汪宗保，王 連，柳奇奇，楊永暉，劉 攀，李斯亮，姚長風

(1.安徽中醫(yī)藥大學康復醫(yī)學院，合肥 230038；2.安徽中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院，合肥 230031；3.上海體育學院運動科學學院，上海 200438)

膝骨關節(jié)炎(knee osteoarthritis，KOA)是一種慢性、退行性和致殘性膝關節(jié)疾病，以關節(jié)軟骨破壞、滑膜炎、關節(jié)周圍結構和軟骨下骨改變?yōu)樘卣?，表現(xiàn)關節(jié)逐漸僵硬、陣發(fā)性疼痛和功能逐漸衰退，嚴重影響患者的日常生活[1]，合理訓練可改善KOA的相關癥狀，振動訓練(vibration exercise，VE)近些年試用于本病的臨床康復治療，表現(xiàn)出有效、安全、舒適、方便、依從性好，易長期堅持。據(jù)報道[2]振動訓練可對KOA患者關節(jié)的骨性結構、軟組織和神經(jīng)功能顯著改善，但作用機制可能存在具體發(fā)揮作用的多種信號通路機制。

JNK(c-Jun N-termianl kinase，JNK)是一種c-Jun氨基末端激酶，在細胞炎癥和凋亡相關基因表達中起重要作用，有報道[3]稱c-Jun n端激酶(JNK)在內(nèi)的絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)可調(diào)節(jié)KOA，其信號在細胞分化、凋亡和增殖中的作用可通過三個保守的酶級聯(lián)激活轉錄因子調(diào)控基因表達。而腫瘤壞死因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)是涉及骨關節(jié)炎的重要轉錄因子，在炎癥發(fā)生中也起著關鍵作用，其抑制效應有望成為KOA治療的一種思路[3]。另有研究[4]表明SOX9與NF-κB有關聯(lián)，它們可以調(diào)節(jié)軟骨形成。SOX9又是軟骨形成的主要調(diào)節(jié)因子，COL2A1的表達在體內(nèi)直接受到SOX9蛋白調(diào)控[5]。

因此，本研究試圖從上述關聯(lián)信號探討不同頻率的振動訓練對早期KOA關節(jié)軟骨細胞凋亡相關蛋白JNK及NF-κB通路表達的影響分析其可能作用機制，為振動訓練影響骨關節(jié)炎軟骨修復完善理論實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

從合肥安徽醫(yī)科大學實驗動物中心購買健康雄性SD大鼠(生產(chǎn)許可證scxk(皖)2017-001)，數(shù)量多于本研究最低要求48只以備用，均為8周齡，體重在(250±25)g，大鼠分籠飼養(yǎng)環(huán)境：安徽中醫(yī)藥大學實驗中心SPF級動物房，動物房溫度設置于22～25℃，濕度設置40%～70%，光照時間滿足12 h/d，食物為國內(nèi)標準嚙齒類動物飼料，飲自來水。

1.2 實驗分組

SD大鼠在動物房標準環(huán)境適應性飼養(yǎng)一周，所有大鼠編號標記，實際使用中隨機數(shù)字表法選出48只條件好的大鼠，隨機分為6組(n=8)：NC組，MC組，GP1(頻率60 Hz)，GP2組(頻率40 Hz)，ZP組(頻率20 Hz)，DP組(頻率10 Hz)，參照以往文獻設置[6,7]。除NC組外，各組均建立膝關節(jié)骨關節(jié)炎模型，6周后造模完成進行振動訓練。

