張 鑫， 桑占發(fā)， 于海波， 宋海旭， 梅 竹， 劉 晶， 閆承慧

1.北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 心血管內(nèi)科，遼寧 沈陽(yáng) 110016；2.解放軍32295部隊(duì)檢驗(yàn)病理科，遼寧 遼陽(yáng) 111000

糖尿病是一種發(fā)病率極高的慢性疾病[1]，主要病理分型為Ⅰ型(胰島素依賴型)和Ⅱ型(非胰島素依賴型)糖尿病，前者是由于胰島β細(xì)胞失去功能導(dǎo)致胰島素缺乏而引起血糖升高，后者是由于各種因素引起胰島素信號(hào)異常、使外周組織對(duì)胰島素的敏感性下降而使葡萄糖吸收功能下降或缺失，最終導(dǎo)致血糖升高[2]。目前，由于各種環(huán)境因素和長(zhǎng)期不良的生活習(xí)慣而引起的代謝綜合征進(jìn)展成為Ⅱ型糖尿病約占全部糖尿病患者的90%以上[3]。無(wú)論是Ⅰ型還是Ⅱ型糖尿病，長(zhǎng)期持續(xù)的高血糖會(huì)引起各種并發(fā)癥，包括大血管病變(如冠心病、高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、心肌病變等)和微血管病變(腎病、視網(wǎng)膜病變、神經(jīng)病變、肝病變等)。其中，糖尿病性心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是一種獨(dú)立于高血壓、冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化等癥狀的由高血糖和/或高血脂等因素直接引起的心臟疾病，50%以上的糖尿病患者最終死于DCM導(dǎo)致的心力衰竭[4-5]。有效抑制DCM發(fā)生和進(jìn)展是降低糖尿患者病死率的重要手段[6]。達(dá)格列凈是SGLT2抑制劑類降糖藥[7]，SGLT2是鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，屬于溶質(zhì)載體家族5(solute carrier family 5，SLC5)，因此SGLT2又稱為SLC5A2，位于近端腎小管S1/S2段的刷狀緣膜上，負(fù)責(zé)90%以上葡萄糖的重吸收。達(dá)格列凈通過(guò)抑制腎小管上皮細(xì)胞中SGLT2的功能，抑制尿糖吸收，從而降低血糖[7]。目前，有研究報(bào)道，達(dá)格列凈還具有良好的心腎保護(hù)作用[8-9]。但其作用機(jī)制尚不明確。本研究應(yīng)用高脂飲食(high fat diet，HFD)喂養(yǎng)方式建立Ⅱ型糖尿病小鼠模型，并給予達(dá)格列凈干預(yù)觀察小鼠心功能的改變，進(jìn)而通過(guò)基因組學(xué)大數(shù)據(jù)和生物信息學(xué)分析嘗試尋找其作用通路?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 本研究所用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均為無(wú)特定病原體級(jí)，C57BL/6J小鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，并在北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院全軍重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)。本研究經(jīng)北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)認(rèn)可。

1.2 糖尿病心肌損傷小鼠模型制備 選取20只6～8周齡的C57BL6J雄性小鼠給予HFD(甘油三酯60%)喂養(yǎng)造模。濕度40%～60%，溫度20℃～25℃，晝夜節(jié)律為12 h/12 h。飼養(yǎng)所用籠具及相關(guān)器材均定期消毒，每周定時(shí)更換墊料2次。小鼠定期檢測(cè)體質(zhì)量、心臟超聲和血糖，HFD喂養(yǎng)24周時(shí)成模。將成模小鼠隨機(jī)分成兩組，達(dá)格列凈干預(yù)組給予達(dá)格列凈10 mg/(kg·d)，HFD單獨(dú)喂養(yǎng)組給予正常飲用水，繼續(xù)喂養(yǎng)3個(gè)月，每個(gè)月用心臟超聲監(jiān)測(cè)心功能改變情況。成模后，所有小鼠空腹12 h后用異氟烷行全身麻醉，麻醉成功后用無(wú)菌手術(shù)器械將各臟器組織取材。

