農(nóng)向群 王廣君 蔡霓 劉蓉 張澤華

摘要 綠僵菌是廣為知曉的昆蟲(chóng)病原真菌，被用作生物殺蟲(chóng)劑防治多種農(nóng)林植物害蟲(chóng)。近年發(fā)現(xiàn)它也是根際微生物群落的一員，且有證據(jù)表明它內(nèi)生于一些植物的根組織中，具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)、拮抗植物病原菌、誘導(dǎo)植物抗性等作用。本文著重綜述綠僵菌根際作用和植物內(nèi)生性研究進(jìn)展，從對(duì)植物的直接作用角度，了解其田間生態(tài)適應(yīng)性及與植物的互作關(guān)系，以拓展昆蟲(chóng)病原真菌作為植物保護(hù)劑的認(rèn)識(shí)，有助于根據(jù)生態(tài)學(xué)特點(diǎn)制定未來(lái)的生物防治應(yīng)用策略。

關(guān)鍵詞 綠僵菌;植物內(nèi)生真菌;根際定殖;真菌-植物互作;植保多功能

中圖分類號(hào)： S476

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2022215

Abstract Metarhizium spp.， as well-known entomopathogen fungi， have been used as biological insecticides to control a variety of agricultural and forestry pests. In recent years， it has been found that they are also members of the rhizosphere microbial community， and proved being endophyte in the root tissues of some plants. They can promote plant growth， antagonize plant pathogens and induce plant resistance. In this paper， the research progress on rhizosphere interaction and plant endogeneity of Metarhizium was reviewed. From the perspective of direct effects on plants， the ecological adaptability and interaction with plants were explained， so as to expand the understanding of entomopathogenic fungi as plant protective agents and help to develop future bio-control strategies based on their ecological characteristics.

Key words Metarhizium;endophytic fungi in plant;rhizosphere colonization;fungus-plant interaction;multifunctional potential

自從1879年俄國(guó)學(xué)者M(jìn)etchnikoff成功地將綠僵菌用于田間防治金龜子[1]，綠僵菌屬M(fèi)etarhizium就成為了昆蟲(chóng)病原真菌的典型代表被廣泛知曉，并作為模式菌激起研究熱點(diǎn)。其寄主范圍、地理分布、昆蟲(chóng)致病性及致病機(jī)理等方面研究多有報(bào)道。至今，作為重要的生物防治資源，已在多種農(nóng)林害蟲(chóng)的綠色防控，減少或替代化學(xué)殺蟲(chóng)劑使用中發(fā)揮積極作用。

然而，隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)綠僵菌也是一種可與植物直接交互作用的真菌，已證實(shí)

其可棲息于植物根際和植物內(nèi)部。近二十年來(lái)，有關(guān)綠僵菌與植物的相互關(guān)系及互作機(jī)理的研究逐漸增多，研究人員已逐步洞察到綠僵菌經(jīng)長(zhǎng)期進(jìn)化形成生態(tài)功能定位并與植物建立了多重關(guān)系，有的研究涉及綠僵菌的植物內(nèi)生性與其腐生性、昆蟲(chóng)致病性的關(guān)聯(lián)比較，尤其在與植物互惠共生、促進(jìn)植物生長(zhǎng)、誘發(fā)植物抗性等方面已取得進(jìn)展。綠僵菌與植物多方位的關(guān)聯(lián)為綠色植保及植物健康的系統(tǒng)研究提供了新視角，打開(kāi)了新思路。

1 綠僵菌的生態(tài)定位與進(jìn)化發(fā)展

生物物種的營(yíng)養(yǎng)方式?jīng)Q定其生態(tài)地位。從發(fā)現(xiàn)綠僵菌感染昆蟲(chóng)到現(xiàn)在，已明確其可侵染鞘翅目、鱗翅目、直翅目、半翅目、雙翅目、膜翅目等30余科200多種昆蟲(chóng)[2-3]，無(wú)疑是重要的昆蟲(chóng)病原真菌。綠僵菌屬由Sorokin于1883年建立，在還未明確其有性階段前，綠僵菌被歸入半知菌類（fungi imperfecti），隸屬于半知菌亞門Deuteromycotina，絲孢綱Hyphomycetes，絲孢目Hyphomycetales，叢梗孢科Moniliaceae，科級(jí)還有絲孢科 Hyphomycetaceae、瘤座孢科 Tuberculariaceae等不同的記載[4-5]。直到戴氏蟲(chóng)草被報(bào)道后，研究者誘發(fā)該蟲(chóng)草產(chǎn)生次生子囊孢子，并通過(guò)觀察次生子囊孢子的微循環(huán)產(chǎn)孢，確定了這種蟲(chóng)草的無(wú)性型為戴氏綠僵菌 Metarhizium taii，至此才認(rèn)識(shí)到綠僵菌與蟲(chóng)草的對(duì)應(yīng)關(guān)系[6]。另外，從擬布里特班克蟲(chóng)草 Cordyceps brittlebankisoides 中也發(fā)現(xiàn)了其無(wú)性型綠僵菌，進(jìn)一步證實(shí)了綠僵菌和蟲(chóng)草之間是無(wú)性型和有性型的對(duì)應(yīng)關(guān)系[7]。根據(jù)有性型優(yōu)先的原則，綠僵菌的系統(tǒng)分類地位應(yīng)為子囊菌門Ascomycota、盤菌亞門Pezizomycotina、糞殼菌綱Sordariomycetes、肉座菌目Hypocreales麥角菌科Clavicipitaceae。綠僵菌屬的物種可根據(jù)形態(tài)初步識(shí)別。分子標(biāo)記特別是核酸序列分析技術(shù)極大地推進(jìn)了綠僵菌分類系統(tǒng)的發(fā)展，目前以ITS序列及 β-tubulin、rpb1、rpb2 和 ef-1α 的多基因系統(tǒng)進(jìn)化分析，可有效界定綠僵菌屬物種間以及與相似真菌之間的邊界[8]。