1.3 實驗試劑與儀器

主要試劑：乙醇、三氯甲烷、異丙醇、甲醇(上海蘇懿化學試劑有限公司20180410)，二甲苯(上海蘇懿20180310)，番紅O軟骨染色液(中國索萊寶20171031)，逆轉錄試劑盒(美國Thermo Scientific)，熒光定量PCR試劑盒(Qiagen，中國)，RIPA細胞裂解液(強)(中國碧云天生物技術研究所Beyotime，貨號P0013B)，Western一抗二抗去除液(Beyotime，011918180129)；NF-κB p65(北京中杉金橋，B2317)；JNK(美國Bioworld Technology公司，AA34142)，SOX9(中國博奧森Bioss公司，AG10233229)，ECL超敏發(fā)光試劑盒(美國Thermo公司，SF249607)，SOX9(兔抗大鼠多克隆抗體)(Bioss，AG10233229)，NF-Kbp65(兔抗大鼠多克隆抗體)(Bioss公司，131225W)，JNK(兔抗大鼠多克隆抗體)(Bioworld公司，AA34142)，PVDF膜(Millipore公司，R7JA4305G)，PBS緩沖液粉末(無錫傲銳東源生物科技有限公司，WK172110-1)，蘇木素(BA-4041)、伊紅(BA-4024)(珠海貝索生物技術有限公司，716092、716101)

主要儀器：Y-DC-20電磁振動試驗臺(無錫市翼搏凡環(huán)境試驗設備有限公司)，高速臺式冷凍離心機(安徽嘉文儀器裝備有限公司，JW-3021HR)，電子天平(日本島津AUY120)，石蠟包埋機(孝感亞光醫(yī)用電子技術公司，YB-7LF)，OLYMPUS顯微鏡，徠卡切片機(德國Leica，RM2016)；P-MIDI 3D數(shù)字切片掃描儀(匈牙利)，熒光定量PCR儀(美國Thermo Scientific)，PVDF膜(美國Millipore公司)，VE-186型轉膜儀和電泳儀(Tanon，上海天能)。

1.4 膝骨關節(jié)炎造模方法

按照手術無菌原則，將木瓜蛋白酶、L-半胱氨酸分別與生理鹽水配成2%、0.03 mol/L的濃度，儲存于4℃恒溫冰箱，實驗前4 h放置于室溫。將2%木瓜蛋白酶和0.03 mol/L的L-半胱氨酸以2∶1混勻，靜置0.5 h對大鼠雙后腿的膝關節(jié)腔注射。實驗前麻醉大鼠采用腹腔注射藥物2%的戊巴比妥鈉(40 mg/kg)后，將大鼠仰臥位固定于木板上，剃去大鼠左右膝關節(jié)腔周圍1 cm區(qū)域的腿毛，絡合碘消毒，75%乙醇脫碘。將大鼠膝屈曲，角度以方便注射為宜，髕骨下極可見白色髕腱，在其外緣的膝眼作為注射藥物進針點，先針破皮下后，將注射針頭拐彎再穿刺皮下組織入關節(jié)腔保證有落空感后向髁間窩方向進針，抵達股骨髁后再回撤2 mm，將新配靜置的0.15 ml 2%木瓜蛋白酶溶液和L-半胱氨酸混合液注入雙膝關節(jié)腔。共注射三次，時間分別在第1、4、7日以相同的方案進行，6周后完成相對早期OA造模[8]，該方案為OA藥物造模通用方法之一。

1.5 振動訓練方案

振動訓練在固定的Y-DC-20電磁振動試驗臺上給大鼠設置上下垂直振動模式，訓練組振動每周5 d，每次40 min，參考了持續(xù)4周的運動時間[9]。大鼠采用直立方式：兩前足不著平面，兩后足站立在振動平臺上，平臺上的自制裝置同時可以訓練多只，每只大鼠均為空間較小的圓柱狀間室隔開，模擬人體站立姿勢振動，振幅2～5 mm。實驗結束按上述麻醉取樣雙側后腿股骨，剝離股骨內(nèi)側髁表面關節(jié)軟骨，編號放置-80℃液氮中保存待測；切下股骨外側髁置于甲醛溶液固定。

