胡淑青 李獻(xiàn)鋒 魏霜 丁鈿

摘要 介紹了我國口岸進(jìn)口木材中多次截獲的松十二齒小蠹，對該蟲的分類地位、分布、寄主、危害及成蟲形態(tài)特征進(jìn)行了描述。將獲得的該蟲COⅠ序列通過GenBank數(shù)據(jù)庫比對分析，以及用鄰接法（NJ）構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹，建立了該蟲的DNA條形碼檢測方法，以期為口岸一線的檢測鑒定提供參考。

關(guān)鍵詞 十二齒小蠹;分布;形態(tài)特征;DNA條形碼

中圖分類號 S41-30? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2022）10-0119-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.10.027

Morphological Character and DNA Barcoding Technique Rapid Identification of Ips sexdentatus

HU Shu-qing，LI Xian-feng，WEI Shuang et al （Guangzhou Customs Technology Center，Guangzhou，Guangdong 510623）

Abstract Ips sexdentatus frequently intercepted in imported wood from domestic port was described based on its classification，distribution，host plants，harm，morphological characteristics，etc.COⅠ sequence was blasted with released data in GenBank，and phylogenetic tree based on the Neighbor-Joining Algorithm（NJ） was constructed，and finally DNA barcoding technique indentifying this pest was created，with the hope that it will provide references on inspection and identification of port line.

Key words Ips sexdentatus;Distribution;Morphological characteristics;DNA barcode

作者簡介 胡淑青（1992—），女，廣東廣州人，助理工程師，從事植物檢疫及生物技術(shù)研究。通信作者，農(nóng)藝師，碩士，從事植物檢疫及分子生物學(xué)研究。

收稿日期 2021-04-27

十二齒小蠹[Ips sexdentatus（Boerner，1767）]，又名松十二齒小蠹，是古北區(qū)林業(yè)重要蛀干害蟲，被列入我國林業(yè)危險性有害生物名錄，其主要危害松屬、云杉屬植物等針葉樹[1-2]。近年來，我國口岸多次從進(jìn)境的木材和木質(zhì)包裝中截獲十二齒小蠹活幼蟲和成蟲。筆者介紹了十二齒小蠹的分類地位、分布、寄主和形態(tài)學(xué)特征等，并研究了該蟲的DNA條形碼檢測方法，以期為口岸檢疫鑒定提供參考。

1 名稱與分類地位

學(xué)名：Ips sexdentatus（Boerner，1767）。

異名：Bostrichus pinastri Bechstein，1818;Bostrichus sexdentatus （Boerner，1776）;Bostrichus stenographus Duftschmidt，1825;Bostrycus pinastri Bechstein;Dermestes sexdentatus Borner;Dermestes sexdentatus Borner，1776;Ips sexdentatus junnanicus Sokanovskii，1959;Ips stenographus （Duftschmidt，1825）;Tomicus sexdentatus （Boerner，1776）;Tomicus stenographus （Duftschmidt，1825）;Tomicus stenographus Duftschmidt。

中文名：十二齒小蠹、松十二齒小蠹。

分類地位：鞘翅目Coleoptera，小蠹科Scolytidae，齒小蠹亞科Ipinae，齒小蠹族（Ipini），齒小蠹屬Ips De Geer[1]。

2 分布

國外主要分布于俄羅斯（遠(yuǎn)東及西伯利亞）、白俄羅斯、比利時、土耳其、烏克蘭、南斯拉夫、瑞典、瑞士、塞爾維亞和黑山、斯洛伐克、斯洛文尼亞、愛沙尼亞、奧地利、保加利亞、波蘭、德國、法國、芬蘭、荷蘭、捷克、克羅地亞、拉脫維亞、立陶宛、盧森堡、羅馬尼亞、馬其頓、摩爾多瓦、挪威、葡萄牙、西班牙、希臘、匈牙利、意大利、英國、阿塞拜疆、格魯吉亞、美國、朝鮮、韓國、蒙古、緬甸、日本、泰國、亞美尼亞[3-5]。

國內(nèi)原發(fā)生于黑龍江林區(qū)，目前在吉林、遼寧、新疆、內(nèi)蒙古、陜西、四川、云南等地均有分布[6]。

3 寄主與危害

寄主主要為針葉樹，如高加索冷杉（Abies nordmanniana）、云杉（Picea asperata）、歐洲云杉（Picea excelsa）、魚鱗云杉（Picea jezoensis var.microsperma）、紅皮云杉（Picea koraiensis）、東方云杉（Picea orientalis）、落葉松（Larix gmelinii）、華山松（Pinusarmandii）、高山松（Pinus densata）、思茅松（Pinus kesiya var.langbianensis）、紅松（Pinus koraiensis）、歐洲白皮松（Pinus leucodermis）、黑松（Pinus nigra）、海岸松（Pinus pinaster）、意大利傘松（Pinus pinea）、輻射松（Pinus radiata）、西伯利亞五針?biāo)桑≒inus sibirica）、歐洲赤松（Pinus sylvestris）、樟子松（Pinussylvestris var.mongolica）、油松（Pinus tabulaeformis）、油松（Pinus tabuliformis）、黃山松（Pinus taiwanensis）、云南松（Pinus yunnanensis）等[3-4]。

