張 媛，盛 蕾，劉小瑋，韋 娟，劉秀娟，張念云，王子藝

(1.南京體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)健康學(xué)院，江蘇 南京 210014；2.上海交通大學(xué)系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)研究院運(yùn)動(dòng)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心，上海 200240；3.無錫惠山康復(fù)醫(yī)院，江蘇 無錫 214100)

我國肥胖人口已位居世界首位[1]。不合理飲食習(xí)慣(膳食結(jié)構(gòu))和不良生活方式(缺乏運(yùn)動(dòng))是導(dǎo)致個(gè)體出現(xiàn)高血壓、高血糖、高血脂和肥胖等疾病的危險(xiǎn)因素。肥胖個(gè)體由于長期攝入熱量過剩，脂肪合成過多并超過肝細(xì)胞的負(fù)荷能力，肝內(nèi)脂肪的分解利用出現(xiàn)障礙，導(dǎo)致肝臟發(fā)生脂質(zhì)沉積[2]。成纖維細(xì)胞生長因子21(fibroblast growth factor 21，F(xiàn)GF21)是具有多種代謝功能的成纖維細(xì)胞生長因子家族中的一員，在調(diào)節(jié)碳水化合物和脂質(zhì)代謝中起關(guān)鍵作用[3]，多項(xiàng)研究表明，F(xiàn)GF21可直接調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，減少肝臟脂質(zhì)積累，被認(rèn)為是治療糖尿病、脂肪肝等代謝并發(fā)癥的一個(gè)新靶點(diǎn)。諸多研究顯示：不同運(yùn)動(dòng)方式可介導(dǎo)肝臟適應(yīng)性改變，阻止體內(nèi)脂肪過量累積，明顯改善肝臟脂質(zhì)代謝紊亂現(xiàn)象[1,4,5]。FGF21在運(yùn)動(dòng)改善肝臟脂肪代謝的過程中發(fā)揮何種作用目前尚不清楚，因此，本研究采用持續(xù)性運(yùn)動(dòng)(continuous exercise training,CT)和高強(qiáng)度間歇運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練(high-intensity interval exercise training,HIIT)兩種運(yùn)動(dòng)方式，探討FGF21參與運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)正常、肥胖大鼠肝臟脂肪代謝的作用機(jī)制，為運(yùn)動(dòng)防治慢病提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)條件

SPF級(jí)4周齡健康雄性Sprague-Dawley大鼠60只，購買于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。所有大鼠在室溫20℃±5℃，相對(duì)濕度50%～60%條件下分籠飼養(yǎng)，自由飲食飲水。普通膳食飼料購買于南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁殖中心，高脂飼料購自Research Diets公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組與肥胖造模

所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將大鼠隨機(jī)分為兩組，普通飼料喂養(yǎng)組(30只)和高脂飼料喂養(yǎng)組(30只)。高脂飼料采用Research Diets 公司45%高脂飼料(貨號(hào)：D12451)，8周喂養(yǎng)后，以空腹條件下高脂飼料喂養(yǎng)大鼠平均體重超過普通飼料喂養(yǎng)大鼠平均體重20%時(shí)為大鼠肥胖造模成功[6]。造模成功后，將普通飼料喂養(yǎng)的正常鼠和高脂飼料喂養(yǎng)的肥胖大鼠隨機(jī)分為正常安靜組(LC)、正常高強(qiáng)度間歇運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組(LHI)、正常持續(xù)性運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組(LCT)、肥胖安靜組(OC)、肥胖高強(qiáng)度間歇運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組(OHI)及肥胖持續(xù)性運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組(OCT)，每組10只，肥胖大鼠繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)。喂養(yǎng)過程中及時(shí)記錄大鼠進(jìn)食、飲水及生長情況，每周固定時(shí)間稱測體重并記錄。