對(duì)采自不同環(huán)境和寄主的綠僵菌的分離鑒定及遺傳多樣性分析表明，綠僵菌經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期進(jìn)化，已適應(yīng)了不同生存環(huán)境，形成了多重營(yíng)養(yǎng)方式。除了寄生各種昆蟲(chóng)，利用其營(yíng)養(yǎng)迅速增殖種群，還在土壤及植物根際棲息腐生，而且能與植物建立復(fù)雜的兼性共生關(guān)系，以避免自身遭受侵害、保存種質(zhì)，同時(shí)利于宿主攝取營(yíng)養(yǎng)和抵御病原[9-10]。這種廣適性演化及生態(tài)功能引發(fā)了研究者的極大興趣。

綠僵菌的多重生活方式是其長(zhǎng)期適應(yīng)多變環(huán)境的進(jìn)化結(jié)果。盡管人們對(duì)綠僵菌能夠定殖于植物根際并能棲息于植物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)較晚、研究較少，對(duì)其昆蟲(chóng)致病性發(fā)現(xiàn)更早、研究更多，但是進(jìn)化研究表明，綠僵菌是從與植物共生的真菌進(jìn)化而來(lái)的，其昆蟲(chóng)致病性是其在離開(kāi)植物獨(dú)立宿存后獲得的感染和殺死昆蟲(chóng)的能力[11]。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育分析，綠僵菌與草內(nèi)共生真菌麥角菌屬 Claviceps 和香柱菌屬 Epichloe 真菌同源性最高[12]。此外，比較基因組分析表明，與動(dòng)物病原體相比，綠僵菌與植物內(nèi)生菌和植物病原體的關(guān)系更密切，而且相比類酵母菌、腐生性植物病原菌、內(nèi)生性植物病原菌，綠僵菌譜系與植物內(nèi)共生的一種香柱菌 Epichloe festucae 譜系分化得更晚（大約100 MYA）[13]。綠僵菌基因組中有大量的植物降解酶基因，也支持其由植物共生真菌進(jìn)化的觀點(diǎn)[14];至于綠僵菌的昆蟲(chóng)致病性基因，可能是從涉及植物定殖相關(guān)基因或其他基因水平轉(zhuǎn)移的選擇而來(lái)[14]。而進(jìn)化的真菌可能會(huì)在界間“跳躍”，從植物到昆蟲(chóng)，再回到植物或仍然保持祖先的植物共生能力[15-16]，體現(xiàn)為生活方式的多樣性。對(duì)進(jìn)化的理解有助于我們探索綠僵菌-昆蟲(chóng)-植物的相互關(guān)系，尤其是作為昆蟲(chóng)病原的綠僵菌直接與植物發(fā)生根際聯(lián)絡(luò)或內(nèi)共生的互惠關(guān)系。

2 綠僵菌的根際生存和促進(jìn)植物生長(zhǎng)作用

植物根際（rhizosphere）一般指根表至附近幾毫米范圍內(nèi)的在理化和生物特性上不同于原土體的土壤微域。在確認(rèn)綠僵菌為昆蟲(chóng)病原體后一個(gè)多世紀(jì)，才有了綠僵菌根際適應(yīng)（rhizosphere-competent）能力的報(bào)道。2002年首次報(bào)道從甘藍(lán)根際土壤中分離、鑒定出了金龜子綠僵菌 Metarhizium anisopliae，并發(fā)現(xiàn)根際土壤內(nèi)的綠僵菌數(shù)量是根際外土壤的4倍;將綠僵菌釋放到甘藍(lán)田間6個(gè)月后，其在根際土壤中的存活數(shù)量比在根外圍土壤（bulk soil）中高100倍，因此認(rèn)為根際是綠僵菌的庇護(hù)所，根際因子對(duì)綠僵菌持續(xù)存活有促進(jìn)作用[17]。該結(jié)論后續(xù)在相似的試驗(yàn)中陸續(xù)得到證實(shí)。將標(biāo)記綠色熒光蛋白基因 gfp 的金龜子綠僵菌包衣玉米種子，播種后對(duì)金龜子綠僵菌的根際定殖及其數(shù)量動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)表明，根際土壤中的綠僵菌數(shù)量極顯著高于非根際土壤，并且在播種后10 d數(shù)量達(dá)到最大，20～30 d內(nèi)數(shù)量相對(duì)穩(wěn)定;而非根際土壤中的綠僵菌數(shù)量隨時(shí)間延長(zhǎng)明顯降低，證明了綠僵菌孢子在玉米根際的高活力和定殖效果[18]。

像大多數(shù)昆蟲(chóng)病原真菌一樣，綠僵菌具有一定的腐生能力。在離開(kāi)昆蟲(chóng)寄主的階段會(huì)面臨嚴(yán)峻的生存考驗(yàn)，既要獲取營(yíng)養(yǎng)維持生存，又要抵御不良環(huán)境因子。土壤是各種微生物的庇護(hù)場(chǎng)所，可避免紫外線輻射、緩沖溫度和水分的急劇變化等。根際是土壤中碳元素的富集區(qū)域，因?yàn)橹参锎x的碳有10%～40%以根分泌物、黏液、溶解物和脫落細(xì)胞的形式轉(zhuǎn)移到土壤中[19-20]。這些碳源可以被各種腐生微生物利用，一些分泌物可能刺激或抑制微生物活性和種群的發(fā)展。綠僵菌能否利用土壤或根際的碳源至關(guān)重要。將綠僵菌摻入到含有泥炭、樹(shù)皮的基質(zhì)中栽培云杉 Picea abies，在342 d內(nèi)17次采樣監(jiān)測(cè)綠僵菌種群數(shù)量，結(jié)果表明在基質(zhì)中綠僵菌種群數(shù)量保持在105～106 cfu/g，其在根際的存活數(shù)量顯著高于在根外圍的存活數(shù)量[21]。將綠僵菌與土壤混拌后用于池栽花生，每15 d采樣檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)施用的綠僵菌種群數(shù)量在初期快速下降，隨后逐漸穩(wěn)定或有所恢復(fù)，根際種群相對(duì)于根外圍的種群恢復(fù)較早、恢復(fù)程度更高，且有從根外圍向根際延展生長(zhǎng)的趨勢(shì)，表明根際有利于綠僵菌種群宿存和增殖[22]。

