板可以在4℃條件下長(zhǎng)期保存，反應(yīng)結(jié)果也可以長(zhǎng)期儲(chǔ)存，隨時(shí)觀察[5]。本研究采用免疫過(guò)氧化物酶單層細(xì)胞試驗(yàn)，建立一種能夠快速應(yīng)用于生產(chǎn)中的病毒含量檢測(cè)方法，旨在為豬瘟疫苗生產(chǎn)提供快速的評(píng)價(jià)工具。

1 材料與方法

1.1 毒株、細(xì)胞系豬瘟病毒C株、ST細(xì)胞系由兆豐華生物科技（福州）有限公司保存。

1.2 主要耗材3-氨基-9-乙基咪唑（AEC）、羊抗兔HPR-IgG購(gòu)自Sigma公司；試驗(yàn)用陽(yáng)性血清為豬瘟病毒（C株）免疫家兔后制備的高免血清樣品；陰性血清為健康家兔血清樣品；PEDV陽(yáng)性、PRRSV陽(yáng)性及PCV2陽(yáng)性血清均由本公司保存?zhèn)溆茫?6孔細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)自costar公司；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自GBICO；BSA購(gòu)自Biosharp；其余分析純?cè)噭┵?gòu)自國(guó)藥公司。

1.3 IPMA步驟將生長(zhǎng)狀況良好的ST細(xì)胞鋪于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞長(zhǎng)至70%～80%時(shí)，棄去培養(yǎng)液，接種一定濃度的豬瘟病毒，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育1 h，期間每20 min搖晃一次，同時(shí)設(shè)立未接毒的對(duì)照組。吸附結(jié)束后，加入一定量DMEM液體繼續(xù)培養(yǎng)一段時(shí)間；棄去培養(yǎng)液，用一定量PBS進(jìn)行潤(rùn)洗，洗滌3次，干燥后加入含0.3%H2O2的甲醇溶液進(jìn)行固定，作用10 min；棄去液體，用一定量PBS進(jìn)行潤(rùn)洗后干燥處理，加入0.02%trition作用10 min；棄去液體，用一定量PBS進(jìn)行潤(rùn)洗后干燥處理，加入一定量5%BSA(Bovine serum albumin)進(jìn)行封閉2 h；棄去液體，用一定量PBS進(jìn)行潤(rùn)洗后干燥處理，加入一定濃度的高免血清作為一抗，37℃作用一段時(shí)間；棄去液體，用一定量PBS進(jìn)行潤(rùn)洗后干燥處理，加入一定濃度羊抗兔HRP-IgG二抗，37℃作用一段時(shí)間；棄去液體，用一定量PBS進(jìn)行潤(rùn)洗后干燥處理，加入AEC，37℃作用15 min，ddH2O終止，光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.3.1 IPMA反應(yīng)條件的優(yōu)化

1.3.1.1 最佳一抗、二抗工作濃度及病毒作用時(shí)間的確定 取細(xì)胞長(zhǎng)至70%～80%的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，加入已知濃度的豬瘟病毒，設(shè)置不加病毒對(duì)照孔，孵育1 h后，加入DMEM液體培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱分別作用24 h、48 h，72 h后進(jìn)行固定處理， 加 入1∶50、1∶100、1∶150、1∶200、1∶300、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200稀釋的一抗，每個(gè)稀釋度加一縱列，將羊抗兔HRP-IgG抗體按照1∶250、1∶500、1∶1 000、1∶2 000比例進(jìn)行稀釋，每個(gè)稀釋度加一橫列，100 uL/孔，每個(gè)濃度設(shè)2個(gè)重復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照和空白對(duì)照，按照上述步驟，觀察染色結(jié)果，確定最佳一抗、二抗及病毒作用時(shí)間。

1.3.1.2 固定液的選擇 棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS潤(rùn)洗3次，分別加入含0.3%H2O2的甲醇、80%丙酮、33%丙酮溶液進(jìn)行固定，室溫固定10 min后，棄去固定液，用PBS潤(rùn)洗2次，按照上述步驟進(jìn)行測(cè)定，顯微鏡下觀察結(jié)果，確定最佳固定液。

1.3.1.3 最優(yōu)二抗工作時(shí)間的確定 將辣根過(guò)氧化物酶（HPR）標(biāo)記的羊抗兔IgG按照1∶1 000比例進(jìn)行稀釋，100 uL/孔，置37℃分別孵育0.75 h、1 h、2 h，PBST洗滌3次，按照上述步驟進(jìn)行測(cè)定，顯微鏡下觀察結(jié)果，確定最優(yōu)二抗工作時(shí)間。

1.3.1.4 顯色時(shí)間確定 AEC試劑根據(jù)配比要求進(jìn)行配制，100 uL/孔，置室溫和37℃分別作用15 min、20 min、30 min，按照上述步驟進(jìn)行測(cè)定，顯微鏡下觀察結(jié)果，確定最佳顯色時(shí)間。

1.3.2 IPMA檢測(cè)方法的特異性分析 用PEDV、PRRSV、PCV2陽(yáng)性血清和豬瘟病毒（CSFV）陽(yáng)性高免血清進(jìn)行特異性檢測(cè)，判定該方法的特異性。

1.3.3 IPMA檢測(cè)方法重復(fù)性分析 分別制備3個(gè)批次的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，選用已知濃度的病毒按照一定比例進(jìn)行稀釋后，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，同時(shí)設(shè)置不接病毒的空白對(duì)照，每個(gè)樣本做3個(gè)重復(fù)，分別進(jìn)行組內(nèi)及組間的重復(fù)性測(cè)定。