主要危害風(fēng)倒木、火燒木、衰老、生長勢差的衰弱木，是次期性害蟲的先鋒軍[1-2]。陳輝等[7]研究表明，十二齒小蠹是秦嶺華山松的主要次期性小蠹，能迅速入侵衰弱的寄主華山松，利用寄主樹木樹干基部的營養(yǎng)空間。危害嚴(yán)重時能直接攻擊健康的活立木，曾在法國中部、西班牙和葡萄牙引起遭受干旱影響的歐洲赤松死亡，并在土耳其的東方云杉上暴發(fā)危害[4]。十二齒小蠹危害的坑道狀見圖1。

4 形態(tài)特征

雌雄成蟲形態(tài)、大小相似，體長 5.8～7.5 mm，褐色至黑褐色，頭部、斜面及側(cè)面體被長細(xì)毛[3]。觸角膝狀，錘狀部膨大明顯;復(fù)眼完整，呈腎形;額面有一橫向隆堤，凸起在兩眼之間，堤基寬厚，堤頂狹窄光亮，呈一字形，橫堤與口上片之間有中隆線與橫堤連成“丁”字。下部刻點(diǎn)細(xì)而密，上部刻點(diǎn)粗大疏散。前胸背板無側(cè)緣，正面看前圓后方，呈盾形，長約是寬的1.1 倍，全部背板以縱中線為軸，左右對稱，瘤區(qū)和刻點(diǎn)區(qū)各占背板長度的一半，瘤區(qū)中的顆瘤低平微弱，后部顆瘤扁平，形如鱗片。鞘翅長為前胸背板的1.5 倍，為兩翅合寬的1.6倍，溝間部無點(diǎn)無毛;鞘翅斜面每側(cè)緣上隆起6個齒，前3齒基闊頂尖，呈錐形，其中第2、3 兩齒略大，第1齒稍小，第4齒粗壯挺拔最大，尖端呈紐扣狀（圖2）[4]。

5 DNA條形碼分子檢測方法

5.1 DNA提取、PCR擴(kuò)增及序列分析 取3頭成蟲樣品分別用于DNA提取，分3個反應(yīng)同時進(jìn)行，提取方法參照Qiagen公司基因組DNA提取試劑盒說明書 （DNeasy Blood & Tissue Kit Cat No./ID：69504）。采用從GenBank數(shù)據(jù)庫下載的十二齒小蠹COⅠ基因序列（AF113380.1、KP314288.1）設(shè)計的特異性引物Ips sex_11：5′-AGATTCTGATTACTTCCACCCT-3′和Ips sex_12：5′-GAGAAACTAAGCCAAATCCTG-3′。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性30 s，57 ℃退火

30 s，72 ℃延伸2 min，循環(huán)30次;72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析，將正確條帶的PCR產(chǎn)物送上海生工（Sanggon）進(jìn)行正反雙向測序。測序結(jié)果采用SeqMan軟件進(jìn)行序列校對和拼接，去除兩端引物序列，獲得長度為855 bp的COⅠ條形碼序列（圖 3）。

將序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行相似性比對分析，依據(jù)相似性的高低和形態(tài)近似種屬，將十二齒小蠹、北海齒小蠹（I.amitinus）、 波若混齒小蠹（I.perroti）、刺形齒小蠹 （I.spini-fer）、大體齒小蠹（I.emarginatus）、短喙齒小蠹（I.avulsus）、高山齒小蠹（I.montanus）、混點(diǎn)齒小蠹（I.confusus）、間隔齒小蠹（I.integer）、攪擾齒小蠹（I.perturbatus）、刻紋齒小蠹（I.plas-

tographus）、落葉松齒小蠹（I.cembrae）、美雕齒小蠹（I.cal-ligraphus）、木齒小蠹（I.woodi）、似混齒小蠹（I.paraconfusus）、西南間隔齒小蠹（I.knausi）和亞利桑那齒小蠹（I.lecontei）18種齒小蠹屬COⅠ序列片段下載保存。將所有序列用Clustal X1.83軟件進(jìn)行序列比對，并轉(zhuǎn)換成FASTA格式，再利用MEGA 6.0軟件計算各物種間的遺傳距離，并基于鄰接法（NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。系統(tǒng)發(fā)育樹各分支置信區(qū)間（bootstrap）均進(jìn)行1 000次重復(fù)檢驗(yàn)，以此確定待鑒定昆蟲種類。