綠僵菌在自然界中存在物種多樣性和生態(tài)位差別，因此不同種類或菌株表現(xiàn)出根際定殖能力的強(qiáng)弱和宿主偏好不同。在對(duì)安徽省廣德市笄罩山毛竹 Phyllostachys edulis 根際綠僵菌組成及其生態(tài)位分布調(diào)查時(shí)，從不同海拔、不同坡向和不同季節(jié)采集的毛竹根系中共分離到4種綠僵菌，經(jīng)形態(tài)分類與分子鑒定，分別是羅氏綠僵菌 M.robertsii、平沙綠僵菌 M.pingshaense、貴州綠僵菌 M.guizhouense 和一個(gè)待定種 Metarhizium sp.，其中羅氏綠僵菌為優(yōu)勢(shì)種，廣泛分布于海拔100 m處，且在夏季種群數(shù)量達(dá)到高峰;待定種則主要分布于海拔400 m地帶;4種綠僵菌的時(shí)空生態(tài)位寬度和重疊度均呈現(xiàn)明顯的季節(jié)變化，總體上春季的空間生態(tài)位寬度最高，其中貴州綠僵菌的時(shí)間生態(tài)位寬度最低，待鑒定種的時(shí)間生態(tài)位寬度最高，而且貴州綠僵菌和待定種的空間生態(tài)位重疊度較高，在夏、秋季，平沙綠僵菌和羅氏綠僵菌的空間生態(tài)位重疊度最高，在冬季，待定種和平沙綠僵菌空間生態(tài)位重疊值最高[23]。從加拿大安大略省兩個(gè)地點(diǎn)采集的200多份草、野花、灌木和喬木的根系樣本中分離到102個(gè)綠僵菌菌株，按植物類型劃分得到的分離檢出率在35%～63%，野花根系檢出最多。經(jīng)鑒定，這些菌株歸屬于3個(gè)物種，即羅氏綠僵菌、褐色綠僵菌 M.brunneum 和貴州綠僵菌。其中從草的根際只檢測(cè)到羅氏綠僵菌;野花根際同時(shí)檢測(cè)到3種綠僵菌，而且只有當(dāng)存在羅氏綠僵菌時(shí)才同時(shí)出現(xiàn)其余2種;貴州綠僵菌在3種喬木

（主要是糖楓 Acer saccharum）的根際中單獨(dú)出現(xiàn);而褐色綠僵菌可單獨(dú)地在灌木和喬木的根際中發(fā)現(xiàn)[24]。將3株羅氏綠僵菌、3株金龜子綠僵菌、3株褐色綠僵菌和1株蝗綠僵菌 M.acridum 的分別接種玉米，測(cè)試它們?cè)诟H的定殖能力，結(jié)果顯示10個(gè)菌株均能在玉米根部定殖，但蝗綠僵菌菌株和1個(gè)褐色綠僵菌菌株的定殖能力很弱[25]。

綠僵菌不只是單向地從根際汲取碳源營(yíng)腐生生活，同時(shí)也在植物攝取營(yíng)養(yǎng)或在抵抗寄生物侵害和植食性動(dòng)物啃食方面起積極作用。上述報(bào)道的在玉米根際定殖力較強(qiáng)的8個(gè)綠僵菌菌株都能顯著促進(jìn)植株的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，其中褐色綠僵菌Mb820和金龜子綠僵菌Ma939處理種子后2周時(shí)玉米葉領(lǐng)數(shù)較對(duì)照增加42.8%[20]。此外，還有不少綠僵菌促進(jìn)植物生長(zhǎng)的報(bào)道，例如，在花生播種時(shí)用金龜子綠僵菌分生孢子懸浮液浸種處理，4～10 d內(nèi)，花生主根長(zhǎng)度和側(cè)根數(shù)顯著高于對(duì)照;綠僵菌密度在前8 d呈波動(dòng)趨勢(shì)，且處理植株的主根長(zhǎng)度和側(cè)根數(shù)相對(duì)于對(duì)照的比值與綠僵菌存活密度有顯著的相關(guān)性[26]?；ㄉN植期間，分別于播種（0 d）、幼苗（15 d）、初花（30 d）、盛花（45 d）、結(jié)莢（60 d）期施用金龜子綠僵菌，對(duì)根際綠僵菌數(shù)量監(jiān)測(cè)結(jié)果表明，初花期施用綠僵菌能夠最好地保持其種群數(shù)量，并且在施菌后30～45 d綠僵菌數(shù)量顯著上升，此期間正值花生根系快速發(fā)育時(shí)期;初花期施用還能導(dǎo)致蠐螬死亡，致死率最高可達(dá)72%，而蠐螬減退率與花生產(chǎn)量顯著相關(guān)，因此最終減少了莢果受損率，提高了花生產(chǎn)量[27]。值得注意的是，用褐色綠僵菌處理大豆種子后播種，在植株莖中檢測(cè)到綠僵菌，而其在莖中的內(nèi)生增加了植株對(duì)大豆蚜 Aphis glycines 的敏感性，植株上蚜蟲(chóng)種群數(shù)量有所增加[28]，此現(xiàn)象最終是否對(duì)植物健康產(chǎn)生顯著的負(fù)面影響值得關(guān)注，也提示蟲(chóng)-菌-植物之間可能存在微妙關(guān)系，需要深入探討。

