高國龍 張興旺 姜子健 黃家風(fēng) 都業(yè)娟

摘要 為了明確木爾坦棉花曲葉病毒cotton leaf curl Multan virus （CLCuMuV）在新疆的發(fā)生分布，對采自新疆13個地（州）的1 166份蜀葵、苘麻、棉花疑似病株進(jìn)行CLCuMuV分子鑒定和帶毒檢測，并對3種寄主上同期采集的1 588頭煙粉虱進(jìn)行隱種鑒定和帶毒檢測。結(jié)果顯示，CLCuMuV DNA-A組分及其伴隨的DNAβ衛(wèi)星分子均可侵染蜀葵、苘麻、棉花;基于DNA-A及DNAβ組分的進(jìn)化分析表明，新疆3種寄主上發(fā)生的CLCuMuV與國內(nèi)已報道的CLCuMuV 進(jìn)化關(guān)系一致;蜀葵、苘麻、棉花上CLCuMuV帶毒率存在差異，分別為27.87%、33.33%和14.95%;MEAM1和MED隱種為新疆煙粉虱主要種群，分別占26.70%和66.44%，帶毒率分別為21.46%和17.63%，說明MED隱種為新疆煙粉虱優(yōu)勢種群，2個隱種均可攜帶CLCuMuV且?guī)Ф韭氏嘟?MEAM1隱種在蜀葵、苘麻、棉花上帶毒率分別為21.39%、0和28.21%，MED隱種分別為19.61%，8.47%和11.18%，表明2個隱種在不同寄主上的帶毒率存在差異。本研究明確了新疆地區(qū)侵染蜀葵、苘麻和棉花的CLCuMuV發(fā)生及分布情況，并明確新疆煙粉虱主要種群MEAM1和MED 隱種在3種寄主上的分布及帶毒情況，為新疆棉區(qū)防控CLCuMuV發(fā)生嚴(yán)重危害提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞 CLCuMuV;棉花;蜀葵;苘麻;煙粉虱

中圖分類號： S435.61

文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2021154

Abstract In order to determine the distribution of cotton leaf curl Multan virus （CLCuMuV） in Xinjiang， 1 166 suspected plants of Alcea rosea， Abutilon theophrasti and cotton collected from 13 prefectures （autonomous prefectures） in Xinjiang were investigated by molecular identification and CLCuMuV detection， and the total of 1 588 Bemisia tabaci were also collected from the three hosts to determine the cryptic species of B.tabaci and their viruliferous rate of CLCuMuV by PCR. The results showed that A.rosea， A.theophrasti and cotton could be infected by CLCuMuV DNA-A and its beta satellite DNAβ. CLCuMuV DNA-A and its DNAβ from the three hosts in Xinjiang were closely related to the CLCuMuV isolates from other provinces in China based on phylogenetic tree analysis. The rate of CLCuMuV infection in A.rosea， A.theophrasti and cotton was 27.87%， 33.33% and 14.95%， respectively. The population of B.tabaci in Xinjiang was mainly comprised of MEAM1 and MED cryptic species. MEAM1 accounted for 26.70% with 21.46% viruliferous rate， and MED accounted for 66.44% with 17.63% viruliferous rate， indicating that MED cryptic species is the dominant population of B.tabaci in Xinjiang. Both MEAM1 and MED could carry CLCuMuV with similar viruliferous rate， the viruliferous rate of MEAM1 in A.rosea， A.theophrasti and cotton was 21.39%， 0 and 28.21%， respectively， and that of MED was 19.61%， 8.47% and 11.18%， respectively. The results showed that the viruliferous rates of MEAM1 and MED on different hosts were different. In conclusion， the occurrence and distribution of CLCuMuV in A.rosea， A.theophrasti and cotton in Xinjiang were determined， and the distribution and viruliferous rates of MEAM1 and MED on the three hosts were also determined， which provides scientific basis for the prevention and control of CLCuMuV in Xinjiang.69033D07-FF88-4A2B-9A1F-6EC5CF4241CA