1.3 心臟組織標(biāo)本的收集 分別收集達(dá)格列凈干預(yù)組和HFD單獨(dú)喂養(yǎng)組小鼠各3只。將小鼠麻醉，采用眼科剪打開胸腔，摘取心臟。應(yīng)用生理鹽水灌注沖洗后，用滅菌衛(wèi)生紙吸取組織表面附著的水滴。直接將標(biāo)本放置于含有2 ml TRIzol試劑的15 ml離心管中保存。

1.4 心臟組織石蠟標(biāo)本制備 橫軸切取新鮮的心臟組織在生理鹽水中沖洗干凈，置于4%的多聚甲醛中固定24 h，流水沖洗2 h，分別在梯度酒精中脫水，在二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中透明，將組織放在50℃～52℃的石蠟Ⅰ中過(guò)夜，再在60℃～62℃的石蠟Ⅱ、Ⅲ中浸泡60 min，恢復(fù)到室溫，即得到包埋好的組織蠟塊。

1.5 HE染色 將石蠟切片分別置于二甲苯和梯度酒精中脫蠟后，置于蘇木素中10 min，水洗切片；然后置于鹽酸酒精中分化30 s，氨水中1 min反藍(lán)，伊紅染液中7 min，脫水、透明，中性樹膠封片。

1.6 Masson染色 將石蠟切片分別置于二甲苯和梯度酒精中脫蠟后，置于Boucn’s液固定過(guò)夜。然后，蘇木素中15 min染核，0.5%鹽酸酒精分化30 s，0.2%氨水反藍(lán)30 s，滴加1滴HT151染色15 min，磷酸溶液分化1 min，苯胺藍(lán)染色15 min，脫水、透明，中性樹膠封片。

1.7 RNA提取 在含有TRIzol的離心管中將心臟組織剪碎后，勻漿機(jī)6 500 r/min，勻漿30 s，將勻漿混合液轉(zhuǎn)入新的EP管中，加入400 μl三氯甲烷，劇烈混勻后，4℃下12 000 r/min離心 15 min；分離上層水相中的RNA至新的EP管中后，按照 1∶1比例，加入異丙醇。輕微上下顛倒。室溫靜置15 min，4℃下12 000 r/min離心15 min，棄上清；加入1 ml預(yù)冷的75%乙醇重懸沉淀；4℃下12 000 r/min離心15 min，小心棄上清；加入適量DEPC水溶解RNA。樣品總RNA利用NanoDrop ND-2000(Thermo Scientific)定量并經(jīng)Agilent Bioanalyzer 2100(Agilent Technologies)檢測(cè)RNA完整性。

1.8 芯片分析 Agilent Mouse ceRNA Microarray 2019(4×180 K，Design ID：086242)芯片實(shí)驗(yàn)以及6個(gè)樣本的數(shù)據(jù)分析在博淼生物進(jìn)行。樣本的標(biāo)記、芯片的雜交以及洗脫參照芯片標(biāo)準(zhǔn)流程。首先，總RNA反轉(zhuǎn)錄成雙鏈cDNA，再進(jìn)一步合成用Cyanine-3-CTP(Cy3)標(biāo)記的cRNA。標(biāo)記好的cRNA和芯片雜交，洗脫后利用Agilent Scanner G2505C(Agilent Technologies)掃描得到原始圖像。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Feature Extraction軟件(version10.7.1.1，Agilent Technologies)處理原始圖像，提取原始數(shù)據(jù)。然后對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行quantile標(biāo)準(zhǔn)化。標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾，用于比較的每組樣本中至少有一組75%的樣本標(biāo)記為Detected的探針留下進(jìn)行后續(xù)分析。用t檢驗(yàn)的P值和倍數(shù)變化值進(jìn)行差異基因篩選，篩選的標(biāo)準(zhǔn)為上調(diào)或者下調(diào)倍數(shù)變化值>2.0且P<0.05，同時(shí)，對(duì)每組差異篩選結(jié)果進(jìn)行散點(diǎn)圖、火山圖(對(duì)應(yīng)有生物學(xué)重復(fù)的分組)和聚類圖繪制。對(duì)差異基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析[10]，以判定差異基因主要影響的生物學(xué)功能或者通路。

