董 媛，于鴻緒，陳國良，鮑東博，崔嘉芮，3，劉 磊，王會巖，4

（1.吉林醫(yī)藥學院檢驗學院，吉林 132013；2.動物疫病預防控制中心，吉林 136600；3.吉林農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，長春 130700；4.吉林醫(yī)藥學院抗體工程科技協(xié)同創(chuàng)新中心，吉林 132013）

妊娠相關糖蛋白（pregnancy-associated glycoprotein，PAG）隸屬于天冬氨酸蛋白酶家族[1]，最初是在妊娠后母牛的胎盤中作為母體血液中的妊娠特異性抗原而被發(fā)現(xiàn)的。目前已從牛胎盤中克隆出21個不同的牛妊娠相關糖蛋白（bovine pregnancy-associated glycoproteins，BoPAGs） cDNA，核苷酸序列差異在5%[2]，不同BoPAGs的表達存在時空差異，如BoPAG1、BoPAG9和BoPAG21僅在滋養(yǎng)外胚層的雙核細胞中表達，BoPAG2、BoPAG8、BoPAG10、BoPAG11和BoPAG12則在整個滋養(yǎng)外胚層細胞中產(chǎn)生[3]。BoPAGs基因編碼375～389個氨基酸（少數(shù)為258～342個氨基酸）的多肽鏈，結(jié)構(gòu)上與胃蛋白酶、凝乳酶等有50%的相似性，但因催化中心關鍵氨基酸突變，導致大多數(shù)BoPAGs失去了蛋白水解活性[4]。相對于傳統(tǒng)的妊娠診斷方法，BoPAGs作為一種妊娠動物體液中能檢測出的特異性蛋白，因具有檢出率高、對檢測設備和方法要求不高等優(yōu)點而倍受人們的關注[5]。Frickep等[6]研究發(fā)現(xiàn)，在妊娠21 d左右的母牛血液中能夠檢測到BoPAGs，分娩時達到高峰，受精27 d后的檢測準確率達到93.7%，比超聲診斷法提前了幾天，這有利于及早且準確地診斷牛的妊娠狀況，縮短出欄時間，降低養(yǎng)殖成本。目前對于BoPAGs的功能研究較少，推測其在胎盤-子宮界面潛在生長因子的生化處理中起作用，同時參與了胎盤的發(fā)生、胎兒生長、母嬰物質(zhì)傳遞等[7]，但PAG在維持妊娠時發(fā)揮的具體功能尚不清楚。限制BoPAGs研究的主要原因就是天然的BoPAGs濃度低、種類繁多，難于純化。通常多采用磷酸鉀緩沖液提取、飽和硫酸銨沉淀、離子交換層析等傳統(tǒng)方法從母畜胎盤子葉中分離純化天然PAG蛋白，但步驟繁瑣復雜，且大多數(shù)PAGs蛋白不穩(wěn)定，在純化過程中稍有不慎容易導致蛋白降解[8]。此外，成熟的BoPAGs要經(jīng)過糖基化等修飾過程，導致與BoPAGs前體差異較大[9]，所以人們常采用重組表達的方式獲得BoPAGs蛋白。早期妊娠檢測蛋白主要有PAG1、PAG4、PAG6、PAG9、PAG16、PAG18、PAG19等，目前BoPAG1[10-11]、BoPAG2[12]、BoPAG6[13]、BoPAG4[14]、BoPAG7、BoPAG8[15]、BoPAG9[16-17]和BoPAG16[18]表達載體的構(gòu)建已有報道，如楊亞軍等[12，15]先對PAG的密碼子進行了優(yōu)化，后通過基因工程技術(shù)獲得了高表達的PAG2、PAG7和PAG8蛋白，并分析了其生物信息學特征；劉長彬等[10，17-18]在中國倉鼠卵巢細胞中瞬時轉(zhuǎn)染并成功表達了PAG1、PAG9和PAG16蛋白；而BoPAG19蛋白的研究鮮見報道。鑒于此，本研究選取BoPAG19作為研究對象，通過其氨基酸序列體外合成核苷酸序列，用常規(guī)PCR獲得目的片段，構(gòu)建pcMV3-BoPAG19真核表達載體，并在真核細胞HEK-293F中誘導表達并純化重組BoPAG19蛋白，分析其生物信息學特征，以期為研究BoPAG19的生物學功能和研發(fā)新的早期妊娠診斷方法奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株和載體 pcMV3-Entry Vector和大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞均購自上海易匯生物科技有限公司；人胚腎細胞HEK-293F購自上海弘順生物科技有限公司。