綠僵菌在根際定殖過(guò)程中，還可通過(guò)影響根際微生物群落而對(duì)植物產(chǎn)生間接作用，這種作用主要是通過(guò)拮抗、競(jìng)爭(zhēng)或排斥植物病原體而促進(jìn)植物健康生長(zhǎng)。室內(nèi)試驗(yàn)顯示，能夠在玉米、棉花根際定殖的3株金龜子綠僵菌對(duì)幾種重要植物根系病菌均有顯著抑制作用。在對(duì)峙培養(yǎng)時(shí)，綠僵菌與病原菌菌落之間形成明顯的拮抗隔離帶，5 d時(shí)對(duì)棉花枯萎病菌Fusarium oxysporum f.sp. vasinfectum、小麥紋枯病菌Rhizoctonia cerealis的生長(zhǎng)抑制率分別為43.2%～49.5%、41.1%～45.6%，對(duì)玉米莖基腐病菌Fusarium moniliforme和Pythium aphamideimatum的生長(zhǎng)抑制率為65.3%～69.2%;對(duì)油菜菌核病菌Sclerotinias clerotiorum 3 d時(shí)的抑制率為28.3%～34.2%，且在7 d時(shí)對(duì)峙菌落間形成明顯的抑菌圈，病原菌基本上不能形成菌核，菌絲變褐老化。采用106 cfu/mL金龜子綠僵菌分生孢子懸浮液處理，5 d時(shí)對(duì)棉花枯萎病菌、小麥紋枯病菌的菌絲生長(zhǎng)抑制率可分別達(dá)到70%和65%;濾除細(xì)胞的綠僵菌發(fā)酵液處理也能夠抑制這2種病原菌的菌絲生長(zhǎng)，抑制率分別為57.0%～59.9%和485%～586%，并抑制分生孢子或菌核的形成[29]。在與菜豆根腐病菌Fusarium solani f.sp. phaseoli的對(duì)峙培養(yǎng)試驗(yàn)中，羅氏綠僵菌能夠顯著抑制病原菌生長(zhǎng)，相對(duì)抑制率達(dá)到60%;同時(shí)羅氏綠僵菌的無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)濾液對(duì)菜豆根腐病菌孢子萌發(fā)抑制率達(dá)到83%，且濾液中的抑制物具有熱穩(wěn)定性;當(dāng)接種菜豆根腐病菌時(shí)，有綠僵菌定殖的菜豆植株比對(duì)照植株更健壯，病情指數(shù)更低[30]。

田間施用綠僵菌會(huì)顯著影響土著微生物種群的消長(zhǎng)和群落結(jié)構(gòu)變化?；ㄉシN時(shí)施用金龜子綠僵菌，并對(duì)整個(gè)生長(zhǎng)季的微生物種群變化進(jìn)行監(jiān)測(cè)，結(jié)果表明金龜子綠僵菌對(duì)根際微生物的影響大于對(duì)根外圍微生物的影響，其中對(duì)放線菌的影響最大，真菌次之，對(duì)細(xì)菌影響最小。由于拮抗抑制作用，根際放線菌種群消長(zhǎng)周期出現(xiàn)與對(duì)照完全相反的情形，且45 d時(shí)回落至低點(diǎn)后不再回升;對(duì)真菌影響也較大，初期花生根際真菌種群的下降速度減緩，與對(duì)照相比，到達(dá)谷底的時(shí)間推遲了15 d，但回升速度加快，到達(dá)峰值時(shí)間提前了15 d，但峰值降低了1/3;在施菌后15～30 d的幼苗至初花期土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化最為顯著，在盛花期后，3類微生物群落結(jié)構(gòu)逐漸恢復(fù)趨近原來(lái)狀態(tài)[31]。進(jìn)一步探討土著微生物種群變化與綠僵菌種群及植株發(fā)育相關(guān)性可能會(huì)獲知更多重要信息，包括綠僵菌影響土著微生物的主要物種及其種群變化，影響根際土壤元素、酶等組分變化及其對(duì)植株攝取氮、鉀等營(yíng)養(yǎng)物調(diào)節(jié)發(fā)育作用等。

3 綠僵菌植物內(nèi)生性及定殖作用

植物內(nèi)生真菌（endophytic fungi）是指整個(gè)生活史或部分時(shí)段在植物健康組織內(nèi)生存，并不會(huì)引起宿主明顯病癥的一類真菌（https：∥encyclopedia.thefreedictionary.com/endophytic）。綠僵菌在田間土壤中并非隨機(jī)分布，而是趨向于在植物根際宿存、增殖，說(shuō)明其具有與植物共生的潛力。在確定綠僵菌根際定殖、促進(jìn)植物發(fā)育功能后將近十年，Elena 等[32]于2011年驗(yàn)證了綠僵菌的內(nèi)生性。研究者將金龜子綠僵菌3個(gè)菌株的分生孢子分別接種到番茄幼苗基部附近，處理21 d 后從植株根和芽都能分離到這3個(gè)菌株，葉片中也分離到1個(gè)菌株，證明了綠僵菌的內(nèi)生性，并說(shuō)明其能夠在植物內(nèi)部移動(dòng)。此后，陸續(xù)有綠僵菌屬物種在不同農(nóng)作物中定殖和促進(jìn)增長(zhǎng)的報(bào)道，包括菜豆[33]、大豆[34]、玉米[35]、小麥[36]、木薯[37]、蠶豆[38]、馬鈴薯[39]、谷物黑麥和奧地利冬豌豆[40]等。這些報(bào)道主要是通過(guò)根表接種或基質(zhì)接種處理后，采用組織分離培養(yǎng)法分離菌落并鑒定，或通過(guò)真菌特異性染色（棉藍(lán)染色）根組織切片的方法來(lái)鑒定。Cai等采用eGFP標(biāo)記的綠僵菌菌株處理玉米根部基質(zhì)，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察，從處理后14 d的根中捕捉到熒光菌絲的清晰圖像，可見(jiàn)菌絲不僅在根表增殖纏結(jié)，還進(jìn)入了根組織，沿細(xì)胞外的間隙縱向延伸，甚至可增殖成菌絲團(tuán)，直接可視化證明了綠僵菌的植物內(nèi)生性[41]。

