孫 偉，白 劍，李鳳巖，苗 健，苗蘭英

(1.朝陽(yáng)市第二醫(yī)院胃腸外科，遼寧 朝陽(yáng) 122000；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，沈陽(yáng) 110847；3.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，大連 116021)

大腸癌是一種高發(fā)的消化道腫瘤，臨床上的治療方案以手術(shù)切除配合放化療為主，如病情嚴(yán)重則以主張通過化療提高患者的生活質(zhì)量，延長(zhǎng)生存期[1]。甘草次酸(glycyrrhetinic acid,GA)屬五環(huán)三萜類化合物，其藥理學(xué)活性廣泛，包括抗炎、抗病毒、抗腫瘤和抑制細(xì)菌生長(zhǎng)等[2]。有研究顯示GA在體外可以有效的抑制甲狀腺癌細(xì)胞的增殖，其機(jī)制與抑制AKT/NF-κB信號(hào)通路活性有關(guān)[3]。核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor Kappa-light-chain-enhancer of activated B cells,NF-κB)的異常表達(dá)與多種疾病如大腸癌的發(fā)生密切相關(guān)。炎癥細(xì)胞釋放的趨化因子和細(xì)胞因子可以上調(diào)NF-κB在炎癥組織中的表達(dá)，而NF-κB的上調(diào)可以增加腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視的能力[4]。在小鼠的腸癌模型中也發(fā)現(xiàn)降低腸上皮中的NF-kB表達(dá)可以明顯抑制消化道腫瘤的生長(zhǎng)[5]。因此，本研究通過觀察GA在體外對(duì)大腸癌LoVo細(xì)胞的增殖和侵襲的影響，分析其可能作用途徑，為臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

甘草次酸購(gòu)買于梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司(產(chǎn)品標(biāo)號(hào)：S0988,HPLC≥98%)；四氮唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)、TRIzol和5氟尿嘧啶(5 fluorouracil,5-FU) (產(chǎn)品標(biāo)號(hào)：F6627-5G,HPLC≥99%)購(gòu)買于西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司；大腸癌LoVo細(xì)胞株購(gòu)買于上海碧云天生物技術(shù)有限公司(產(chǎn)品標(biāo)號(hào)：C6519)；DMEM/F-12培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自GBICO公司；Transwell(型號(hào)3422)小室培養(yǎng)板購(gòu)買于美國(guó)康寧公司；Annexin V/PI AAD細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒買于美國(guó)BD公司；α-Tubulin(產(chǎn)品編號(hào)：sc-8035)和NF-kB p-P65(產(chǎn)品編號(hào)：sc-8008)抗體購(gòu)買于Santa Cruz公司；分析純?cè)噭┵?gòu)買于國(guó)藥集團(tuán)北京分公司；；FACSCalibur流式細(xì)胞儀購(gòu)買于美國(guó)BD公司；二氧化碳培養(yǎng)箱購(gòu)買于美國(guó)Thermo公司；550酶標(biāo)儀和垂直系列電泳儀購(gòu)買于美國(guó)伯樂公司。

1.2 大腸癌LoVo細(xì)胞培養(yǎng)和分組[3,6]

將大腸癌LoVo細(xì)胞接種在含10%胎牛血清的DMEM/F-12中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到90%后，將細(xì)胞用0.5%胰酶消化后，接種于6孔板和96孔板內(nèi)。在細(xì)胞融合度達(dá)到70%后將細(xì)胞分為對(duì)照組，GA低、中、高劑量組和5-FU組，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。其中對(duì)照組為不含有血清的DMEM/F-12培養(yǎng)基，GA低、中、高劑量組中GA的濃度分別為50,100,200 μmol/L，5-FU組為濃度100 μmol/L的5-FU。在分組后的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h和48 h后進(jìn)行相關(guān)的檢測(cè)。

1.3 大腸癌LoVo細(xì)胞增殖的檢測(cè)

將接種于96孔板的細(xì)胞用PBS沖洗2次后，加入MTT溶液孵育30 min，用移液器移除液體后，在每孔中加入100 μl的二甲基亞砜，在振蕩儀上搖勻10 min。酶標(biāo)儀在光波長(zhǎng)570 nm 處檢測(cè)光密度值。細(xì)胞增殖率( %) = 干預(yù)組光密度值) /對(duì)照組光密度值× 100%。