1.6 HE、番紅O染色及Mankin評分

大鼠膝關節(jié)股骨外側髁經(jīng)4%甲醛溶液固定后，10% EDTA 液脫鈣，梯度酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟過夜，石蠟包埋，4 μm厚度連續(xù)切片，HE染色，中性樹膠封片。番紅O染色入Safranin O stain 內(nèi)浸染1～2 min，蒸餾水洗1 min；分別采用梯度95%、無水酒精脫水，經(jīng)過二甲苯透明，以光學樹脂封固。隨機從切片選取 4～5個區(qū)域攝像顯微鏡觀察軟骨切片的結構，參照Mankin(改良Mankin)軟骨病理評分標準評分。

1.7 RT-qPCR檢測mRNA的表達

收集大鼠股骨內(nèi)側髁關節(jié)軟骨組織勻漿后，Trizol法提取總RNA，根據(jù)反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄成cDNA，以β-actin為內(nèi)參，再以cDNA為模板進行擴增，反應體系為：95℃預變性2 min，95℃變性5 s，60℃退火10 s，共40個循環(huán)。引物序列如表 1。

Tab. 1 Primer sequences of each gene

1.8 Western blot檢測蛋白表達

取各組關節(jié)軟骨組織，勻漿后加入RIPA 裂解液提取總蛋白，BCA試劑盒測定濃度，上樣等質(zhì)量的蛋白，電泳、轉膜、封閉、孵育一抗、4℃過夜、孵育二抗、PBST清洗、ECL顯影，β-actin作為內(nèi)參蛋白計算相對表達量。

1.9 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 振動訓練對大鼠KOA關節(jié)軟骨組織形態(tài)學的影響

建模成功后各組四周的HE染色見圖1。結果顯示：正常對照NC組染色保持均勻，軟骨表面平整，未見破壞，層級結構清晰，軟骨細胞排列整齊，潮線清晰完整；未干預的大鼠膝骨關節(jié)炎MC組關節(jié)軟骨表面粗糙，斷裂，見不規(guī)則軟骨，排列紊亂，潮線不完整；振動訓練各組(GP1、GP2、ZP、DP)失染或淺染，軟骨表面不平整程度不一，細胞數(shù)量相對正常組減少，密度不均一，潮線不連續(xù)或消失情況不同程度存在，但是振動訓練各組之間比較，頻率較低的訓練組軟骨形態(tài)學改善相對較好，10 Hz頻率的DP組(圖1F)形態(tài)學表現(xiàn)最佳。

改良Mankin評分結果(圖2)顯示，各組均顯著高于NC組(P<0.01)；GP1組、GP2組、ZP組、DP組顯著低于MC組(P<0.01)；GP2組、ZP組、DP組顯著低于GP1組(P<0.05，P<0.01，P<0.01)；ZP組、DP組顯著低于高頻GP2組(P<0.05，P<0.01，圖2)。表示Mankin評分在所有造模后及模型訓練各組中的評分均顯著高于NC組，但振動訓練的頻率越低評分表現(xiàn)越低。

2.2 振動訓練對KOA大鼠關節(jié)軟骨JNK、NF-κBp65、SOX9mRNA表達的影響

4周振動訓練后，JNK mRNA表達：與NC組比較，MC、GP1、GP2組顯著升高(P<0.01)；與MC組比較，GP1、GP2、ZP、DP組顯著降低(P<0.01)；與GP1組比較，GP2、ZP、DP組顯著降低(P<0.05，P<0.01，P<0.01)；DP組顯著降低于GP2組(P<0.01)。

NF-κB p65mRNA表達：與NC組比較，MC、GP1、GP2、ZP組顯著升高(P<0.01)；與MC組比較，GP1、GP2、ZP、DP組顯著降低(P<0.01)；與GP1組，GP2、ZP、DP組顯著降低(P<0.01，P<0.05，P<0.01)。SOX9 mRNA表達：與NC組比較，MC、GP1、GP2、ZP、DP組顯著低(P<0.01)；ZP、DP組顯著高于MC、GP1、GP2組(P<0.01)，DP組顯著高于ZP組(P<0.01 ，表2)。