與對(duì)昆蟲(chóng)致病能力類似，綠僵菌在植物組織中的定殖能力因其種類和株系、寄主物種和環(huán)境條件（如紫外線輻射、溫度、濕度）而異[42]。將10個(gè)具有一定昆蟲(chóng)致病力的分屬于9個(gè)種的綠僵菌菌株接種于不同供試植物，20 d內(nèi)所有菌株均能在2種單子葉植物玉米和大麥根中內(nèi)生定殖，盡管菌株的定殖能力不同，但其定殖能力與它們對(duì)昆蟲(chóng)的寄生能力無(wú)明顯關(guān)聯(lián);在4種雙子葉植物中，只在青椒中發(fā)現(xiàn)綠僵菌成功定殖，而在菜豆、豌豆和番茄中未檢測(cè)到綠僵菌內(nèi)生定殖，說(shuō)明綠僵菌對(duì)寄主植物存在偏好性，更傾向于單子葉植物宿主[16]。

綠僵菌與許多內(nèi)生真菌一樣，在寄主植物組織中表現(xiàn)出根部?jī)?yōu)先定位。在加拿大3個(gè)野外地點(diǎn)隨機(jī)采集禾本科和非禾本科植物，從97株不同植物的根、下胚軸、莖和葉中分離到了綠僵菌、球孢白僵菌 Beauveria bassiana 及食線蟲(chóng)的厚垣普可尼亞菌 Pochonia chlamydosporium，其中綠僵菌中95%為羅氏綠僵菌，幾乎都定殖于植物的根部，只有不到1%定殖于下胚軸內(nèi)，在莖和葉中均未發(fā)現(xiàn)綠僵菌[43]。另外，對(duì)綠僵菌在大豆和玉米上的定殖模式進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，作為內(nèi)生真菌，綠僵菌優(yōu)先定殖于下胚軸（hypocotyl），而在根表和根際定殖，也最常見(jiàn)于下胚軸附近的區(qū)域[44]。這些結(jié)果與綠僵菌會(huì)優(yōu)先感染近地下植物組織（即根系）區(qū)域的昆蟲(chóng)是一致的，反映出綠僵菌在土壤中能夠“因地制宜”地轉(zhuǎn)換植物內(nèi)生或昆蟲(chóng)寄生的生活方式。盡管自然條件下綠僵菌都限于在宿主植物根系中，但通過(guò)某些接種方法，如葉面噴灑、莖注射和種子浸泡，也能觀察到其在植物地上組織中定殖[45-47]。

4 綠僵菌與植物互作及共生機(jī)理

綠僵菌在植物根際和根內(nèi)定殖以及與植物的互作機(jī)理研究雖取得一定進(jìn)展，但仍非常有限。目前的研究表明，綠僵菌可在植物組織中定殖并與宿主持續(xù)共生，但并未發(fā)現(xiàn)其對(duì)植物具有類似昆蟲(chóng)致病性那樣的具體特征或機(jī)制。然而，其定殖和共生過(guò)程可能涉及大量基因和小分子，這些基因和小分子有助于其在根際定殖、根上黏附、與宿主植物之間的交流及調(diào)節(jié)宿主的防御反應(yīng)等[46]。

綠僵菌的根際生存能力除了取決于綠僵菌物種或菌株自身特性外，植物根分泌物是影響其根際生存的重要因子。在豇豆根分泌物中，8個(gè)具有昆蟲(chóng)廣譜致病性的金龜子綠僵菌菌株萌發(fā)率表現(xiàn)出極顯著差異，并與根分泌物濃度相關(guān)。3個(gè)根際定殖能力較強(qiáng)的菌株在1 mg/mL濃度下的萌發(fā)率達(dá)到76.6%～939%，根際定殖能力弱的菌株萌發(fā)率只有6.5%;在0.01 mg/mL的極低濃度下，根際定殖能力最強(qiáng)的菌株2575#仍能保持88.6%的萌發(fā)率[48]。進(jìn)一步通過(guò)微陣列基因表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)菌株2575#在 12 h 內(nèi)有29個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，21個(gè)基因下調(diào)表達(dá)。上調(diào)的基因涉及碳水化合物代謝、脂質(zhì)代謝、輔助因子和維生素、能量代謝、蛋白質(zhì)水解、細(xì)胞外基質(zhì)/細(xì)胞壁蛋白、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、DNA合成、性周期和應(yīng)激反應(yīng)。然而，上調(diào)基因中有41.3%是假設(shè)基因或孤立基因，說(shuō)明許多尚未鑒定的基因參與了腐生相關(guān)的功能。值得關(guān)注的是，在已知蛋白的編碼基因中，參與對(duì)昆蟲(chóng)致病的類枯草菌素（subtilisin）蛋白酶 Pr1A 基因、對(duì)植物表面附著起重要作用的黏附素 MAD2基因也表現(xiàn)出對(duì)根分泌物的上調(diào)反應(yīng)，說(shuō)明綠僵菌具有受根分泌物誘導(dǎo)的根際定殖基因[49]。

關(guān)于綠僵菌從根際向根組織中轉(zhuǎn)移定殖，通過(guò)帶有 gfp 標(biāo)記的羅氏綠僵菌得到了證明。將 gfp 標(biāo)記的羅氏綠僵菌孢子接種于土壤后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察到孢子在柳枝稷 Panicum virgatum 和菜豆根表附著、萌發(fā)和定殖;并且在孢子萌發(fā)前1～2 d就出現(xiàn)植物根毛細(xì)胞增殖;無(wú)細(xì)胞的綠僵菌濾液并不能刺激根毛的增殖;施菌后60 d，可檢測(cè)到帶 gfp 標(biāo)記的菌絲體在菜豆根皮層細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間隙聚集，對(duì)植物沒(méi)有明顯的損害[33]。

