孫曉梅 趙彥翔 遲夢宇 黃金光

摘要 Phe511是禾谷鐮孢甾醇-14α-脫甲基酶FgCYP51B活性口袋中的一個重要氨基酸。本研究中，我們探究了FgCYP51B蛋白中該位點突變后對禾谷鐮孢主要生物學表型的影響，并通過分子對接探討了可能的原因。結(jié)果表明禾谷鐮孢FgCYP51B-F511L突變體在菌落形態(tài)、生長速率等表型上與野生型菌株PH-1沒有明顯差異。但是F511L突變導致分生孢子的產(chǎn)量嚴重降低，對烯唑醇的敏感性增強。分子對接發(fā)現(xiàn)突變后亮氨酸的長側(cè)鏈使得烯唑醇的甲基發(fā)生扭轉(zhuǎn)，側(cè)鏈朝向發(fā)生改變，更有利于與蛋白受體形成較強的疏水作用，這可能是導致FgCYP51B-F511L突變體對烯唑醇敏感性增強的原因。

關鍵詞 禾谷鐮孢;CYP51B;點突變;生物學表型;藥劑敏感性

中圖分類號： S431

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2021222

Abstract Phenylalanine 511 is an important amino acid residue in the active pocket of FgCYP51B，a sterol 14α-demethylase in Fusarium graminearum. In this study， we investigated the effect of the F511L mutation in FgCYP51B on its biological phenotypes. The results showed that the colony morphology and growth rate of the FgCYP51B-F511L mutant were consistent with those of the wild type strain PH-1. However， the F511L mutation led to significant reduction in conidia and increased sensitivity to diniconazole compared with the wild type strain. Molecular docking indicated that the F511L mutation made the methyl group of diniconazole twisted and changed the direction of the side chain of diniconazole， which facilitates strong hydrophobic interaction between diniconazole with the protein receptor. It may be the reason why FgCYP51B-F511L mutant is more sensitive to diniconazole than wild type strain.

Key words Fusarium graminearum;CYP51B;point mutation;biological phenotype;fungicide sensitivity

禾谷鐮孢Fusarium graminearum是全世界各小麥產(chǎn)區(qū)中小麥赤霉?。‵usarium head blight，F(xiàn)HB）最主要的致病菌[1]。由其引起的小麥赤霉病不僅會造成嚴重的產(chǎn)量損失，病原菌產(chǎn)生的真菌毒素還會污染谷物，導致谷物品質(zhì)下降，并且會嚴重危害人畜健康[2-3]。2012年分子植物病理學期刊（Molecular Plant Pathology）評選的十大植物病原真菌中禾谷鐮孢名列第4位[2]。小麥赤霉病是典型的氣候型流行性病害。目前，在小麥揚花期使用殺菌劑噴霧防治是最有效的防治方法，常用的殺菌劑有苯并咪唑類殺菌劑（MBCs）、甾醇脫甲基抑制劑（DMIs）、氰烯菌酯（JS399-19）及其復配劑等。但是，由于藥劑的不合理使用，目前已經(jīng)出現(xiàn)了對MBCs及DMIs產(chǎn)生抗性的禾谷鐮孢田間菌株[4-5]。室內(nèi)藥劑馴化試驗等也表明禾谷鐮孢對氰烯菌酯較易產(chǎn)生抗性突變[6-7]。因此加強對禾谷鐮孢的田間監(jiān)測以及研發(fā)新型殺菌劑對于有效防控小麥赤霉病具有重要意義。