5.2 結(jié)果分析

通過Clustal X1.83軟件比對分析上述所得的COⅠ序列，發(fā)現(xiàn)3頭測試樣品的序列完全一致。將COⅠ序列上傳至GenBank中進(jìn)行“Blastn”相似性檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該序列與序列號為KX035215.1十二齒小蠹線粒體基因序列相似度達(dá)99%，覆蓋率達(dá)97%;與AF113380.1的十二齒小蠹COⅠ序列相似度達(dá)99%，覆蓋率達(dá)89%。在NCBI上下載15種齒小蠹屬COⅠ基因序列，并以歐洲榆小蠹（Scolytus multistriatus（KU91237.1））為外群，應(yīng)用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)待測鑒定昆蟲與十二齒小蠹聚為同一分支，其置信度為99%，且與其他齒小蠹屬明顯分開（圖4）。GenBank比對結(jié)果、構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹與形態(tài)學(xué)分類結(jié)果都一致，因此可以判定待鑒定昆蟲為十二齒小蠹。所得的COⅠ序列已上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫，序列登記號為MH260900。

6 討論

小蠹科是重要的森林蛀干害蟲之一，其成蟲和幼蟲蛀食樹皮或木質(zhì)部，危害極其隱蔽，被認(rèn)為是通過國際貿(mào)易傳播最為普遍的一類昆蟲，也是口岸截獲最為普遍的類群之一。我國口岸截獲小蠹的分類鑒定主要是依靠傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類技術(shù)，然而小蠹個體較小，有許多近似種之間形態(tài)特征差異甚微，因此，鑒定人員應(yīng)當(dāng)具備較高的昆蟲分類知識水平和顯微鏡操作技術(shù)。此外，口岸截獲的小蠹蟲很大部分為幼蟲，難于在實(shí)驗(yàn)室條件下飼養(yǎng)成成蟲，僅依靠幼蟲的特征來判定該蟲種類非常困難，這進(jìn)一步加大口岸對截獲小蠹蟲分類鑒定的難度。

近年來，昆蟲DNA條形碼技術(shù)已廣泛應(yīng)用于種類分子鑒定，成為昆蟲分類形態(tài)鑒定的重要補(bǔ)充手段。目前，DNA條形碼技術(shù)已在鱗翅目[8]、半翅目[9]、雙翅目[10-11]、膜翅目[12]、鞘翅目[13]、蜉蝣目[14]、彈尾目[15]、直翅目[16-17]和蜻蜓目[18]等中被證實(shí)可以進(jìn)行物種分類鑒定。此外，Greenstone 等[19]通過對步甲科Carabidae 的卵、幼蟲、蛹與成蟲COⅠ序列比較研究，認(rèn)為可以對未成熟步甲進(jìn)行種間鑒定;Mitchell等[20]結(jié)合DNA條形碼技術(shù)和形態(tài)學(xué)分類，成功對澳大利亞堅(jiān)果植物上的外侵害蟲小蠹蟲亞科的不成熟階段進(jìn)行分類研究，顯示了DNA條形碼技術(shù)在昆蟲卵、幼蟲鑒定時具有的優(yōu)越性。常虹等[21]采用小蠹科通用引物和小蠹科COⅠ序列設(shè)計引物進(jìn)行巢式PCR，獲得包括十二齒小蠹在內(nèi)的11種齒小蠹屬的COⅠ序列。該研究在形態(tài)學(xué)特征的基礎(chǔ)上，結(jié)合DNA條形碼技術(shù)，設(shè)計1對特異性COⅠ引物獲得COⅠ序列，成功鑒定了待鑒定昆蟲，此方法更為簡單、快速、準(zhǔn)確。

目前，十二齒小蠹并未被列為我國重點(diǎn)關(guān)注的檢疫性有害生物名錄，但該蟲僅在我國的幾個省區(qū)有分布，且該蟲是全國口岸截獲頻率較高的小蠹種類之一，據(jù)動植物檢疫信息資源共享服務(wù)平臺統(tǒng)計全國口岸于2010—2021年共截獲181次，分別從烏克蘭、阿根廷、加蓬、法國、立陶宛、美國、德國、菲律賓、加拿大、愛沙尼亞、澳大利亞和英國等國家截獲。其成蟲、幼蟲均可造成危害，且寄主是我國常見松屬、云杉屬植物等針葉樹，分布遍及全國，因此該蟲極易在我國找到適宜的生活環(huán)境，對我國林業(yè)造成嚴(yán)重威脅。因此，建議各監(jiān)管部門應(yīng)加強(qiáng)對該蟲的檢疫力度，研究針對該蟲的檢疫處理措施，防止其進(jìn)一步擴(kuò)散。

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