綠僵菌對(duì)植物的附著和侵入是由根際生存到根內(nèi)共生的聯(lián)結(jié)過(guò)程。實(shí)際上，根際生存、根表定殖到根內(nèi)定殖并非孤立事件，也沒(méi)有明顯界限，而是相互關(guān)聯(lián)的過(guò)程。只是為了便于觀察和研究描述而人為劃分的階段或狀態(tài)。因此，根際互作或內(nèi)生的機(jī)理可能是緊密相關(guān)的，存在共同的、連續(xù)相關(guān)的或遠(yuǎn)程調(diào)節(jié)的分子反應(yīng)。其從腐生向植物內(nèi)生，或向作為昆蟲(chóng)病原的生活方式轉(zhuǎn)換可能涉及很多基因，例如參與降解植物宿主細(xì)胞壁或昆蟲(chóng)角質(zhì)層成分的基因。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)綠僵菌有2種與其侵入昆蟲(chóng)和定殖植物相關(guān)的黏附素蛋白MAD1和MAD2。在大豆根分泌物中，金龜子綠僵菌的 mad2 表達(dá)明顯增高，且與其在富營(yíng)養(yǎng)的人工培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的表達(dá)相一致;而綠僵菌在昆蟲(chóng)表皮或淋巴液中生長(zhǎng)時(shí)主要表達(dá) mad1，間接證明了綠僵菌根際營(yíng)養(yǎng)方式和與植物共生互作可能與MAD2相關(guān)[50]。進(jìn)一步研究證明，綠僵菌在昆蟲(chóng)或植物表皮附著時(shí)MAD1或MAD2分別上調(diào)表達(dá)，意味著綠僵菌進(jìn)化出了適于昆蟲(chóng)寄主和與植物宿主共生的機(jī)制[51-52]。并且相對(duì)于MAD1，MAD2有更多的多態(tài)性變化，說(shuō)明是它推動(dòng)了綠僵菌的適應(yīng)性進(jìn)化，并參與了對(duì)植物的內(nèi)共生定殖[53]。

為了證明黏附素MAD1和MAD2的作用，研究人員進(jìn)行了黏附素體外表達(dá)和基因敲除突變。以羅氏綠僵菌的mad2敲除株接種柳枝稷，與野生型對(duì)照相比，根毛的增殖顯著減緩[33]。金龜子綠僵菌的mad2敲除后，其生長(zhǎng)受到顯著抑制，表現(xiàn)為孢子萌發(fā)率顯著降低，萌發(fā)中時(shí)比野生型菌株長(zhǎng)5.47 h，12 h菌絲生長(zhǎng)長(zhǎng)度只有野生型菌株的77.8%，12 d的產(chǎn)孢量比野生型菌株減少33.3%。同時(shí)，敲除株對(duì)洋蔥內(nèi)表皮的黏附力明顯降低，但對(duì)蝗蟲(chóng)后翅的黏附性無(wú)顯著影響[54]。相似地，另一個(gè)黏附素基因 mad1 敲除后，金龜子綠僵菌的生長(zhǎng)也受到顯著抑制，與野生型菌株相比，產(chǎn)孢量降低了43.7%，分生孢子萌發(fā)中時(shí)延長(zhǎng)了13.4 h，而且對(duì)家蠶的半致死時(shí)間LT50延長(zhǎng)了7.6 d[55]。

為了研究綠僵菌附著和定殖過(guò)程中宿主植物的分子響應(yīng)，分析了綠僵菌處理的花生轉(zhuǎn)錄組，共有164個(gè)基因發(fā)生顯著差異表達(dá)，其中16個(gè)上調(diào)、148個(gè)下調(diào)，主要涉及氧化還原過(guò)程、轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程和代謝過(guò)程等3方面，從多方向與防御調(diào)控相關(guān)的組合通路相關(guān)聯(lián)，另外還有一些信號(hào)交叉或基因互作，如苯丙氨酸代謝與水楊酸合成、脫落酸合成與類胡蘿卜素的合成、氮轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與硝酸鹽還原酶以及鐵的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝等;下調(diào)表達(dá)基因最富集的兩條途徑是植物-病原菌相互作用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和植物激素茉莉酸信號(hào)通路[56]。在轉(zhuǎn)錄組分析的基礎(chǔ)上，通過(guò)mRNA轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)水平的驗(yàn)證，并與植物病原菌尖孢鐮刀菌 Fusarium oxysporum 的侵染過(guò)程相比較，發(fā)現(xiàn)綠僵菌對(duì)植物的成功定殖和侵染過(guò)程類似于尖孢鐮刀菌，二者都顯著抑制了寄主的基礎(chǔ)防御反應(yīng)，但植物只對(duì)尖孢鐮刀菌啟動(dòng)了細(xì)胞程序性死亡的分子響應(yīng)即過(guò)敏反應(yīng)，而綠僵菌的誘導(dǎo)抗性反應(yīng)相對(duì)較弱。此外，綠僵菌還誘導(dǎo)了植物生長(zhǎng)相關(guān)基因或其與植物共生相關(guān)基因的顯著上調(diào)表達(dá)，包括共生受體基因（SYMRK）、鈣信號(hào)解碼相關(guān)基因（CaM、 CCaMK 和 DELLA）、脂質(zhì)氮素轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因（LTP1、 NRT24、 ABCC2）、木質(zhì)素合成相關(guān)基因（F6H1）等，表明宿主植物可能主動(dòng)啟動(dòng)和協(xié)調(diào)了與綠僵菌建立共生的相關(guān)程序[57]。再對(duì)比 mad2 敲除株處理的花生中上述相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，除了 SYMRK 轉(zhuǎn)錄水平仍有一定的上調(diào)， CaM、 CCaMK 和 DELLA 基因均表現(xiàn)為顯著下調(diào)，基因缺失的負(fù)向表現(xiàn)說(shuō)明了黏附素MAD2在綠僵菌與花生互作早期觸發(fā)了花生共生基因的積極響應(yīng)[54]。另外，MAD1也參與綠僵菌對(duì)花生的誘導(dǎo)響應(yīng)，用綠僵菌 mad1 敲除株處理花生，顯示花生免疫類基因（CNGC1、PCD4）、抗病基因（SWEET10）及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（WRKY41、 MY86）的轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)，而鈣調(diào)素（CML5、 CLM19）的轉(zhuǎn)錄表達(dá)受到明顯抑制，說(shuō)明MAD1參與抑制植物抗性級(jí)聯(lián)、減弱過(guò)敏反應(yīng)，同時(shí)增強(qiáng)共生信號(hào)的傳導(dǎo)，協(xié)同促進(jìn)綠僵菌在花生根組織中的定殖[55]。進(jìn)一步用體外表達(dá)的MAD1蛋白處理花生根，發(fā)現(xiàn)MAD1蛋白處理后6 h時(shí)花生根上膜受體基因 CERK1和 RPK 的識(shí)別響應(yīng)被激活，同時(shí)抑制花生免疫級(jí)聯(lián)基因（MAPK、 CDPK、 MMK1）及防御相關(guān)基因（如 PTi1、 RML1A）的表達(dá)，以助于綠僵菌定殖;隨后誘導(dǎo)花生細(xì)胞壁整合基因 SCW1上調(diào)表達(dá)，參與根上受損細(xì)胞壁的修復(fù)與重建，促進(jìn)綠僵菌與花生共生關(guān)系的建立[58]。