2 結(jié)果

2.1 兩組小鼠心功能損傷改善情況比較 干預(yù)3個(gè)月后，心功能檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，達(dá)格列凈干預(yù)組較HFD單獨(dú)喂養(yǎng)組小鼠心功能顯著改善。組織病理學(xué)分析證實(shí)，達(dá)格列凈干預(yù)組較HFD單獨(dú)喂養(yǎng)組小鼠心臟顯著縮小，左心室壁厚度降低。WGA染色證實(shí)，達(dá)格列凈干預(yù)組較HFD單獨(dú)喂養(yǎng)組小鼠心肌橫截面積減少。Masson染色證實(shí)，達(dá)格列凈干預(yù)組較HFD單獨(dú)喂養(yǎng)組小鼠心肌纖維化程度顯著降低。提示達(dá)格列凈可顯著改善小鼠心功能。見圖1。

圖1 兩組小鼠心功能損傷改善情況比較(a.小動(dòng)物心臟超聲；b.心臟左心室射血分?jǐn)?shù)；c.心臟縮短分?jǐn)?shù)；d.心臟大體病理切片HE、WGA和Masson染色)

2.2 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)變異情況分析 分別提取達(dá)格列凈干預(yù)組及HFD單獨(dú)喂養(yǎng)組各3只小鼠心肌組織的mRNA，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)芯片分析。首先，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的變異情況檢測(cè)。本次檢測(cè)結(jié)果中平均CV值為4.724 7，最大CV值為7.013 4，低于15%的CV值要求，提示芯片實(shí)驗(yàn)成功。

2.3 樣本相關(guān)性與主成分分析 應(yīng)用Pearson Correlation檢驗(yàn)方法評(píng)價(jià)樣本間相關(guān)性結(jié)果。利用基因的表達(dá)量進(jìn)行主成分分析(principal component analysis，PCA)，觀察樣本的分布情況，對(duì)樣本間的關(guān)系和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行驗(yàn)證，從不同維度展現(xiàn)樣本間的關(guān)系。相關(guān)性和PCA提示，兩組樣本主成分差異顯著，各樣本組間具有很好的相關(guān)性。見圖2。

圖2 樣本間相關(guān)關(guān)系與PCA(a.Pearson Correlation檢驗(yàn)方法評(píng)價(jià)樣本間相關(guān)性；b.樣本PCA)

2.4 差異mRNA表達(dá)情況分析 根據(jù)分組情況對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾并根據(jù)對(duì)應(yīng)的閾值(差異倍數(shù)>2.0，P<0.05)進(jìn)行差異篩選，達(dá)格列凈干預(yù)組小鼠心肌組織中共獲得71個(gè)差異表達(dá)顯著基因，其中，上調(diào)表達(dá)23個(gè)，下調(diào)表達(dá)48個(gè)。進(jìn)一步利用火山圖和散點(diǎn)圖進(jìn)行獲得的差異表達(dá)基因的分布情況分析，結(jié)果同統(tǒng)計(jì)分析熱圖結(jié)果一致。見圖3。

圖3 差異表達(dá)基因分析(a.差異表達(dá)基因分析；b.火山圖分析；c.散點(diǎn)圖分析)

2.5 mRNA差異表達(dá)基因的富集通路分析 GO富集分析軟件證實(shí)，細(xì)胞漿膜蛋白和細(xì)胞連接蛋白在兩組心臟組織中存在顯著差異。同時(shí)，細(xì)胞-細(xì)胞連接，漿膜固有成分、I-kB/NF-kB炎癥信號(hào)通路和Toll-樣細(xì)胞受體通路，是改變較為顯著的細(xì)胞生物學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(圖4)。KEGG富集軟件分析發(fā)現(xiàn)，炎癥反應(yīng)通路，Toll-樣細(xì)胞受體通路和PPAR通路存在明顯的表達(dá)差異(圖5)。兩項(xiàng)分析結(jié)果均提示，達(dá)格列凈干預(yù)可能通過(guò)心肌細(xì)胞膜受體作用于其抗炎調(diào)控通路，發(fā)揮改善心功能的作用，而細(xì)胞連接信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的改變也提示其作用受體有可能是細(xì)胞連接受體或分子。