1.4 大腸癌LoVo細(xì)胞凋亡的檢測(cè)

將經(jīng)過分組并藥物孵育的大腸癌LoVo細(xì)胞從96孔板消化后分別收集到離心管內(nèi)，用PBS沖洗后在1 100 r/min下離心3 min，重復(fù)上述沖洗過程一次。將經(jīng)過洗滌后的細(xì)胞收集到離心管中，在避光條件下按照Annexin V/PI凋亡檢測(cè)試劑盒說明書操作，并通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率。

1.5 大腸癌LoVo細(xì)胞的侵襲能力的檢測(cè)

將接種于六孔板的大腸癌LoVo細(xì)胞消化后用DMEM/F-12重懸細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)整為5×105cells/ml，在每個(gè)Transwell小室中加入0.2 ml的細(xì)胞混懸液，之后在每孔中加入1 ml不含血清的對(duì)照組，GA低、中、高劑量組和5-FU組的培養(yǎng)基，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。帶培養(yǎng)完畢后，在每孔中加入0.5 ml結(jié)晶紫溶液孵育30 min對(duì)細(xì)胞染色，在顯微鏡下計(jì)數(shù)。

1.6 大腸癌LoVo細(xì)胞中蛋白質(zhì)NF-κB的檢測(cè)

將在6孔板內(nèi)培養(yǎng)48 h各組大腸癌LoVo細(xì)胞用PBS清洗后，加入Trizol裂解，將裂解后的液體收集到1.5 ml EP管中，煮沸5 min使蛋白質(zhì)變性，在 12 000 r/min低溫離心機(jī)中離心1 min。使用BCA法對(duì)蛋白定量，向SDS-PAGE凝膠中加各組蛋白樣品，轉(zhuǎn)PVDF 膜。使用5%脫脂奶粉封閉樣品后，加入稀釋后的一抗NF-κB p-P65 (1∶1 000)和α-Tubulin (1∶1 000)，4℃孵育過夜后，加入二抗在37℃孵育1 h，DAB顯色。通過條帶的灰度值確定蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 GA對(duì)大腸LoVo細(xì)胞增值的影響

經(jīng)過GA和5-FU 孵育12 h后，與對(duì)照組相比，5-FU組中的細(xì)胞增殖率顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；經(jīng)過GA和5-FU 孵育24 h和48 h后，與對(duì)照組相比，GA的中、高劑量組和5-FU組中的細(xì)胞增殖率均顯著低于對(duì)照組(P<0.05，表1)

Tab. 1 Effects of different concentrations ofglycyrrhetinic acid on the ratio of proliferation in colorectal cancer LoVo (%， n=6)

2.2 GA對(duì)大腸LoVo細(xì)胞凋亡的影響

各組細(xì)胞經(jīng)過GA和5-FU孵育48 h后，與對(duì)照組相比，GA中、高劑量組和5-FU組的G0/G1期細(xì)胞比例明顯高于對(duì)照組 (P<0.05)；與對(duì)照組相比，GA低、中、高劑量組和5-FU組的G2/M期細(xì)胞比例明顯低于對(duì)照組的細(xì)胞 (P<0.05，表2)

Tab. 2 Effects of different concentrations of glycyrrhetinic acid on the ratio of apoptosis in Colorectal cancer LoVo after 48 hours of incubation (%， n=6)

2.3 GA對(duì)大腸LoVo細(xì)胞侵襲能力的影響

各組細(xì)胞經(jīng)過GA和5-FU孵育48 h后，與對(duì)照組相比，GA低、中、高劑量組和5-FU組的細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯低于對(duì)照組(P<0.05)。

2.4 GA大腸LoVo細(xì)胞中蛋白質(zhì)NF-κB增殖的影響

各組細(xì)胞經(jīng)過GA和5-FU孵育48 h后，濃度為100 μmol/L和200 μmol/L GA組中NF-κB蛋白表達(dá)的相對(duì)量為分別為(2.28±0.46)和(1.91±0.11)，與對(duì)照組(3.31±0.45)相比有顯著性差異(P<0.05)，且NF-κB的表達(dá)隨著GA濃度增加而逐漸減弱，呈現(xiàn)劑量依賴性(圖1)。