DMIs的靶標蛋白是病原真菌的甾醇-14α-脫甲基酶（CYP51）。其作用機理主要是通過抑制該酶的活性阻斷真菌細胞膜主要成分麥角甾醇的合成，同時造成大量有害中間產(chǎn)物的積累，破壞細胞膜的結(jié)構(gòu)與功能。目前研究表明病原真菌主要通過CYP51中氨基酸點突變、CYP51基因的過量表達以及編碼外排泵基因的過量表達等方式對DMIs藥劑產(chǎn)生抗性，而氨基酸點突變是植物病原菌對DMIs產(chǎn)生抗性的主要機制[8-9]。導致抗藥性產(chǎn)生的突變位點主要集中在CYP51蛋白N端和C端，這些位點通常參與構(gòu)成藥劑與蛋白互作口袋[10]。在禾谷鐮孢中存在3個編碼CYP51蛋白的基因，其中FgCYP51B編碼功能性甾醇-14α-脫甲基酶。通過同源建模和分子對接發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)gCYP51B與DMIs藥劑分子的結(jié)合口袋主要由Val136、Tyr137、Ala308、Ser312、Ile374和Phe511等6個氨基酸殘基構(gòu)成[11]。課題組前期通過定點突變技術，將FgCYP51B第137位酪氨酸進行定點突變，并測定了野生型菌株和突變株對戊唑醇等甾醇脫甲基抑制劑的敏感性，發(fā)現(xiàn)第137位酪氨酸突變?yōu)榻M氨酸后對戊唑醇的敏感性降低，分生孢子產(chǎn)量降低，子囊孢子的發(fā)育受阻[12-13]。目前的研究表明N端第123位酪氨酸、第137位酪氨酸等在FgCYP51B蛋白抗藥性及生物學功能方面承擔重要角色[12，14]，但是C端氨基酸在殺菌劑敏感性方面的研究相對較少。2014年有研究發(fā)現(xiàn)指梗青霉Penicillium digitatum PdCYP51B中與FgCYP51B的Phe511等價的Phe506發(fā)生F506I突變及G459S突變在指梗青霉對咪鮮胺產(chǎn)生中等抗性中發(fā)揮作用[15]。

為探究禾谷鐮孢C端511位苯丙氨酸在FgCYP51B發(fā)揮功能中的作用，本研究構(gòu)建了FgCYP51B 蛋白的F511L突變體，并對突變體的菌落形態(tài)、生長速率、分生孢子產(chǎn)量等生物學表型特征進行了分析，發(fā)現(xiàn)FgCYP51B第511位苯丙氨酸突變后嚴重影響禾谷鐮孢孢子發(fā)育以及其對烯唑醇殺菌劑的敏感性。使用同源建模和分子對接分析了可能的原因，試驗結(jié)果也為設計防治小麥赤霉病新型殺菌劑提供了結(jié)構(gòu)基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用菌株、載體：大腸桿菌Escherichia coli DH5α，禾谷鐮孢野生型菌株PH-1、FgCYP51B敲除體（ΔFgCYP51B）、回補體（ComCYP51B）、互補載體pKN-FgCYP51B-Com由本實驗室保存，基因回補載體pKN由中國農(nóng)業(yè)大學楊俊教授惠贈。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）：馬鈴薯200 g切丁后煮沸20 min，過濾后濾液加葡萄糖20 g，去離子水定容至1 L，添加1.5%（m/V）瓊脂粉。1%綠豆培養(yǎng)基（mung bean broth，MBB）： 10 g綠豆于水中煮沸20 min后過濾，濾液定容至1 L。水瓊脂（water agar，WA）培養(yǎng)基：向去離子水中加入2.0%（m/V）的瓊脂粉。培養(yǎng)基均高溫滅菌后保存?zhèn)溆谩?/p>

試驗藥劑：98%烯唑醇原藥由青島中達農(nóng)業(yè)科技有限公司提供。試驗中用DMSO配制成有效成分濃度為1 000 μg/mL的母液備用。

1.2 CYP51B基因突變載體pKN-FgCYP51B-F511L的構(gòu)建

以互補載體pKN-FgCYP51B-Com為模板，利用重疊延伸PCR的方法[12]制備突變片段，定點突變引物見表1。利用引物F511L-F和F511L-mutR擴增FgCYP51B-F511L突變片段上游序列，用引物F511L-mutF和F511L-R擴增FgCYP51B-F511L突變片段下游序列。通過引物F511L-F和F511L-R對F511L突變上、下游序列進行融合PCR。通過限制性內(nèi)切酶HindⅢ和XhoⅠ對突變片段FgCYP51B-F511L和pKN載體進行雙酶切，利用T4連接酶將突變片段和pKN載體進行連接。熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后，將菌液PCR驗證正確的陽性克隆進一步測序確認。提取質(zhì)粒，-20℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子的篩選、驗證