1.1.2 主要試劑及儀器 質(zhì)粒小提試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準、DL2000 DNA Marker、DL10000 DNA Marker和無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒均購自北京冬璞泰和科技有限責任公司；Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染試劑購自北京明陽科華生物科技有限公司；T4 DNA連接酶、KpnⅠ和XbaⅠ限制性內(nèi)切酶均購自北京NEB生物科技有限公司；細胞基礎培養(yǎng)基和血清均購自北京同立海源生物科技有限公司。

組氨酸標簽蛋白純化磁珠和磁性分離器均購自蘇州海貍生物醫(yī)學工程有限公司;JL-PZY96BT型PCR擴增儀購自上海靳瀾儀器制造有限公司；D180-P型CO2培養(yǎng)箱購自深圳市瑞沃德生命科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 pcMV3-BoPAG19重組質(zhì)粒的構(gòu)建 在GenBank數(shù)據(jù)庫中查找BoPAG19基因序列（NM_176628），于5′-端加入KpnⅠ酶切位點，去掉原有信號肽序列加入增強分泌型信號肽和Kozak序列；于3′-端加入6個His序列和XbaⅠ酶切位點，質(zhì)粒圖譜見圖1。BoPAG19基因由南京金斯瑞基因公司合成。針對合成基因序列，利用Primer Premier 5.0軟件設計引物，引物序列為：上游引物：5′-GCCGCCACCAAGCTTGGTACCATGAAGTG-GCTGGTGGTGC-3′;下游引物：5′-TCGGCGGCC-GCTCTAGATTTAATGGTGATGATGGTGGTG-ATGGTGG-3′。引物由南京金斯瑞基因公司合成。

圖1 pcMV3-BoPAG19載體構(gòu)建圖Fig.1 Construction diagram of pcMV3-BoPAG19 vector

PCR反應體系25 μL：10×ExTaqBuffer 2.5 μL，dNTP Mix 1 μL，引物各0.5 μL，模板0.5 μL，ExTaq酶0.5 μL，ddH2O 19.5 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，對鑒定正確的PCR產(chǎn)物與pcMV3表達載體進行雙酶切。 雙酶切反應體系10 μL：目的片段/載體8 μL，KpnⅠ酶0.5 μL，XbaⅠ酶0.5 μL，10×Buffer 1 μL。膠回收雙酶切產(chǎn)物，T4 DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，涂板，37 ℃倒置培養(yǎng)。

1.2.2 pcMV3-BoPAG19重組質(zhì)粒鑒定 挑取單菌落，接種于LB培養(yǎng)基，37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，提取質(zhì)粒進行雙酶切驗證，雙酶切反應體系10 μL：質(zhì)粒8 μL，KpnⅠ酶0.5 μL，XbaⅠ酶0.5 μL，10×Buffer 1 μL。37 ℃酶切1 h，酶切產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。采用無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒進行質(zhì)粒的大量提取，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 pcMV3-BoPAG19瞬時轉(zhuǎn)染及表達 37 ℃復蘇HEK-293F細胞，800 r/min離心5 min，棄上清，加30 mL無血清培養(yǎng)基重懸，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中175 r/min振蕩培養(yǎng)約18 h；當細胞密度達到1×104/mL、細胞匯合度>95%時，以0.5×104/mL密度進行傳代；當細胞密度再次達到3.0×106/mL時進行轉(zhuǎn)染。取30 μg pcMV3-BoPAG19重組質(zhì)粒與120 μL Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染試劑混合，室溫靜置15 min，緩慢滴加到細胞中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中175 r/min振蕩培養(yǎng)，18～22 h后加入5%補料培養(yǎng)基Transpro feed 1。當細胞匯合度<60%時停止培養(yǎng)（6 d），收集培養(yǎng)物并離心，取上清備用。