Fig. 1 Expression of NF-κB proteins after colorectal cancer LoVo cells were incubated with different concentrations of glycyrrhetinic acid for 48 h

3 討論

NF-κB中一類關(guān)鍵性的核轉(zhuǎn)錄因子，通常以同源或異源二聚體非活性形式存在于幾乎所有類型細(xì)胞的胞質(zhì)中，NF-κB核轉(zhuǎn)錄因子參與炎癥、腫瘤、細(xì)胞生長(zhǎng)和免疫反應(yīng)等多種疾病的發(fā)展過程，而大腸癌的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)與NF-κB的表達(dá)密切相關(guān)[4]。有研究報(bào)道，NF-κB可以幫助大腸癌逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視，造成腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，如果抑制NF-κB的表達(dá)可以誘導(dǎo)大腸癌細(xì)胞凋亡[7，8]。許多凋亡相關(guān)的調(diào)節(jié)蛋白如p53、TRAIL、Caspase、Survivin、COX-2等均受到NF-κB信號(hào)通路的調(diào)控[9]。因此，如果能有效的抑制NF-κB的表達(dá)，就可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞進(jìn)入凋亡途徑，并最終減少腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。

大腸癌在中醫(yī)術(shù)語(yǔ)“腸覃”和“積聚”的范疇，腸覃乃寒氣客于大腸，濕毒瘀滯，積聚與腹，宜選用益氣固本、清熱解毒的治療方法[10]。甘草是傳統(tǒng)中草藥，具有補(bǔ)脾益氣、解毒緩急的功效。GA作為甘草水解后的有效成分之一具有明確抗腫瘤作用，對(duì)GA體外治療敏感的腫瘤包括胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、甲狀腺癌、胰腺癌、食管癌和部分血液腫瘤[11，12]。本室前期的研究發(fā)現(xiàn)[3]，GA在體外濃度達(dá)到100 μmol/L就可有效的抑制甲狀腺癌細(xì)胞的增殖，抑制效果隨著藥物作用的時(shí)間和濃度的增加呈現(xiàn)一定的時(shí)間和劑量依賴性。因此，本次實(shí)驗(yàn)在選取濃度為100 μmol/L的GA作為中濃度并進(jìn)一步觀察藥物-劑量的關(guān)系。通過大腸癌LoVo細(xì)胞凋亡的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)低濃度的GA能夠明顯增加G0/G1期的細(xì)胞數(shù)量，G2/M期的數(shù)量顯著降低，提示GA可以把大腸癌細(xì)胞阻滯在G0/G1期。有研究顯示cyclin D1蛋白作為細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白在G1期起重要調(diào)節(jié)作用，其在大腸癌組織中均有不同程度的過度表達(dá)，而在對(duì)不同類型腫瘤的研究發(fā)現(xiàn)，GA可以通過抑制cyclin D1的表達(dá)實(shí)現(xiàn)對(duì)大腸癌細(xì)胞增殖的抑制作用[13,14]。由此可見，GA對(duì)大腸癌細(xì)胞增殖的抑制作用和細(xì)胞周期的影響可能與GA通過抑制cyclin D1的表達(dá)有關(guān)。有研究顯示GA可以通過PI3K-Akt-mTOR通路和NF-κB通路抑制胃癌細(xì)胞SGC7901 增殖[11]，通過抑制NF-κB的表達(dá)降低腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲能力。在本次實(shí)驗(yàn)中GA可以抑制大腸癌細(xì)胞中NF-κB的表達(dá)，隨著GA濃度逐漸升高，NF-κB蛋白的表達(dá)逐漸減弱，二者呈現(xiàn)劑量依賴性關(guān)系[4]。

綜上所述，本次研究發(fā)現(xiàn)濃度為100 μmol/L 的GA能抑制大腸癌細(xì)胞增殖，其機(jī)制可能與抑制NF-κB信號(hào)通路有關(guān)，對(duì)于臨床的治療效果尚有待觀察。