使用PEG介導的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法將pKN-FgCYP51B-F511L轉(zhuǎn)化到禾谷鐮孢FgCYP51B敲除體菌株（ΔFgCYP51B）中。具體的轉(zhuǎn)化方法

及轉(zhuǎn)化子的篩選、驗證方法參照Qian等的方法[12]，驗證正確的轉(zhuǎn)化子保存在30%的甘油中，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 菌落形態(tài)、生長速率及分生孢子產(chǎn)量測定

打取禾谷鐮孢野生型菌株PH-1、FgCYP51B敲除體、回補體及FgCYP51B-F511L突變體菌株菌絲塊，置于PDA培養(yǎng)基上，25℃黑暗下培養(yǎng)72 h。觀察菌落形態(tài)，采用十字交叉法測量菌落大小。在1%綠豆培養(yǎng)基中于25℃、200 r/min條件下培養(yǎng)進行分生孢子的誘導。雙層擦鏡紙過濾收集分生孢子，25℃，4 000 r/min離心，1 mL無菌水懸浮分生孢子，血球計數(shù)板進行計數(shù)。試驗重復3次，每次試驗每個菌株3個重復。

1.5 F511L突變體對烯唑醇敏感性測定

采用菌絲生長速率法測定FgCYP51B-F511L突變體、野生型PH-1、FgCYP51B敲除體及回補體菌株對烯唑醇的敏感性變化[12]。試驗中使用的烯唑醇藥劑濃度為0、0.13、0.25、0.50、1.0、2.0 mg/L。利用以下公式計算菌絲生長抑制率：菌絲生長抑制率 =（對照菌落直徑 - 處理菌落直徑）/（對照菌落直徑 - 菌餅直徑）×100%。使用SPSS軟件進行概率回歸分析計算得到抑制中濃度EC50[16]。

1.6 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism軟件進行統(tǒng)計分析，進行單因素方差分析后，采用Duncan氏新復極差法進行差異顯著性分析。

1.7 同源建模和分子對接

FgCYP51B三維結(jié)構(gòu)的同源建模以及其與烯唑醇的分子對接試驗在四川魔德科技有限公司進行。方法簡述如下，通過BLASTP程序檢索蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（Protein Data Bank），得到與FgCYP51B序列一致性為61%的4UYL晶體結(jié)構(gòu)[17]，以此結(jié)構(gòu)為模板用SWISS-MODEL程序[18]對FgCYP51B同源建模，使用PROCHECK[19]和QMEAN程序[20]對蛋白模型進行合理性評價。使用AutoDock Tools 1.5.6軟件處理獲得的FgCYP51B蛋白和烯唑醇（diniconazole， DIN）配體結(jié)構(gòu)，然后使用AutoDock 4.2.6軟件包進行分子對接。首先設定血紅素附近為配體的結(jié)合位點，F(xiàn)gCYP51B及突變體對接口袋中心點坐標設為（-80.593， 158.870， -8.968），對接盒子XYZ各方向的格點數(shù)設為40×40×40，格點間距為0.375 ，對接次數(shù)設為200，其余參數(shù)采用默認值。能量優(yōu)化采用Amber14力場，進行兩步優(yōu)化：先進行5 000步的最陡下降法優(yōu)化，再用3 000步的共軛梯度法對結(jié)構(gòu)進行進一步優(yōu)化，將最終的結(jié)果作為后續(xù)分析的模型。

2 結(jié)果與分析

2.1 pKN-FgCYP51B-F511L突變載體的構(gòu)建

以互補載體pKN-FgCYP51B-Com為模板，通過PCR分別擴增得到FgCYP51B-F511L突變片段的5′端和3′端約3.2 kb、570 bp的片段（圖1）。將突變片段的5′端和3′端片段進行融合PCR，獲得大約4.0 kb的目標片段。然后將融合片段酶切后連接到pKN載體上，利用FgCYP51B基因的特異性引物F511L-CheckF、F511L-CheckR對突變載體進行菌液PCR驗證（圖2），測序結(jié)果顯示，F(xiàn)gCYP51B基因編碼序列的第1 533位核苷酸C突變?yōu)锳，對應511位氨基酸由苯丙氨酸F突變?yōu)榱涟彼酟。