1.3 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練方案

運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組大鼠進(jìn)行為期8周負(fù)重游泳運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練干預(yù)，玻璃泳池寬0.5 m、高0.6 m，水溫31℃±1℃，每周訓(xùn)練5次，負(fù)重游泳采用大鼠尾部負(fù)重，按照標(biāo)準(zhǔn)稱取一定重量金屬片裝在氣球中系于尾部。CT組每天訓(xùn)練1次，每次30～60 min，HIIT組前4周每天訓(xùn)練5組，每組1 min，后4周每天訓(xùn)練14組，每組20 s，具體方案詳見表1[7]。5-6周HIIT組負(fù)重超過體重10%，運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度大，持續(xù)時(shí)間短，大鼠能夠完成訓(xùn)練方案。游泳過程中，若大鼠出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性下降，反復(fù)下沉?xí)r，即刻撈出休息30 s，若大鼠在游泳過程中漂浮于水面不積極游動(dòng)，則進(jìn)行適當(dāng)驅(qū)趕，以保證其運(yùn)動(dòng)質(zhì)量。運(yùn)動(dòng)干預(yù)過程中，每天觀察大鼠運(yùn)動(dòng)能力，恢復(fù)狀況，檢查身體是否帶傷并做及時(shí)記錄。

Tab. 1 High intensity interval training and continuous training protocol

1.4 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本取樣

8周運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練干預(yù)結(jié)束，各組大鼠禁食24 h后按30 mg/kg體重腹腔注射0.5%戊巴比妥鈉麻醉,腹主動(dòng)脈取血，裝入采血管靜置30 min后3 000 r/min離心5 min，上清即為血清，吸取血清轉(zhuǎn)至凍存管-80℃凍存。斷頭處死，隨后取新鮮肝臟放至生理鹽水中潤洗后稱重，小心取肝組織，包裹OCT置于液氮速凍制作冰凍切片，剩余肝臟組織凍存管分裝立即置于液氮速凍，后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存待后續(xù)Western blot檢測。

1.5 HE與油紅O染色檢測肝細(xì)胞形態(tài)及脂質(zhì)含量

HE染色：1)取新鮮肝臟組織4%多聚甲醛固定并包埋，制作石蠟切片；2)切片下行梯度乙醇脫蠟，蘇木精與伊紅染色，樹膠封片；3)鏡下采集視野。油紅O染色：1)新鮮肝臟組織OCT包裹后制作冰凍切片；2)切片入油紅染液浸染，75%酒精稍分化，蒸餾水洗；3)蘇木精復(fù)染,鹽酸酒精快速分化1 s，蒸餾水洗；4)氨水水溶液返藍(lán),蒸餾水洗；5)甘油明膠封片,顯微鏡鏡檢。圖像采集分析,其中脂滴呈橘紅色至鮮紅色，細(xì)胞質(zhì)為紫色，細(xì)胞核藍(lán)色。

1.6 采用GPO-PAP法測定肝臟TG含量

各組大鼠取定量肝臟組織充分勻漿，無水乙醇提取勻漿介質(zhì)，酶標(biāo)儀測定吸光(OD)值，代入公式計(jì)算。

1.7 血清炎癥因子、FGF21及肝臟脂代謝酶含量檢測

采用ELISA法檢測血清MCP-1、IL-1β、TNF-α及FGF21含量，檢測肝臟組織LPL、FAT/CD36、CPT-1α、β-HAD酶含量。

1.8 Western blot法檢測肝臟組織FGF21蛋白含量

1)肝臟組織蛋白提??；2)SDS-PAGE凝膠電泳配膠；3)上樣；4)電泳；5)100 mv恒壓轉(zhuǎn)膜；6)5%脫脂奶粉封閉；7)4℃孵育一抗FGF21(1∶1 000，美國Abcam公司)、GAPDH(1∶5 000，美國proteintech公司)過夜；8)洗膜；9)二抗室溫孵育60 min；10)洗膜；11)凝膠成像；12)Image Lab Software 5.2分析成像結(jié)果。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體重變化

與正常大鼠相比，肥胖大鼠體重在8周干預(yù)期內(nèi)均顯著增高。8周HIIT和CT干預(yù)后，與LC組相比，LHI、LCT組體重顯著降低(P<0.05)。與OC組比較，OHI、OCT組體重顯著降低(P<0.01)，其中HIIT組體重降低幅度更大(表2)。

Tab. 2 Changes of body weight in rats ( g, n=10)

2.2 各組大鼠血清炎癥因子含量

肝指數(shù)結(jié)果顯示，與LC組相比，OC組肝指數(shù)顯著增高(P<0.05)，OHI與OCT組肝指數(shù)在運(yùn)動(dòng)干預(yù)后顯著降低(P<0.05)。與正常大鼠相比，肥胖大鼠血清中炎癥因子MCP-1、IL-1β、TNF-α的含量顯著增高，經(jīng)過8周HIIT和CT干預(yù)后均顯著降低(P<0.05)，而8周運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練干預(yù)對(duì)正常大鼠血清中MCP-1、IL-1β、TNF-α的含量無顯著影響(表3)。