Tab. 2 JNK，NF-κB p65 and SOX9 mRNA levels in knee cartilage of each group rats after 4 weeks of different frequencies VE n=8)

2.3 振動訓練對KOA大鼠關節(jié)軟骨JNK、NF-κB p65、SOX9蛋白表達的影響

4周干預后，JNK蛋白表達水平：MC、GP1、GP2、ZP、DP組顯著高于NC組(P<0.01)；GP1、GP2、ZP、DP組顯著低于MC組(P<0.01)；GP2、ZP、DP組顯著低于GP1組(P<0.01)；ZP、DP組顯著低于GP2組(P<0.05，P<0.01)；DP組顯著低于ZP組(P<0.01)。NF-κB p65蛋白水平：MC、GP1、GP2、ZP、DP組顯著高于NC組(P<0.01)；GP1、GP2、ZP、DP組顯著低于MC組(P<0.01)；GP2、ZP、DP組顯著低于GP1組(P<0.01)；ZP、DP組顯著低于GP2組(P<0.05，P<0.01)；DP組顯著低于ZP組(P<0.01)。SOX9蛋白水平：MC、GP1、GP2、ZP、DP組顯著低于NC組(P<0.01)；GP1、GP2、ZP、DP組顯著高于MC組(P<0.01)；ZP、DP組顯著高于GP1組(P<0.01)，DP組顯著高于GP2、ZP組(P<0.01，表3，圖3)。

Tab. 3 Protein expressions of NF-κB p65，JNK and SOX9 in knee cartilage of each group rats after 4 weeks of different frequencies VE n=8)

Fig.3Protein expression levels of JNK，NF-κB p65 and SOX9 in knee cartilage of each group rats

Fig. 1 HE staining section of knee joints articular cartilage in rats of each group(×300)

Fig. 2 Mankin scores of each group n=8)

3 討論

膝骨關節(jié)炎是一種給社會和家庭帶來沉重負擔的中老年常見疾病。由于關節(jié)軟骨無血管，給藥途徑治療有一定的局限性，而且長期藥物治療可產(chǎn)生副作用，引發(fā)其他器官并發(fā)癥。臨床運動治療可明顯改善膝骨關節(jié)炎的癥狀，緩解疼痛，增強下肢肌力，提高患者日常生活活動能力、生活質(zhì)量。運動療法被認為是KOA二級預防無副作用的有效手段。動物實驗研究表明合適的運動除了對KOA有一定的關節(jié)軟骨修復效應[9]，還有抗炎、抗凋亡[10,11]等作用。魏曉霏等[12]研究早期應用振動訓練可有效改善兔KOA軟骨下骨微結構的異常重構，減輕軟骨損傷。

本研究試圖從JNK和NF-κB信號通路探討不同頻率振動訓練對KOA軟骨的影響闡述其可能的作用機理以完善治療KOA的非藥物干預機制研究，參照以往國內(nèi)外研究方法我們設置低頻10 Hz、中頻20 Hz、高頻40 Hz、高頻60 Hz四種，觀察其效果來推測其作用機制。本研究結果顯示：經(jīng)過四周振動訓練后，軟骨病理形態(tài)學HE可見正常對照NC組染色保持均勻，軟骨表面平整，未見破壞，層級結構清晰，軟骨細胞排列整齊，潮線清晰完整；未干預的大鼠膝骨關節(jié)炎模型MC組關節(jié)軟骨表面粗糙，見軟骨斷裂和不規(guī)則軟骨，排列紊亂，潮線不完整；對KOA振動訓練各組出現(xiàn)不同表現(xiàn)的失染或淺染，軟骨表面不平整程度不一，軟骨細胞數(shù)量稀少，密度不均，潮線不連續(xù)或消失亦有不同程度存在。而不同頻率振動訓練各組之間比較，頻率較低的訓練組軟骨形態(tài)學改善相對積極，10 Hz頻率的DP組(圖1F)形態(tài)學表面平整程度最佳，軟骨Mankin 評分也相應從高頻到低頻振動訓練組呈現(xiàn)遞減趨勢，提示從形態(tài)學上較低頻率振動可表現(xiàn)良好的軟骨修復作用，也反映周而復始的振動應力適當負荷刺激對關節(jié)軟骨代謝的維持是必要的。