2.2 禾谷鐮孢FgCYP51B-F511L突變菌株驗證pKN-FgCYP51B-F511L

轉(zhuǎn)化到禾谷鐮孢FgCYP51B敲除體菌株中后，經(jīng)潮霉素和G418雙抗篩選得到突變體轉(zhuǎn)化子，單孢分離后提取轉(zhuǎn)化子DNA。用載體特異性引物M13-20-F、M13-R對F511L轉(zhuǎn)化子進行檢測。F511L的2個轉(zhuǎn)化子中均檢測到約4 100 bp特異性條帶（圖3）。

2.3 FgCYP51B第511位氨基酸突變（F511L）對分生孢子產(chǎn)量的影響

利用1%綠豆培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株并進行分生孢子產(chǎn)量的測定。通過GraphPad Prism軟件對FgCYP51B-F511L突變體和野生型菌株PH-1、FgCYP51B基因敲除體ΔFgCYP51B以及FgCYP51B回補體ComCYP51B分生孢子產(chǎn)量進行統(tǒng)計分析。結(jié)果顯示，PH-1與ComCYP51B的分生孢子產(chǎn)量無顯著差異，測量平均值分別為2.3×106、2.2×106個/mL。

但是ΔFgCYP51B與FgCYP51B-F511L突變體的產(chǎn)孢量分別為0.8×106、1.5×106個/mL，與野生型相比產(chǎn)孢量顯著下降（P<0.05）（圖4）。這說明FgCYP51B基因與禾谷鐮孢分生孢子產(chǎn)量有關，與Fan等報道一致[23]。而且CYP51B基因C端第511位苯丙氨酸在分生孢子產(chǎn)生過程中也起著重要的作用，但是FgCYP51B第511位氨基酸突變后對禾谷鐮孢的營養(yǎng)生長沒有影響（圖5），這與Fan等報道FgCYP51B基因并不是禾谷鐮孢營養(yǎng)生長的必需基因相一致[23]。

2.4 突變體對烯唑醇的敏感性

采用菌絲生長速率法測定禾谷鐮孢野生型菌株PH-1、FgCYP51B基因敲除體、FgCYP51B基因回補體以及FgCYP51B-F511L突變菌株對烯唑醇的敏感性差異，利用SPSS軟件計算各自的EC50（表2）。比較4個菌株對烯唑醇的敏感性差異，其中FgCYP51B基因敲除及回補后對烯唑醇的敏感性與野生型禾谷鐮孢相比僅略有下降，而FgCYP51B-F511L突變菌株對烯唑醇的敏感性則比野生型禾谷鐮孢明顯升高。在同一藥劑濃度下，F(xiàn)511L突變菌株的菌落直徑明顯小于野生型禾谷鐮孢菌落，尤其在高濃度時菌落直徑差異明顯。由表2可知烯唑醇對F511L突變體的EC50比對野生型的EC50降低了約58%。這說明FgCYP51B蛋白第511位氨基酸在FgCYP51B與烯唑醇的互作過程中發(fā)揮著一定的作用。

2.5 分子對接結(jié)果

將烯唑醇（DIN）分別對接到FgCYP51B、FgCYP51B-F511L的催化活性中心，得到的結(jié)合能分別為-7.44 kcal/mol和-7.65 kcal/mol。從能量角度看，F(xiàn)gCYP51B-F511L突變體與DIN之間的親和力要比FgCYP51B高，表明突變的位點可能有利于DIN的結(jié)合，進一步導致烯唑醇對FgCYP51B-F511L突變體菌株的EC50值較野生型菌株要低。

從對接得到的結(jié)構(gòu)看，DIN結(jié)合在FgCYP51B活性口袋內(nèi)，參與二者結(jié)合的基本上為疏水性氨基酸殘基，主要有Tyr123、Phe131、Val136、Tyr137、Ala304、Met307、Ala308和Phe511，這些氨基酸殘基為受體結(jié)合DIN提供了一個極強的疏水性環(huán)境，有利于分子識別的順利進行（圖6）。DIN在空間位置上靠近血紅素（HEME）的鐵，DIN中三氮唑上的N原子均可與血紅素中的Fe原子鰲合，可能會影響血紅素參與的酶促反應過程。