1.2.4 BoPAG19重組蛋白純化 將收集到的10 mL HEK-293F細胞上清，12 000 r/min離心30 min，備用。根據(jù)磁珠使用說明，取10 mL磁珠懸液置于15 mL離心管中，置于磁性分離器上進行磁性分離，棄上清；將離心后的細胞上清加入含有磁珠的離心管中，4 ℃旋轉(zhuǎn)混合1 h，置于磁性分離器上進行磁性分離，棄上清；向磁珠中加入10 mL Washing Buffer（PBS緩沖液，pH 7.4）洗滌2次，再次磁性分離，分別采用20、100和200 mmol/L咪唑的Elution Buffer（2 mL）洗脫磁珠，磁性分離后，收集洗脫液；采用截留分子質(zhì)量為10 ku的超濾管將洗脫液濃縮50倍，SDS-PAGE和Western blotting法鑒定純化蛋白，并通過BCA法測定純化后的蛋白濃度[14]。

1.2.5 結(jié)構(gòu)和功能預測分析 通過ProtParam在線軟件（https:∥web.expasy.org/protparam/）預測BoPAG19蛋白的理化性質(zhì)；通過SignalP 5.0 Server在線軟件（https:∥services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0）預測BoPAG19蛋白的信號肽；通過TMHMM v.2.0 Server在線軟件（http:∥www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預測BoPAG19蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)；通過YinOYang v.1.2 Server在線軟件（http:∥www.cbs.dtu.dk/services/YinOYang/）預測BoPAG19蛋白糖基化位點；通過IEDB在線數(shù)據(jù)庫預測BoPAG19蛋白的線性B細胞抗原表位；通過SOPMA（https:∥npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html）和Phyre2（http:∥www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index）等在線軟件預測BoPAG19蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)；通過STRING在線工具（https:∥cn.string-db.org/）預測BoPAG19蛋白-蛋白相互作用[15]。

2 結(jié) 果

2.1 pcMV3-BoPAG19載體鑒定

對構(gòu)建的重組載體pcMV3-BoPAG19進行PCR和雙酶切鑒定，結(jié)果見圖2。由圖2可知，目的基因片段長約1 200 bp，與預期大小一致；雙酶切后獲得2條線性片段，分別為目的基因和載體片段，其中目的基因片段大小與BoPAG19基因大小相符，且酶切條帶單一，表明重組載體構(gòu)建成功。

M1，DL2000 DNA Marker；1，BoPAG19基因PCR擴增；M2，DL10000 DNA Marker；2，重組質(zhì)粒pcMV3-BoPAG19 PCR擴增；3，重組質(zhì)粒pcMV3-BoPAG19雙酶切鑒定M1，DL2000 DNA Marker;1，PCR amplification of BoPAG19 gene;M2，DL10000 DNA Marker;2，PCR amplification of recombinant plasmid pcMV3-BoPAG19;3，Double digestion identification of recombinant plasmid pcMV3-BoPAG19圖2 BoPAG19基因PCR擴增和pcMV3-BoPAG19雙酶切鑒定Fig.2 PCR amplification of BoPAG19 gene and double restriction digestion of pcMV3-BoPAG19

2.2 BoPAG19重組蛋白的純化

瞬時轉(zhuǎn)染后取HEK-293F細胞上清進行磁珠純化，洗脫液濃縮50倍后經(jīng)SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示，100 mmol/L咪唑洗脫時BoPAG19蛋白純度和濃度最高，BoPAG19蛋白分子質(zhì)量約60 ku（圖3），與預期大小相符。Gel-Pro Analyzer軟件灰度分析結(jié)果顯示，BoPAG19蛋白純度高達98.4%；BCA蛋白濃度檢測結(jié)果顯示蛋白濃度為1.27 mg/mL；純化蛋白經(jīng)Western blotting分析發(fā)現(xiàn)，能夠與抗PAG19抗體發(fā)生特異性結(jié)合（圖4）。

1,蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準；2，純化前細胞上清；3，洗滌液；4～6，20、100及200 mmol/L咪唑1，Protein Marker;2，Cell supernatant;3，Washing buffer;4-6，20，100 and 200 mmol/L imidazole，respectively圖3 SDS-PAGE分析BoPAG19蛋白Fig.3 SDS-PAGE analysis of BoPAG19 protein

1，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準；2，商用BoPAG19蛋白；3，純化BoPAG19蛋白1,Protein Marker;2，Commercial BoPAG19 protein；3，Purified BoPAG19 protein圖4 Western blotting分析BoPAG19蛋白Fig.4 Western blotting analysis of BoPAG19 protein