Key words CLCuMuV;cotton;Alcea rosea;Abutilon theophrasti;Bemisia tabaci

棉花曲葉病cotton leaf curl disease（CLCuD）是棉花生長期的毀滅性病害，不僅造成棉纖維長度、細(xì)度等品質(zhì)下降，還嚴(yán)重影響產(chǎn)量，造成的產(chǎn)量損失可達(dá)10%～90%[1]。該病害是由煙粉虱Bemisia tabaci（Gennadius）傳播的雙生病毒科Geminiviridae菜豆金色花葉病毒屬Begomovirus的多種病毒引起，通常統(tǒng)稱為棉花曲葉病毒cotton leaf curl virus（CLCuV）。CLCuV可侵染其他寄主，并通過煙粉虱傳播到棉花上[1]，因此煙粉虱和其他寄主的分布和帶毒情況對該病害的傳播及流行具有重要作用。

煙粉虱是由多個隱種組成的物種復(fù)合體，也是傳播CLCuV的唯一昆蟲介體[2]。其中Middle East-Asia Minor 1（MEAM1）和Mediterranean（MED）2個隱種入侵性強(qiáng)、分布廣泛，在我國最為常見且為害嚴(yán)重[3-4]。新疆煙粉虱隱種鑒定顯示2010年前均為MEAM1隱種[4-5]，自2011年首次報道MED隱種入侵新疆后[6]，不同區(qū)域煙粉虱種群組成呈動態(tài)變化：南疆和田地區(qū)煙粉虱種群由MEAM1隱種發(fā)展為MED隱種和MEAM1隱種混發(fā)，以MED隱種為優(yōu)勢種群[7];東疆鄯善縣和北疆克拉瑪依市兩區(qū)域由MED隱種發(fā)展為2個隱種混發(fā)，但以MED隱種為優(yōu)勢種群[7-8];石河子市檢測結(jié)果表明，由MEAM1隱種轉(zhuǎn)變?yōu)?個隱種混發(fā)，無明顯優(yōu)勢種群[7-9];烏魯木齊市煙粉虱僅檢測到MED隱種[7-9];庫爾勒市檢測到Asia II 7隱種[9]。由于不同隱種煙粉虱對CLCuV的傳播能力差異顯著，因此及時監(jiān)控?zé)煼凼[種動態(tài)變化趨勢及帶毒情況是預(yù)防該病害暴發(fā)流行的有力措施。

CLCuV嚴(yán)重危害棉花的同時，還能以多種觀賞花卉和雜草作為寄主。蘇丹已報道錦葵科Malvaceae的棉屬Gossypium、木槿屬Hibiscus、懸鈴花屬M(fèi)alvaviscus、蜀葵屬Alcea、苘麻屬Abutilon等9個屬植物可受到CLCuV危害[10];巴基斯坦在茄科Solanaceae、葫蘆科Cucurbitaceae、旋花科Convolvulaceae、豆科Fabaceae及錦葵科的蜀葵Alcea rosea （L.） Cavan.、苘麻Abutilon theophrasti Medicus.、木槿Hibiscus syriacus L.等寄主上觀察到了CLCuV危害的曲葉癥狀[11];印度則報道了通過傳毒試驗和ELISA檢測，明確菜豆、辣椒、番茄和煙草中存在CLCuV[12]。上述報道明確了CLCuV除了危害棉花之外，還存在廣泛的寄主，尤其是錦葵科中多個屬均可受到侵染，但受限于早期試驗條件的限制，并未明確病毒的具體種名。

木爾坦棉花曲葉病毒cotton leaf curl Multan virus （CLCuMuV）是CLCuV中危害最重、分布最廣的種類[13]，由DNA-A組分及其伴隨的DNAβ衛(wèi)星分子組成。DNAβ只能依賴輔助病毒進(jìn)行復(fù)制，對病毒侵入寄主后的顯癥具有重要作用[14]。CLCuMuV是導(dǎo)致20世紀(jì)90年代巴基斯坦CLCuD大流行的主要病原[14]，并在印度[15]、菲律賓[16]等國家都有危害。我國繼2006年在廣東省首次發(fā)現(xiàn)CLCuMuV侵染朱槿H.rosa-sinensis L.后[17]，廣西、福建、江蘇、海南、云南、內(nèi)蒙古和新疆等地均報道該病毒的入侵[9]。寄主除棉花外[18-19]，還包括秋葵屬Abelmoschus的黃秋葵A.esculentus （L.） Moench[20]、懸鈴花屬的垂花懸鈴花M.arboreus var. penduliflorus [21]、木槿屬的朱槿[22]和紅麻H.cannabinus L.[23]等錦葵科寄主，但無侵染蜀葵屬和苘麻屬寄主的報道。蜀葵是錦葵科蜀葵屬多年生觀賞性花卉植物，在新疆城市和農(nóng)村的房前屋后及田間地頭都有成片的分布;苘麻為錦葵科蜀葵屬草本植物，在世界范圍廣泛分布[24]，也是棉田中最為常見的雜草，CLCuMuV能否侵染二者，與其能否在新疆棉田擴(kuò)散危害直接相關(guān)。