將Phe511突變成Leu511后，DIN側(cè)鏈結(jié)構(gòu)的朝向發(fā)生了變化，與Met307、Ala308和His311形成較強的疏水作用，有利于增強DIN與酶的親和力;同時由于Leu511的側(cè)鏈較Phe511更長，通過烷基-烷基堆積作用誘導DIN的甲基發(fā)生扭轉(zhuǎn)，進而與其形成較強的疏水作用（圖6）。由此導致FgCYP51B-F511L對DIN具有更強的親和力。

3 討論

在CYP51蛋白中主要有6個底物識別區(qū)域（SRS1～SRS6），其中SRS1和SRS4是最保守的。在目前的研究中，CYP51蛋白位點的突變主要集中在N端SRS1結(jié)合區(qū)域，在該區(qū)域內(nèi)重要氨基酸突變后能夠引起蛋白與殺菌劑的結(jié)合能力發(fā)生改變或者使蛋白的結(jié)構(gòu)及活性發(fā)生變化，從而引起抗性的產(chǎn)生[12，24-25]。如在綠糙棒菌Villosiclava virens、禾生球腔菌Mycosphaerella graminicola、禾谷鐮孢中，第137位酪氨酸突變后菌株對甾醇脫甲基抑制劑產(chǎn)生了抗性[12，26-27];而白色念珠菌Candida albicans中Tyr132、Phe145突變在降低催化活性的同時也使得病原菌對殺菌劑產(chǎn)生了抗性[28]。前期課題組通過遺傳學及生物信息學研究，發(fā)現(xiàn)了禾谷鐮孢中甾醇14α-脫甲基酶FgCYP51B與底物甾醇脫甲基抑制劑結(jié)合過程中發(fā)揮重要作用的氨基酸位點，其中N端的123、136、137位氨基酸均位于SRS1底物結(jié)合區(qū)域，而511位氨基酸位于SRS6底物結(jié)合區(qū)域[11]。進一步研究發(fā)現(xiàn)禾谷鐮孢第137位酪氨酸突變成組氨酸后對戊唑醇的敏感性降低[12]。此外，該位點的突變還會導致禾谷鐮孢產(chǎn)分生孢子的能力下降，而且會影響有性世代子囊孢子的發(fā)育[13]。

本研究對FgCYP51B第511位氨基酸突變（F511L）后菌株的分生孢子產(chǎn)量、菌落形態(tài)、生長速率等生物學表型以及常用甾醇脫甲基抑制劑敏感性進行了分析。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)FgCYP51B的敲除導致禾谷鐮孢分生孢子產(chǎn)生降低，這與之前的報道一致[23]。蛋白質(zhì)中的重要氨基酸往往會直接或者間接影響蛋白質(zhì)的生物學功能，本研究中FgCYP51B-F511L突變體表型與FgCYP51B基因敲除體表型基本一致，表明F511確實在FgCYP51B發(fā)揮功能過程中起重要作用。分子對接表明F511L突變可以直接改變與烯唑醇分子的相互作用，從而參與病原菌對烯唑醇敏感性的變化。該位點的苯丙氨酸殘基在不同病原菌中是比較保守的，本研究中與禾谷鐮孢野生型菌株相比，F(xiàn)gCYP51B-F511L突變體對烯唑醇的敏感性升高，而等價的PdCYP51B-F506I突變和G459S突變共同導致指梗青霉對咪鮮胺敏感性的降低[15]，這表明該氨基酸殘基在CYP51蛋白家族與甾醇脫甲基酶抑制劑中發(fā)揮重要的作用，其突變可能會導致病原菌對DMIs藥劑敏感性的改變。通過對重要氨基酸位點突變后進行表型分析，我們闡明了FgCYP51B與甾醇脫甲基抑制劑互作過程中重要氨基酸F511的功能，為其他氨基酸的功能研究以及其他真菌中相應氨基酸表型的研究提供了理論依據(jù)。

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（責任編輯：楊明麗）