2.3 生物信息學分析

2.3.1 理化性質(zhì) 利用ProtParam軟件對BoPAG19蛋白進行分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白分子式為C1937H3028N524O532S15，分子質(zhì)量為41.8 ku，等電點為9.62，親水性平均值（grand average of hydropathicity，GRAVY）為-0.03，為兩性蛋白，蛋白質(zhì)不穩(wěn)定指數(shù)為40.75，在水中不穩(wěn)定；含有380個氨基酸，其中含量最高的是絲氨酸（9.2%），含量最低的是色氨酸（1.6%）（表1）。脂肪系數(shù)為91.53，消光系數(shù)為52 370 mol-1·cm-1，半衰期為30 h。

表1 BoPAG19蛋白的氨基酸組成Table 1 Animo acid composition of BoPAG19 protein

2.3.2 信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)預測 經(jīng)SignalP 5.0 Server軟件對BoPAG19蛋白信號肽進行預測，該蛋白N-端前15個氨基酸為信號肽（圖5）。經(jīng)TMHMM v.2.0 Server軟件對BoPAG19蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)進行預測，BoPAG19蛋白無跨膜區(qū)域（圖6）。

圖5 BoPAG19蛋白信號肽預測Fig.5 Signal peptide prediction of BoPAG19 protein

圖6 BoPAG19蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預測Fig.6 Transmembrane prediction of BoPAG19 protein

2.3.3 糖基化位點預測 經(jīng)YinOYang 1.2 Server在線軟件對蛋白糖基化位點進行分析，結(jié)果顯示，該蛋白共存在6處糖基化位點，分別為Ser92、Thr127、Thr154、Ser184、Ser185和Ser297（圖7）。

圖7 BoPAG19蛋白O-糖基化位點預測Fig.7 O-glycosylation prediction of BoPAG19 protein

2.3.4 抗原表位預測 經(jīng)IEDB在線數(shù)據(jù)庫對BoPAG19蛋白的線性B細胞抗原表位進行預測，結(jié)果顯示，該蛋白共發(fā)現(xiàn)11段優(yōu)勢區(qū)段（圖8），具體抗原表位序列見表2。

圖8 BoPAG19蛋白的線性B細胞表位預測Fig.8 Linear B cell epitopes prediction of BoPAG19 protein

表2 抗原表位序列Table 2 Antigenic epitope sequence

2.3.5 二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu) 經(jīng)SOPMA在線軟件對BoPAG19蛋白的二級結(jié)構(gòu)進行預測，結(jié)果顯示，該蛋白主要以α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲和延伸鏈組成，占比分別為18.95%、6.32%、42.37%和32.37%（圖9）。 經(jīng)Phyre2在線軟件對BoPAG19蛋白的三級結(jié)構(gòu)進行預測，結(jié)果與二級結(jié)構(gòu)一致（圖10）。

h，α-螺旋；t，β-轉(zhuǎn)角；c，無規(guī)則卷曲；e，延伸鏈h,Alpha helix;t,Beta turn;c,Random coil;e,Extended chain圖9 BoPAG19蛋白的二級結(jié)構(gòu)預測Fig.9 Secondary structure prediction of BoPAG19 protein

圖10 BoPAG19蛋白的三級結(jié)構(gòu)預測Fig.10 Tertiary structure prediction of BoPAG19protein

2.3.6 蛋白相互作用分析 通過STRING在線軟件預測BoPAG19蛋白的相互作用，結(jié)果顯示，與BoPAG19互作的蛋白包括β-淀粉樣前體樣蛋白2（amyloid beta （A4） precursor-like protein 2，APLP2）和β-淀粉樣蛋白（amyloid-beta A4 protein，APP）（圖11、表3）。

圖11 BoPAG19蛋白相互作用Fig.11 Interactions of BoPAG19 protein

表3 BoPAG19蛋白功能預測及結(jié)構(gòu)域Table 3 Functional prediction and domain of BoPAG19 protein