圖4 GO Term分析差異表達(dá)基因的細(xì)胞學(xué)組分、生物學(xué)功能和生物活動(dòng)過(guò)程 圖5 KEGG分析差異表達(dá)基因主要調(diào)控的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

3 討論

本研究應(yīng)用經(jīng)典的Ⅱ型糖尿病小鼠模型，闡明了達(dá)格列凈在改善Ⅱ型糖尿病引起的心肌損傷和心功能異常中的差異表達(dá)基因及其可能的互作調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，這為深入闡明達(dá)格列凈干預(yù)心肌損傷的作用機(jī)制研究奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與HFD單獨(dú)喂養(yǎng)組比較，達(dá)格列凈干預(yù)組小鼠的心臟超聲指標(biāo)(左心室射血分?jǐn)?shù)和縮短分?jǐn)?shù))均顯著升高，心肌肥大和心肌纖維化現(xiàn)象也明顯受到抑制，提示達(dá)格列凈干預(yù)有效的改善了HFD誘導(dǎo)的Ⅱ型糖尿病小鼠的心功能損傷。同時(shí)，應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析顯示，與HFD單獨(dú)喂養(yǎng)組比較，達(dá)格列凈干預(yù)組小鼠心肌組織中共獲得71個(gè)差異表達(dá)顯著基因，其中，上調(diào)表達(dá)23個(gè)，下調(diào)表達(dá)48個(gè)。并且，通過(guò)GO分析和KEGG分析均發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞漿膜蛋白和細(xì)胞連接蛋白在兩種細(xì)胞中存在顯著差異。同時(shí)，細(xì)胞-細(xì)胞連接，漿膜固有成分、I-kB/NF-kB炎癥信號(hào)通路、Toll-樣細(xì)胞受體通路和PPAR細(xì)胞信號(hào)通路，是改變最為顯著的細(xì)胞生物學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。達(dá)格列凈作為SGLT2受體的小分子抑制劑，主要通過(guò)抑制葡萄糖和鈉離子的轉(zhuǎn)運(yùn)，改善血糖，減少血容量。但其直接對(duì)于心肌細(xì)胞保護(hù)的作用機(jī)制尚不清晰。本研究結(jié)果證實(shí)，達(dá)格列凈干預(yù)可能通過(guò)其他相關(guān)膜受體直接影響了心肌組織的I-kB/NF-kB炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和Toll-樣受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而通過(guò)抑制炎癥和免疫細(xì)胞調(diào)控，改善心肌存活能力，從而改善心功能。

Toll-樣受體可識(shí)別不同的病原體相關(guān)分子模式，并在先天性免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，且在炎癥、免疫細(xì)胞調(diào)控、細(xì)胞存活和增殖方面起著關(guān)鍵調(diào)控作用[11]。Toll-樣受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活來(lái)源于細(xì)胞漿Toll/IL-1受體(TIR)的結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域與接頭蛋白MyD88發(fā)生相互作用。經(jīng)過(guò)配體的刺激，MyD88將IL-1受體相關(guān)激酶-4吸引到Toll-樣受體，進(jìn)一步激活I(lǐng)KK復(fù)合體并導(dǎo)致MAP激酶(JNK，p38 MAPK)和NF-κB的激活[12]。PPAR是由脂肪酸及其衍生物激活的核激素受體，屬于核激素受體家族中的配體激活受體[13-14]，同其他核受體超家族一樣，是一類配體依賴的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，控制許多細(xì)胞內(nèi)的代謝過(guò)程，維持代謝穩(wěn)態(tài)和炎癥基因的表達(dá)[15]。

綜上所述，達(dá)格列凈改善糖尿病心肌損傷是通過(guò)抑制炎癥分子和上調(diào)Toll樣受體相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路實(shí)現(xiàn)的。進(jìn)一步通過(guò)細(xì)胞和動(dòng)物模型研究進(jìn)行達(dá)格列凈調(diào)控研究的驗(yàn)證，將有希望深入闡明其對(duì)心肌細(xì)胞保護(hù)的調(diào)控作用，為更多的保護(hù)靶點(diǎn)研究提供有力的實(shí)驗(yàn)研究支持。