新疆作為我國重要棉區(qū)，2019年棉花產(chǎn)量占全國84.90%，伴隨攜毒朱槿苗木和煙粉虱的跨區(qū)調(diào)運(yùn)，CLCuMuV向新疆棉區(qū)傳播的潛在風(fēng)險急劇增大;CLCuMuV潛在寄主蜀葵和苘麻等在新疆的廣泛分布為病毒的擴(kuò)散和持續(xù)危害提供了有利條件;而煙粉虱隱種組成動態(tài)變化又為病害的有效監(jiān)控增加了難度。因此，本研究對全疆主要棉區(qū)開展棉花和其他寄主CLCuMuV侵染情況的普查，并對煙粉虱隱種的發(fā)生分布及帶毒情況進(jìn)行檢測，明確該病毒和帶毒煙粉虱隱種的發(fā)生情況，以期為新疆棉花曲葉病的早期監(jiān)測防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試蜀葵、苘麻、棉花樣品共1 166份，為2017 年至2020年采自新疆東疆、南疆和北疆13個地（州）：其中778份為表現(xiàn)植株矮縮、葉片卷曲皺縮等癥狀的蜀葵、苘麻疑似病株葉片;388份棉花樣品無典型癥狀，但均采自表現(xiàn)曲葉癥狀的蜀葵、苘麻附近。供試煙粉虱1 588頭為同期采集自蜀葵、苘麻和棉花。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

植物樣品DNA的提取使用天根生化科技（北京）有限公司的新型植物基因組DNA提取試劑盒（DP305-03），并將DNA于-20℃保存。煙粉虱總DNA的提取[25]，將單頭煙粉虱置于1.5 mL的離心管中，吸取20 μL裂解液[10 mmol/L Tris （pH 8.4），50 mmol/L氯化鉀，0.2% 明膠，0.45% 吐溫-20，0.45% NP-40，60 mg/mL蛋白酶K]并用研棒將其充分研磨勻漿，吸取20 μL裂解液清洗研棒并將清洗液與勻漿混合，65℃水浴1 h，接著沸水浴10 min，經(jīng)短暫離心后即可用于PCR反應(yīng)，DNA保存于-20℃。69033D07-FF88-4A2B-9A1F-6EC5CF4241CA

1.2.2 CLCuMuV檢測及煙粉虱隱種鑒定

分別利用2對特異引物 AF/AR[19]和βF/DNA-βR對CLCuMuV DNA-A及伴隨的DNAβ衛(wèi)星分子進(jìn)行PCR檢測;利用煙粉虱 mtCOⅠ 基因通用引物 C1-J-2195/R-BQ-2819[26]進(jìn)行煙粉虱鑒定，再通過B-F/B-R、Q-F/Q-R[27]對煙粉虱MEAM1和MED隱種進(jìn)行鑒定（表1）。

1.2.3 CLCuMuV DNA-A及DNAβ組分的克隆測序及序列分析

分別在蜀葵、苘麻和棉花樣品中選取代表性病株，以其基因組DNA為模板，利用CLCuMuV特異性引物AF/AR和βF/DNA-βR對CLCuMuV DNA-A及伴隨的DNAβ衛(wèi)星分子進(jìn)行PCR擴(kuò)增（表1），克隆并測序。序列測定由生工生物工程（上海）股份有限公司完成，測序結(jié)果使用DNAMAN軟件進(jìn)行序列拼接及相似性分析，利用MEGA-X軟件的鄰接法（neighbor-joining）完成聚類分析及進(jìn)化樹構(gòu)建。