在共生界面（symbiotic interface）方面，可從綠僵菌與植物的營(yíng)養(yǎng)互惠和分子調(diào)控來(lái)認(rèn)識(shí)。自然界中，絕大部分的碳水化合物來(lái)自植物的光合作用，而大多數(shù)植物需要通過(guò)固氮菌或通過(guò)微生物對(duì)動(dòng)植物殘?bào)w或代謝物的分解來(lái)獲取氮，植物與微生物之間形成了相互依賴甚至密切共生的關(guān)系。綠僵菌以腐生、昆蟲(chóng)病原或植物內(nèi)生菌的多重方式存在于生態(tài)系統(tǒng)中，不僅可以獲取植物源的碳和昆蟲(chóng)源的氮，還可能將其植物內(nèi)生能力和對(duì)昆蟲(chóng)的致病能力結(jié)合在一起，提供一種通過(guò)菌絲向植物宿主轉(zhuǎn)移氮的有效途徑。此氮轉(zhuǎn)移途徑已經(jīng)通過(guò)同位素標(biāo)記的精巧試驗(yàn)得到證實(shí)。研究人員向大蠟螟 Galleria mellonella 注射了同位素標(biāo)記的15N，在蟲(chóng)體與供試植物菜豆和柳枝稷隔離的條件下，跟蹤檢測(cè)到羅氏綠僵菌利用土壤微環(huán)境將昆蟲(chóng)的15N轉(zhuǎn)移到植株中轉(zhuǎn)化為氨基酸的過(guò)程[59]。這一發(fā)現(xiàn)表明，植物在昆蟲(chóng)-真菌-植物三方互作中主動(dòng)獲取氮源可能性超越了人們以前的認(rèn)知，也顯示了綠僵菌在氮循環(huán)轉(zhuǎn)移過(guò)程中的重要生態(tài)角色。

植物與綠僵菌的共生對(duì)綠僵菌本身也是有益的。綠僵菌能夠?qū)⒗ハx(chóng)來(lái)源的氮轉(zhuǎn)移給宿主植物，作為回報(bào)，綠僵菌也接受了植物的光合產(chǎn)物即固定碳。這一過(guò)程經(jīng)同位素示蹤試驗(yàn)也得到了證實(shí)。研究者通過(guò)在密閉的植物生長(zhǎng)室中加入同位素標(biāo)記的13CO2，跟蹤了空氣中的13C轉(zhuǎn)化，通過(guò)核磁共振（NMR）分析，發(fā)現(xiàn)13C與扁豆的光合產(chǎn)物結(jié)合，包括果糖、葡萄糖和蔗糖;在植物根部基質(zhì)接種羅氏綠僵菌 21 d 后，檢測(cè)到綠僵菌的根際定殖和根內(nèi)定殖，并通過(guò)NMR在根提取物中檢測(cè)到13C結(jié)合的幾丁質(zhì)和海藻糖這二種真菌特有的碳水化合物，而未接種綠僵菌的根中沒(méi)有13C的幾丁質(zhì)和海藻糖。這種綠僵菌從植物獲取碳源的現(xiàn)象與土壤里有沒(méi)有昆蟲(chóng)無(wú)關(guān)，也與是否已經(jīng)從昆蟲(chóng)體內(nèi)獲得昆蟲(chóng)氮后轉(zhuǎn)移給植株無(wú)關(guān)，說(shuō)明綠僵菌從植物獲取碳源已經(jīng)成為一種穩(wěn)定機(jī)制，也表明營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的相互交換可能促進(jìn)了真菌-植物關(guān)系的穩(wěn)定[60]。由此可見(jiàn)，綠僵菌與宿主植物之間的互惠關(guān)系并非是獨(dú)立的，而是與其對(duì)昆蟲(chóng)的致病性密切相關(guān)，對(duì)昆蟲(chóng)致病機(jī)制的進(jìn)化可能是綠僵菌的一種適應(yīng)性特征，從而使得綠僵菌與植物之間的共生關(guān)系更加穩(wěn)定牢靠，有利于綠僵菌的種質(zhì)續(xù)存。

至于綠僵菌如何通過(guò)共生界面交換獲得植物碳源，研究人員發(fā)現(xiàn)了一個(gè)重要的寡糖轉(zhuǎn)運(yùn)子（Metarhizium raffinose transporter，MRT）基因，它對(duì)綠僵菌攝取棉子糖和蔗糖起關(guān)鍵作用。敲除 Mrt 基因的羅氏綠僵菌菌株在根系分泌物中生長(zhǎng)不良，在根際定殖能力大大降低。MRT是蔗糖和半乳糖苷的轉(zhuǎn)運(yùn)子，干擾MRT的表達(dá)可導(dǎo)致菌株在蔗糖和半乳糖培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)大大減少或完全不生長(zhǎng)，但不影響其在完全由葡萄糖亞基組成的單糖或寡糖培養(yǎng)基上的生長(zhǎng);同時(shí)， Mrt 基因只在半乳糖苷和蔗糖的條件下上調(diào)表達(dá)。進(jìn)一步通過(guò) Mrt 啟動(dòng)子控制下表達(dá)綠色熒光蛋白基因，證實(shí)了 Mrt 基因在草根附近的胚芽中表達(dá)，但在根外圍土壤中不表達(dá)。這些試驗(yàn)證明了綠僵菌攝取特定的寡糖碳源對(duì)于真菌-植物共生關(guān)系的建立至關(guān)重要，而MRT轉(zhuǎn)運(yùn)是一條植物源碳水化合物向真菌轉(zhuǎn)移的潛在途徑[61]。