2.3 各組大鼠肝臟組織脂質(zhì)含量

肥胖大鼠肝臟組織HE染色較正常大鼠出現(xiàn)明顯脂肪變形，細(xì)胞核形態(tài)異常，肝臟甘油三酯(TG)含量顯著增高。油紅染色顯示，肥胖大鼠肝臟組織脂滴面積百分比較正常大鼠顯著增加(P<0.05，圖1，表4)。8周運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練干預(yù)后，肥胖大鼠肝臟結(jié)構(gòu)和組織學(xué)形態(tài)發(fā)生明顯改善，TG含量及油紅染色結(jié)果表明HIIT運(yùn)動(dòng)方式干預(yù)效果更加顯著，其中肝組織TG含量LHI組與LC組相比下降35.8%，OHI組與OC組相比下降21.8%(表4)。

Tab. 3 The serum levels of MCP-1,IL-1β and TNF-α in rats of each group

Fig. 1 Oil red O staining of liver tissues in rats of each group(×400)

Tab. 4 Changes of liver Triglyceride content and fat droplet area by Oil red O staining in rats of each group n=8)

2.4 各組大鼠肝臟脂代謝酶含量

肥胖大鼠肝臟LPL、FAT/CD36酶含量較正常大鼠無顯著變化，CT干預(yù)可提高正常、肥胖大鼠LPL、FAT/CD36酶含量。8周HIIT干預(yù)使正常、肥胖大鼠肝臟組織CPT-1α、β-HAD酶含量均顯著增高，而CT干預(yù)對(duì)其調(diào)節(jié)無顯著影響(表5)。

Tab. 5 Changes of liver lipid metabolic enzymes activity in rats of each group (U/g protein，

2.5 各組大鼠血清與肝臟FGF21水平

與正常大鼠相比，肥胖大鼠血清FGF21水平顯著增高(表6)，肝臟FGF21蛋白含量顯著下降(圖2，表6)，8周運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練干預(yù)使正常、肥胖大鼠血清、肝臟FGF21水平均增高，其中CT對(duì)肝臟FGF21蛋白含量的影響比HIIT顯著(表6)。

Fig. 2 FGF21 relative protein amount changes in liver tissue of each group

Tab. 6 Changes of serum FGF21 level and liver FGF21 protein content in rats of each group n=8)

3 討論

眾所周知運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練是降低肥胖個(gè)體體重的有效方式之一。持續(xù)性訓(xùn)練(CT)是較傳統(tǒng)的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練方式，其可改變身體成分，提高心肺功能，降低血脂及胰島素抵抗水平[8]，然而，近些年高強(qiáng)度間歇訓(xùn)練(HIIT)逐漸備受關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，與CT相比，HIIT在代謝、心血管功能改善方面效果更佳，6周間歇性運(yùn)動(dòng)對(duì)肥胖大鼠體成分產(chǎn)生了良好的干預(yù)效果，且短時(shí)間高頻率間歇性運(yùn)動(dòng)效果可能更好[9-11]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)CT對(duì)正常大鼠體重的影響較為顯著，而HIIT對(duì)降低肥胖大鼠體重的效果更加明顯。

研究證實(shí)超重和肥胖均是一種促炎癥狀態(tài)[12]：Selvaraju等人就正常體重和超重/肥胖兒童唾液肥胖標(biāo)志物的水平與肥胖的關(guān)系以及這些標(biāo)志物之間的相互關(guān)系進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)超重或肥胖個(gè)體唾液中MCP-1、TNF-α、IL-6、CRP水平均顯著增高，而運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可促進(jìn)骨骼肌分泌IL-6，進(jìn)而刺激血液循環(huán)中抗炎癥因子IL-1、IL-10增加，抑制促炎細(xì)胞因子TNF-α的生成[13]。本研究發(fā)現(xiàn)：與正常大鼠相比肥胖大鼠血清中炎癥因子MCP-1、IL-1β、TNF-α的含量均顯著增高，說明肥胖與炎癥反應(yīng)具有較高的相關(guān)性，CT與HIIT均可顯著降低肥胖大鼠血清炎癥因子MCP-1、IL-1β、TNF-α的含量，其中CT的抗炎效果比HIIT更加顯著，同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)不同運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練方式對(duì)正常大鼠血清炎癥因子水平無影響，可能由于正常大鼠機(jī)體炎癥反應(yīng)水平較低所致。