2 結(jié)果與分析

2.1 侵染蜀葵、苘麻和棉花的CLCuMuV的分子鑒定

首先對蜀葵、苘麻疑似病株中的CLCuMuV進(jìn)行分子鑒定，結(jié)果顯示，4株蜀葵樣品和3株苘麻樣品均能擴(kuò)增到CLCuMuV DNA-A 832～834 bp的目標(biāo)片段，7個片段之間的核苷酸序列相似性為99.16%～100.00%;BLAST檢索結(jié)果顯示，7個序列與CLCuMuV分離物DNA-A序列的相似性為89.95%～99.88%。表明疑似感病蜀葵和苘麻均被CLCuMuV侵染。再對2株蜀葵和2株苘麻病株中CLCuMuV伴隨的DNAβ分子進(jìn)行鑒定，均能擴(kuò)增到432～433 bp的目標(biāo)DNAβ片段，4個片段之間的核苷酸序列相似性為99.08%～100.00%，與CLCuMuV DNAβ序列的相似性為85.19%～99.77%，表明侵染蜀葵和苘麻的CLCuMuV伴隨有DNAβ分子。

對20份采集自感病蜀葵和苘麻附近的棉花樣品進(jìn)行CLCuMuV鑒定，結(jié)果從8株棉花中擴(kuò)增到CLCuMuV DNA-A目標(biāo)片段，序列大小均為832 bp，且核苷酸序列相似性為99.16%～100.00%;8個序列與CLCuMuV分離物DNA-A序列相似性為91.95%～100.00%，表明8株棉花均被CLCuMuV侵染;對其中3份樣品中CLCuMuV伴隨的DNAβ分子進(jìn)行鑒定，均可獲得約400 bp 的預(yù)期目標(biāo)片段，測序結(jié)果表明其均為433 bp，3個片段之間的序列相似性為99.54%～99.77%，與CLCuMuV衛(wèi)星分子DNAβ的序列的相似性為85.19%～99.77%，表明侵染棉花的CLCuMuV伴隨有DNAβ衛(wèi)星分子。進(jìn)一步比對分析發(fā)現(xiàn)，棉花中的CLCuMuV與蜀葵和苘麻病株中DNA-A序列間的相似性均超過98.56%，其伴隨的DNAβ衛(wèi)星分子序列間的相似性也均超過99.62%。

2.2 侵染蜀葵、苘麻和棉花的CLCuMuV DNA-A及DNAβ組分進(jìn)化分析

基于蜀葵、苘麻和棉花中獲得的CLCuMuV DNA-A 序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖1所示，所有CLCuMuV聚類在一個大的進(jìn)化分支上，中國來源的CLCuMuV聚在一個亞分支上，其中新疆蜀葵3個分離物xjsk02、xjsk06和xjsk26及8個棉花分離物xjmh05、xjmh09、xjmh10、xjmh11、xjmh12、xjmh13、xjmh14和xjmh16與侵染廣西棉花的CLCuMuV（登錄號：JQ317603）進(jìn)化關(guān)系最近;蜀葵分離物xjsk17與侵染廣西朱槿的CLCuMuV進(jìn)化關(guān)系最近;苘麻分離物xjqm01、xjqm02和xjqm06與侵染廣東棉花、秋葵及江蘇朱槿的CLCuMuV進(jìn)化關(guān)系最近。而來自巴基斯坦、印度的CLCuMuV則聚類在另外1個亞分支上。以上結(jié)果表明，新疆蜀葵、棉花上發(fā)生的CLCuMuV與廣西棉花上的CLCuMuV具有相同的進(jìn)化關(guān)系;新疆苘麻上發(fā)生的CLCuMuV與廣東和江蘇錦葵科植物上的CLCuMuV具有相同的進(jìn)化關(guān)系。