3 討 論

目前，在牛、羊、鹿等多種偶蹄動物的胎盤上皮細胞層中發(fā)現(xiàn)了100多種編碼PAG的基因，其中BoPAGs有21種，它們的序列差異至少5%[2]，根據(jù)PAG蛋白是否保留了蛋白水解活性，將BoPAGs蛋白分成“古代組”和“現(xiàn)代組”[19-20]，“現(xiàn)代組”包括了大多數(shù)BoPAGs，它們的催化中心發(fā)生了堿基突變，因此失去了蛋白水解酶活性，PAG19就是結(jié)構(gòu)中DTG模體羧基端常為蘇氨酸的位置突變?yōu)楫惲涟彼?，因此PAG19屬于“現(xiàn)代組”[2]。“現(xiàn)代組”如BoPAG1、BoPAG9和BoPAG21，因僅在滋養(yǎng)層細胞亞群（也叫雙核細胞）中表達，被認為在著床和胎盤形成過程中發(fā)揮了重要的作用[21]，也可能具有免疫調(diào)節(jié)活性和催乳活性[22]。PAGs和孕促性腺激素受體存在相互作用，可能參與了黃體保護與妊娠維持的調(diào)節(jié)[23]。盡管對PAG蛋白有著不同的研究和推測，但PAG真正的功能目前尚不清楚，關于PAG19更是鮮有報道，在NCBI數(shù)據(jù)庫中僅能查詢到在水牛（Bubalusbubalis）和奶牛（Bostaurus）中有PAG19的表達。

在目的基因和蛋白缺少足夠的試驗依據(jù)的情況下，可利用生物信息學技術(shù)對研究的蛋白進行預測，并與其他物種進行比對分析，這對后續(xù)的功能性試驗有一定的指導作用[12]。成熟的PAGs約有330個氨基酸，其理論分子質(zhì)量為37 ku，但是糖基化后的PAGs蛋白分子質(zhì)量幾乎翻倍（約67 ku），糖基化對蛋白分泌、防止蛋白水解、抗原識別和生物學功能等方面均發(fā)揮重要作用[24]。楊亞軍等[12]制備的分泌型BoPAG2蛋白，分子質(zhì)量為68 ku，含有5個糖基化位點，有7個互作蛋白，通過互作蛋白預測，BoPAG2可能參與了消化吸收和妊娠期調(diào)節(jié)功能。劉長斌等[17]制備的BoPAG9也采用了HEK-293F真核表達系統(tǒng)，獲得了分子質(zhì)量約68 ku、純度為90%的蛋白。本試驗在HEK-293F細胞表達并純化后的BoPAG19分子質(zhì)量約60 ku，大于其理論值44 ku，說明蛋白糖基化修飾和磷酸化修飾是分子質(zhì)量大于理論值的主要原因。

最新的結(jié)構(gòu)建模研究表明，“現(xiàn)代組”PAGs雖然失去了蛋白水解酶活性，但是可能保留了短肽結(jié)合能力[25]。PAGs蛋白結(jié)構(gòu)中有一個肽/底物結(jié)合裂隙及N-和O-連接的糖基側(cè)鏈，可以結(jié)合類似于植物凝血素和整合素的蛋白，甚至可以作為某些蛋白的對接位點，隔絕或運輸?shù)鞍?，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)的作用[4]，只是這些底物結(jié)合位點的功能目前還不明確。結(jié)構(gòu)域預測顯示，PAG19含有與APP結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，能與肽結(jié)合，且具有天冬氨酸型內(nèi)肽酶活性，而APP在細胞基質(zhì)沉積后具有很強的神經(jīng)毒性作用，能夠誘導海馬神經(jīng)細胞凋亡[26-27]。有報道顯示，APP沉積與阿爾茨海默疾病等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生有關[28]。PAG19可能通過在胎盤-子宮界面與APP結(jié)合，減少妊娠期APP的沉積和分泌，保護和調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育。但PAG19是否調(diào)節(jié)了神經(jīng)發(fā)育的相關過程，以及是否能用于牛早期妊娠診斷，還缺乏試驗依據(jù)，仍有待進一步研究。

4 結(jié) 論

本研究成功克隆了BoPAG19基因，全長1 200 bp，編碼380個氨基酸，無跨膜結(jié)構(gòu)，有1個信號肽，屬于不穩(wěn)定、親水分泌型蛋白質(zhì)，具有6個糖基化位點和11個B細胞表位；α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲和延伸鏈所占比例分別為18.95%、6.32%、42.37%和32.37%；BoPAG19蛋白與APLP2和APP蛋白有相互作用；成功構(gòu)建了pcMV3-BoPAG19重組質(zhì)粒，并在HEK-293F細胞中表達，純化獲得的BoPAG19蛋白純度高達98.4%，為BoPAG19蛋白的功能研究和臨床診斷提供參考。