高脂膳食顯著增加機(jī)體體重的同時(shí)常常會(huì)伴隨肝臟組織脂質(zhì)代謝異常，致使脂肪異位沉積，誘發(fā)非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)[14,15]。盧漫漫等人研究亦顯示有氧運(yùn)動(dòng)可顯著改善肥胖小鼠肝臟脂肪堆積及代謝紊亂[16]。高強(qiáng)度間歇性訓(xùn)練使肝內(nèi)TG含量下降27%，同時(shí)降低機(jī)體脂肪含量及血清ALT、ASL水平。本研究發(fā)現(xiàn)與傳統(tǒng)CT相比，HIIT對(duì)緩解肝臟脂肪沉積的干預(yù)效果更佳。研究表明：與正常個(gè)體相比，NAFLD患者肝臟和骨骼肌中脂肪酸轉(zhuǎn)位酶CD36(FAT/CD36)蛋白表達(dá)水平顯著增高[17]。脂蛋白脂肪酶(LPL)與FAT/CD36活性可調(diào)節(jié)循環(huán)脂肪酸代謝水平，本研究得出：與正常大鼠相比，肥胖大鼠LPL、FAT/CD36酶含量顯著增高，CT運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)正常、肥胖大鼠LPL及FAT/CD36酶含量影響較顯著，而HIIT對(duì)LPL及FAT/CD36酶含量無顯著影響，可能是由于CT運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度較低，對(duì)脂肪代謝的依賴性更高，因此對(duì)循環(huán)脂肪酸代謝水平調(diào)節(jié)作用顯著。另一方面，Astorino等人報(bào)道HIIT可顯著提高機(jī)體脂肪氧化水平，同時(shí)伴隨羥酰輔酶A脫氫酶(β-HAD)、檸檬酸合成酶(CS)含量顯著增高[17]。與其研究結(jié)果一致，本研究同樣發(fā)現(xiàn)HIIT干預(yù)顯著影響大鼠肝臟線粒體脂肪氧化酶含量，這與HIIT供能方式有關(guān)，即HIIT更依賴于糖代謝，血液循環(huán)中高水平脂肪酸輸入肝臟較多，肝臟線粒體功能及脂肪酸氧化酶含量的提高促進(jìn)肝臟脂質(zhì)沉積的進(jìn)一步改善[18,19]。

FGF21是成纖維細(xì)胞生長因子家族中特殊的一員，近期報(bào)道，F(xiàn)GF21是首個(gè)被發(fā)現(xiàn)的線粒體功能受損標(biāo)志性因子，線粒體功能抑制將誘導(dǎo)活化轉(zhuǎn)錄因子4(activating transcription factor 4,ATF4)依賴性FGF21表達(dá)，從而改善飲食誘導(dǎo)的小鼠肥胖和胰島素抵抗現(xiàn)象[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常大鼠相比，肥胖大鼠血清FGF21水平顯著增高，而肝臟組織FGF21蛋白表達(dá)水平顯著下降。與安靜組大鼠相比，CT干預(yù)后使正常、肥胖大鼠血清、肝臟FGF21水平均顯著增高，而HIIT對(duì)正常大鼠血清FGF21水平無顯著影響。提示：不同運(yùn)動(dòng)方式均可上調(diào)肝臟FGF21表達(dá)水平，肥胖大鼠血清高水平FGF21為體內(nèi)異常糖脂代謝產(chǎn)生的代償效應(yīng)，CT干預(yù)提高肥胖大鼠血清FGF21水平可作用于循環(huán)脂肪酸代謝，可能與提高周圍組織對(duì)FGF21的敏感性有關(guān)。

綜上所述，HIIT與CT兩種運(yùn)動(dòng)方式均可緩解肥胖大鼠肝臟脂質(zhì)沉積，但作用特點(diǎn)存在差異：HIIT使線粒體脂肪氧化酶含量顯著提高，促進(jìn)肝內(nèi)TG氧化分解，對(duì)緩解肥胖大鼠肝臟脂質(zhì)沉積效果顯著，而CT可通過對(duì)血清、肝臟組織FGF21水平調(diào)節(jié)，增加參與肝臟攝取脂肪酸相關(guān)酶含量，對(duì)緩解肥胖大鼠肝臟脂質(zhì)沉積效果有限。