基于蜀葵、苘麻和棉花中獲得的CLCuMuV DNAβ 序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖2所示，所有CLCuMuV伴隨的DNAβ聚類在一個大的進(jìn)化分支上，中國來源的CLCuMuV伴隨的DNAβ聚在一個亞分支上，其中新疆蜀葵2個分離物xjsk02、xjsk06伴隨的DNAβ與侵染廣西朱槿和侵染廣東垂花懸鈴花的CLCuMuV伴隨的DNAβ進(jìn)化關(guān)系最近;苘麻分離物xjqm02、xjqm06伴隨的DNAβ和棉花分離物xjmh05、xjmh09及xjmh10與侵染江蘇朱槿和侵染廣西棉花的CLCuMuV伴隨的DNAβ進(jìn)化關(guān)系最近。而來自巴基斯坦、印度的CLCuMuV伴隨的DNAβ則聚類在另一個亞分支上。以上結(jié)果表明，新疆蜀葵、苘麻和棉花上發(fā)生的DNAβ分子在進(jìn)化上與其輔助病毒CLCuMuV具有一致性，即新疆發(fā)生的CLCuMuV及其衛(wèi)星分子DNAβ與來源于廣東、廣西及江蘇的錦葵科植物上的CLCuMuV及其衛(wèi)星DNAβ具有相同的進(jìn)化關(guān)系。

2.3 蜀葵、苘麻及棉花攜帶CLCuMuV的檢測結(jié)果

為了明確CLCuMuV在全疆的發(fā)生分布，對采集自新疆13個地州的1 166份樣品進(jìn)行PCR帶毒檢測，結(jié)果顯示（表2），276份樣品感染CLCuMuV，且均伴隨DNAβ衛(wèi)星分子，帶毒率為23.67%。對3種寄主的帶毒情況進(jìn)行分析，757份蜀葵樣品中211份樣品檢測到病毒，帶毒率為27.87%，其中東疆18份樣品中，15份檢測到病毒，檢出率為83.33%;北疆214份樣品中，105份檢測到病毒，檢出率為49.07%;南疆525份樣品中，91份檢測到病毒，檢出率為17.33%。21份苘麻樣品中7份檢測到病毒，檢出率為33.33%，其中南疆13份樣品中，4份檢測到病毒，帶毒率為30.77%;北疆8份樣品中，3份檢測到病毒，檢出率為37.50%。388份棉花樣品中58份檢測到CLCuMuV，檢出率為14.95%，其中東疆16份樣品中，10份檢測到病毒，檢出率為62.50%;南疆22份樣品中，5份檢測到病毒，檢出率為22.73%;北疆350份樣品中，43份檢測到病毒，檢出率為12.29%。上述結(jié)果表明，蜀葵和苘麻帶毒率分別為27.87%和33.33%，均高于棉花14.95%的帶毒率;蜀葵帶毒率表現(xiàn)為東疆>北疆>南疆，苘麻帶毒率表現(xiàn)為北疆>南疆，棉花帶毒率表現(xiàn)為東疆>南疆>北疆。69033D07-FF88-4A2B-9A1F-6EC5CF4241CA

2.4 蜀葵、苘麻及棉花上煙粉虱隱種及CLCuMuV帶毒率的檢測

利用煙粉虱 mtCOⅠ 基因片段通用引物對病株上的粉虱進(jìn)行種類鑒定，明確病株上采集的1 588頭粉虱均為煙粉虱;進(jìn)而利用隱種特異性引物對煙粉虱進(jìn)行隱種鑒定，結(jié)果顯示MEAM1隱種為424頭，占26.70%，MED隱種1 055頭，占66.44%，另有109頭未確定隱種，占6.86%（表3）。對煙粉虱帶毒情況進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，MEAM1隱種帶毒率為21.46%，東疆、南疆和北疆的帶毒率分別為18.75%、7.98%和40.59%;MED隱種帶毒率為17.63%，東疆、南疆和北疆的帶毒率分別為13.45%、18.32%和16.83%;未確定種煙粉虱均不帶毒。對3種寄主上的煙粉虱隱種及其帶毒率進(jìn)行分析，蜀葵上1 303頭煙粉虱，檢測到242頭攜帶CLCuMuV，帶毒率為18.57%，其中MEAM1隱種占28.70%，帶毒率為21.39%，MED隱種占63.39%，帶毒率為19.61%;苘麻上73頭煙粉虱中，MED隱種占80.82%，帶毒率為8.47%;MEAM1隱種占15.07%，未檢測到攜帶CLCuMuV;棉花上212頭煙粉虱中，30頭檢測到病毒，帶毒率為14.15%，其中MEAM1隱種占18.40%，帶毒率為28.21%，MED隱種占80.19%，帶毒率為11.18%。上述結(jié)果表明，煙粉虱MEAM1和MED隱種均可攜帶CLCuMuV，平均帶毒率差異不大;但從區(qū)域分布來看，MEAM1隱種的帶毒率在東疆（18.75%）、南疆（7.98%）和北疆（40.59%）差異較大，而MED隱種在上述三個區(qū)域帶毒率差異不大;從煙粉虱寄主來看，蜀葵上的煙粉虱帶毒率（18.57%）高于苘麻（6.85%）和棉花（14.15%）的帶毒率。