1.3.4 IPMA檢測(cè)方法與IFA方法符合率分析 對(duì)建立的IPMA檢測(cè)方法與IFA方法進(jìn)行對(duì)比，分析同一批次、相同稀釋度豬瘟病毒檢測(cè)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 IPMA條件優(yōu)化本研究確定最優(yōu)反應(yīng)條件為：豬瘟病毒接種后繼續(xù)培養(yǎng)72 h，用含0.3%H2O2甲醇溶液室溫固定10 min，5%BSA 37℃作用2 h，一抗按照1∶200進(jìn)行稀釋，37℃孵育2 h，二抗按照1∶1 000進(jìn)行稀釋，37℃孵育45 min，置37℃顯色20 min具有較好的顯色效果（見(jiàn)圖1）。

圖1 不同樣品AEC染色效果

2.2 最佳固定液的確定選用不同類型的固定液進(jìn)行固定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)33%丙酮溶液進(jìn)行固定時(shí)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞迅速脫落，采用80%丙酮溶液與0.3%H2O2甲醇溶液相比，細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)脫落現(xiàn)象，且染色后細(xì)胞邊界模糊，效果稍差于0.3%H2O2甲醇溶液（見(jiàn)圖2）。

圖2 不同固定液處理后細(xì)胞染色效果

2.3 IPMA檢測(cè)方法的特異性分析采用上述方法對(duì)PEDV、PRRSV、PCV2、CSFV陽(yáng)性血清樣品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明：除豬瘟病毒陽(yáng)性血清出現(xiàn)特異性顏色反應(yīng)外，其余病毒陽(yáng)性血清均無(wú)染色反應(yīng)。

2.4 IPMA檢測(cè)方法的重復(fù)性分析采用上述方法對(duì)不同批次制備的細(xì)胞進(jìn)行豬瘟病毒含量測(cè)定，結(jié)果無(wú)明顯差異，表明建立的方法具有很好的重復(fù)穩(wěn)定性。

2.5 IPMA檢測(cè)方法與IFA比較分析采用同一批細(xì)胞不同試驗(yàn)方法對(duì)同一批次、相同稀釋度的豬瘟病毒進(jìn)行測(cè)定，IPMA檢測(cè)結(jié)果與IFA方法相符合（見(jiàn)圖3）。

圖3 不同試驗(yàn)方法對(duì)比分析

3 討 論

IPMA與IFA檢測(cè)方法一樣，具有良好的特異性、敏感性等特點(diǎn)，解決了病毒感染細(xì)胞無(wú)細(xì)胞病變、難以判定細(xì)胞是否感染的難題[6]。該方法因操作簡(jiǎn)便、能夠長(zhǎng)期保存試驗(yàn)結(jié)果等優(yōu)勢(shì)在疫病檢測(cè)中得到廣泛應(yīng)用[7-9]。本研究通過(guò)病毒感染時(shí)間、固定液選擇、一抗和二抗、顯色的最優(yōu)工作條件確定，建立了豬瘟病毒的IPMA檢測(cè)方法。通過(guò)加入一定量的Trition和BSA進(jìn)行細(xì)胞通透和封閉，極大提高病毒侵染細(xì)胞的效果和降低背景的干擾，降低非特異性反應(yīng)的發(fā)生，為建立豬瘟病毒的IPMA檢測(cè)方法奠定基礎(chǔ)。

疫苗免疫是預(yù)防疫病發(fā)生和流行的重要途徑，雖然豬瘟弱毒疫苗的應(yīng)用在一定程度上控制了豬瘟的流行，但仍出現(xiàn)免疫失敗的情況。OIE-WAHIS實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)豬瘟疫情仍處于散發(fā)、流行的情況。王琴等[10]澄清了“由野毒株變異引起免疫失敗”的學(xué)術(shù)爭(zhēng)端，指出豬瘟弱毒疫苗（C株）能抵抗全世界流行的三個(gè)基因型野毒的攻擊。CFSV在細(xì)胞增殖中效價(jià)高低及最終疫苗生產(chǎn)質(zhì)量與動(dòng)物免疫效果密切相關(guān)[11]。黃寶學(xué)等[12]指出，不同病毒含量豬瘟疫苗的免疫效果存在一定差異，疫苗中病毒含量過(guò)高會(huì)導(dǎo)致免疫耐受，病毒含量過(guò)低則不能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生足夠的抗體水平。因此，豬瘟弱毒疫苗中病毒含量是影響疫苗使用效果的關(guān)鍵。

本研究建立了能夠快速檢測(cè)豬瘟病毒復(fù)制情況的IPMA方法。雖然該方法已有在豬瘟病毒效價(jià)測(cè)定方面應(yīng)用的報(bào)道[6,9]，但本研究中主要采用極易獲取的高免血清作為一抗，解決了單克隆抗體難以篩選的難題。采用特異性HRP-IgG作為二抗，極大提高了檢測(cè)方法的特異性和推廣的可行性。通過(guò)固定液的篩選及封閉條件的加入，大大降低了細(xì)胞脫落的幾率及本底反應(yīng)，降低了主觀誤判的概率。