5 討論與展望

雖然微生物與植物互作和共生現(xiàn)象很常見(jiàn)，并已有較多的研究報(bào)道，但相關(guān)機(jī)理至今仍未完全清楚。對(duì)綠僵菌與植物互作及共生關(guān)系的認(rèn)知更為有限，還需要更多的研究。對(duì)其生態(tài)作用和機(jī)理的推測(cè)，一方面可從其他微生物如根瘤菌、叢枝菌根真菌與植物的共生關(guān)系中得到一些提示;另一方面，對(duì)綠僵菌的昆蟲(chóng)致病機(jī)理已有較深入了解，而其對(duì)昆蟲(chóng)的致病性是由植物內(nèi)生性進(jìn)化出的一種適應(yīng)特征，那么或許可以結(jié)合其作為昆蟲(chóng)病原的致病機(jī)理，追溯其中保留的植物內(nèi)生性的痕跡來(lái)做出某些判斷?？赡芡萍暗墓餐J(rèn)識(shí)是，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期共同進(jìn)化，微生物（如根瘤菌、叢枝菌根真菌等）與植物能夠在植物根際或根表產(chǎn)生可相互識(shí)別的分子模式，彼此也具備相應(yīng)的受體，植物受體識(shí)別微生物分子模式后激活細(xì)胞膜蛋白，并使Ca2+或其他離子通道開(kāi)閉變化，向胞內(nèi)傳遞信號(hào)，觸發(fā)胞內(nèi)各種分子響應(yīng)，包括轉(zhuǎn)錄重編程、防御反應(yīng)基因的上調(diào)或下調(diào)表達(dá)，營(yíng)養(yǎng)代謝路徑的調(diào)控等，使宿主出現(xiàn)兼容和利于共生的狀態(tài)。由于進(jìn)化，綠僵菌與植物相互識(shí)別的分子模式可能有多種類型，例如不同的寡糖、不同的肽段等，各物種的分子模式存在相對(duì)特異性。另外，綠僵菌對(duì)昆蟲(chóng)的致病性是其最利于增殖繁衍的成功進(jìn)化，而與植物的共生是兼性的，只是其多重生活方式之一，這種兼性共生可能是保持了祖先的植物共生能力，也可能是界間“跳躍”從昆蟲(chóng)返回植物[15-16]，加上有其他微生物和/或真菌的競(jìng)爭(zhēng)，這種兼性共生在植物中生存量通常較少或者有短暫性[62]。至今尚未發(fā)現(xiàn)像根瘤或菌根那樣的共生表型，也還未確定綠僵菌與植物共生的標(biāo)志物質(zhì)或分子，因此目前還主要從現(xiàn)象與功能的層面來(lái)分析闡釋。

無(wú)論如何，綠僵菌的植物根際定殖能力和與植物的內(nèi)共生關(guān)系已經(jīng)明確，并已證實(shí)這種關(guān)系是互惠的。對(duì)于植物，綠僵菌具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育、增強(qiáng)植株系統(tǒng)抗性、拮抗植物病原等益處;對(duì)于綠僵菌，有利于在無(wú)昆蟲(chóng)寄主階段保持種群生存延續(xù)，甚至在極端不利環(huán)境下保存種質(zhì)。這種由進(jìn)化形成的獨(dú)特多功能生態(tài)位蘊(yùn)藏著重要的植物保護(hù)潛力。不僅可以利用綠僵菌對(duì)昆蟲(chóng)的致病性作為有效殺蟲(chóng)劑，利用其腐生性進(jìn)行大規(guī)模的人工培養(yǎng)和發(fā)酵生產(chǎn)，還可以挖掘和利用其在植物根際定殖的能力和與植物共生的關(guān)系，維護(hù)田間長(zhǎng)期的有效控害種群，建立有利于自然調(diào)控、促進(jìn)植物健康的生態(tài)體系。具體地，在綠僵菌的應(yīng)用策略上，把它納入農(nóng)業(yè)系統(tǒng)中的一員，在應(yīng)用實(shí)踐中，通過(guò)維護(hù)環(huán)境因子最大限度地保護(hù)其種群活力，發(fā)揮其寄生害蟲(chóng)、根際/根內(nèi)定殖促進(jìn)植物生長(zhǎng)、調(diào)節(jié)生態(tài)的潛力，實(shí)現(xiàn)綜合植物保護(hù)作用。為此，可在選擇和構(gòu)建生防菌株時(shí)，除了注重對(duì)害蟲(chóng)的致病力，還應(yīng)考察其對(duì)環(huán)境的生存適應(yīng)能力;除了在蟲(chóng)害發(fā)生時(shí)釋放大量菌劑，還可在種植早期低劑量引入，并通過(guò)優(yōu)選助劑和農(nóng)事操作，保護(hù)和促進(jìn)綠僵菌種群在根際定殖，發(fā)揮其促進(jìn)根系發(fā)育、屏蔽根系害蟲(chóng)的作用，或許在拮抗某些植物病原上也有潛力;進(jìn)一步研究綠僵菌的植物內(nèi)共生作用，明確其誘導(dǎo)植物抗性機(jī)理，還可能通過(guò)促進(jìn)與植物內(nèi)共生，構(gòu)建對(duì)病蟲(chóng)害抗性的植物品系或栽培方法。未來(lái)在揭示植物-綠僵菌-昆蟲(chóng)之間互作關(guān)系機(jī)制的基礎(chǔ)上，將可能實(shí)現(xiàn)綠僵菌生防菌劑的多方位的綜合利用。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）