3 結(jié)論與討論

本研究針對CLCuMuV入侵新疆的寄主開展了研究，明確CLCuMuV可侵染蜀葵和苘麻，并伴隨DNAβ衛(wèi)星分子，這是我國首次報道。分子檢測結(jié)果表明，蜀葵帶毒率為27.87%，苘麻帶毒率為33.33%，說明CLCuMuV通過花卉攜帶傳入新疆后，已經(jīng)在東疆、南疆和北疆借助多年生花卉及棉田雜草定殖下來，成為田間擴(kuò)散的初侵染源。

對感病寄主附近的棉花進(jìn)行CLCuMuV分子鑒定，明確CLCuMuV能夠侵染棉花，并伴隨衛(wèi)星分子DNAβ，感病寄主附近的棉花帶毒率為14.95%。因目前檢測的感病棉花均無明顯的受害癥狀，表明新疆棉花隱癥帶毒。對于隱癥帶毒是否與棉花品種有關(guān)，或是與病毒侵入時期過晚有關(guān)，還有待深入研究。

煙粉虱是CLCuMuV的唯一昆蟲傳播介體。本研究對感病蜀葵、苘麻、棉花上采集的煙粉虱進(jìn)行隱種鑒定及帶毒檢測，結(jié)果顯示，新疆煙粉虱主要由MEAM1和MED隱種組成，MED隱種為優(yōu)勢種群;MEAM1隱種帶毒率為21.46%，MED隱種帶毒率17.63%。雖然在不同的地理區(qū)域煙粉虱隱種的分布及帶毒率存在差異，但二者均具有潛在的傳毒風(fēng)險。林林等的研究表明MEAM1可將CLCuMuV傳播到棉花上[28]，Pan等的研究表明MED隱種具有將CLCuMuV傳到煙草上的能力[29]。鑒于本研究在田間棉花植株上已檢測到CLCuMuV的侵染，關(guān)于MEAM1隱種和MED隱種傳毒能力還有待進(jìn)一步深入研究。

作者前期的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在新疆多個地區(qū)的花卉植物朱槿攜帶CLCuMuV，因氣候寒冷，朱槿在新疆主要以室內(nèi)盆栽模式進(jìn)行種植，不利于煙粉虱傳播CLCuMuV，而蜀葵屬于多年生花卉，因其花色艷麗，易于種植，是新疆各地主要的庭院花卉;苘麻作為棉田主要雜草，在新疆亦有廣泛分布。已有的研究表明，田間雜草就像雙生病毒Begomovirus的儲存庫，可以作為其生存和傳播的寄主或替代寄主，能同時被多種該屬病毒及衛(wèi)星復(fù)合侵染從而增加病毒重組的幾率[30-31]。本研究從田間癥狀和分子檢測水平進(jìn)一步明確了CLCuV中的CLCuMuV可侵染蜀葵和苘麻。棉花為一年生喜溫草本植物，在寒冷的冬季不能生長，而中間寄主不僅為病毒提供越冬場所，并為次年棉花生長期煙粉虱傳播病毒提供毒源，還可借遠(yuǎn)距離調(diào)運(yùn)將病毒及煙粉虱傳播到新的區(qū)域，因此中間寄主在棉花曲葉病的傳播中起重要作用，務(wù)必引起重視。

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（責(zé)任編輯：田 喆）69033D07-FF88-4A2B-9A1F-6EC5CF4241CA