本實驗JNK和NF-κB p65蛋白質(zhì)表達結果顯示模型組及其不同頻率干預各組JNK和NF-κB p65蛋白質(zhì)表達量均顯著高于正常對照組，但是，各振動訓練組與骨關節(jié)炎模型組相比：均表現(xiàn)出下降趨勢，其中中頻20 Hz和低頻10 Hz組明顯較低，低頻10 Hz組JNK和NF-κB p65蛋白質(zhì)表達最低。由此表明，振動訓練可以使得JNK和NF-κB p65活性下降，低頻率振動訓練抑制作用明顯。以往Chen等[13]研究發(fā)現(xiàn)跑臺和車輪運動可以降低IL-1b、IL-6和TNF-α的水平，并伴有p-P65、p-JNK和p-IkBa的下降。說明合理運動可減少JNK/NF-κB信號的激活。而JNK信號通路在細胞炎癥和凋亡相關基因表達增加中起到重要作用，通過一定運動刺激來抑制JNK激活是有積極作用的。有研究表明[14]NF-κB可抑制JNK的持續(xù)激活可能會增強某些因子如TNF-α誘導的炎癥反應。作為重要的轉錄因子NF-κB，在軟骨細胞中生理范圍內(nèi)的生物力學信號可以抑制NF-κB的激活和促炎軟骨細胞反應，在炎癥中扮演著關鍵作用，本實驗結果NF-κB p65的抑制提示振動可降低NF-κB信號及其炎癥反應。此外，本研究中所反映軟骨細胞外基質(zhì)II膠原(COL2Al)的調(diào)控因子SOX9通過振動訓練后表現(xiàn)出不同程度的增加，結果表現(xiàn)出所有頻率的振動訓練組顯著高于模型對照組，越低頻率組SOX9蛋白質(zhì)表達量愈高。而Bell 等[15]研究已證實COL2Al是SOX9強有力的靶目標，關節(jié)軟骨基質(zhì)II型膠原COL2A1在體內(nèi)表達直接受SOX9蛋白調(diào)控，并提示COL2A1在軟骨形成過程中的異常調(diào)節(jié)是導致軟骨發(fā)育不良相關骨骼異常的原因之一[16]。

從本研究結果可以看出我們所設置的不同頻率振動訓練具有不同程度抑制JNK、NF-κB和增加SOX9表達作用，相對較低頻率振動訓練在軟骨形態(tài)學上修復效應較好，越低頻率呈現(xiàn)JNK、NF-κB較強抑制和SOX9的較強活性。Rockel等[17]也證明SOX9的活性和軟骨基質(zhì)基因的表達受到NF-κB和RARs共激活的限制，SOX9、NF-κB等之間的串擾(Crosstalk)是協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)軟骨細胞基質(zhì)基因表達的關鍵機制。大量但不完全的證據(jù)表明，在多步驟軟骨形成通路中，復雜的分子網(wǎng)絡控制著SOX9的活性，SOX9分子網(wǎng)絡可能遠比目前所認識到的復雜[18]。

綜上，本研究提示振動訓練對大鼠早期KOA模型關節(jié)軟骨具有一定程度的修復作用、低頻振動訓練軟骨修復效應相對優(yōu)于高頻振動，JNK/NF-κB、SOX9的變化機制可能是軟骨作用的途徑之一：通過抑制JNK/NF-κB信號通路途徑來促進SOX9表達上調(diào)完成。未來研究除繼續(xù)需完善振動作用機制的基礎性研究，還要為更好的高質(zhì)量物理康復療法深入探索最佳的振動方案來達到軟骨優(yōu)化治療效果。