孫俊麗，孫如玉，廖海洪，盧健琴，嚴(yán) 靜，盧晟盛,張 冰

（1.廣西畜牧研究所，家畜遺傳改良重點(diǎn)實驗室，南寧 530001；2.廣西大學(xué)農(nóng)牧產(chǎn)業(yè)發(fā)展研究院，南寧 530004）

性別控制技術(shù)是胚胎工程中的一項重要技術(shù)，可以根據(jù)需求有目的的生產(chǎn)公畜或者母畜，從而增加選種強(qiáng)度，加快遺傳進(jìn)展和育種進(jìn)程，也可充分發(fā)揮受性別限制的生產(chǎn)性狀（如泌乳）和受性別影響的生產(chǎn)性狀（如生長速度、肉質(zhì)等）的最大經(jīng)濟(jì)效益，對于畜牧業(yè)的品種選育、品種保護(hù)和優(yōu)良種群擴(kuò)繁等都有著重要的意義。目前，可在生產(chǎn)中應(yīng)用的性別控制技術(shù)主要有兩種：①基于X、Y精子DNA含量差異的流式細(xì)胞分離技術(shù)，但是精子的流式細(xì)胞分選需要高倍稀釋、染色、高壓、激光照射、高速離心及冷凍解凍等處理，產(chǎn)生活性氧會引起氧化應(yīng)激，對精子細(xì)胞器、膜磷脂、DNA等造成一定程度的損傷，造成受精率下降，且成本較高等[1]；②基于Y染色體上特有基因（睪丸決定因子SRY基因、Y染色體重復(fù)序列）或者X/Y性染色體上的差異基因（牙釉質(zhì)基因、鋅指蛋白基因、染色體螺旋蛋白基因等）的PCR擴(kuò)增來鑒定胚胎性別，然后通過胚胎移植等技術(shù)生產(chǎn)所需性別的后代，但是該方法需要采集樣本，易引起胚胎污染，造成胚胎損傷而死亡，且對操作人員的技術(shù)要求高。因此，探求一種非侵入性的、無損的、快速的性別鑒定技術(shù)非常必要。

拉曼光譜技術(shù)是由印度科學(xué)家拉曼（Raman）于1928年提出的,他認(rèn)為不同的樣品接受激光照射后，會產(chǎn)生不同的拉曼光譜位移和譜帶強(qiáng)度。因此通過檢測樣品的拉曼散射并繪制成光譜，然后分析拉曼光譜的峰位信息，便可進(jìn)行樣品鑒定[2]。黃靜等[3]利用拉曼光譜技術(shù)對人胞質(zhì)內(nèi)單精子顯微注射（ICSI）胚胎培養(yǎng)液進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)優(yōu)質(zhì)胚胎與非優(yōu)質(zhì)胚胎的拉曼光譜明顯不同，采用拉曼光譜結(jié)合卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型（CNN）算法，可以區(qū)分優(yōu)質(zhì)胚胎與非優(yōu)質(zhì)胚胎。徐維海等[4]通過對人胚胎培養(yǎng)液的拉曼光譜分析來優(yōu)選具有發(fā)育潛力的胚胎，結(jié)果獲得了清晰、真實、可比性好的拉曼光譜模型，篩選的潛力胚胎與囊胚形成呈中度一致。Ding等[5]利用拉曼光譜技術(shù)對人胚胎培養(yǎng)液的研究發(fā)現(xiàn)，在鑒定人的胚胎質(zhì)量時，拉曼光譜技術(shù)與傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)評分方法得到的結(jié)果是一致的。以上研究表明，拉曼光譜技術(shù)可以作為一種非侵入性、無損的代謝組學(xué)分析技術(shù)對胚胎培養(yǎng)液進(jìn)行研究，且操作方便，實用性強(qiáng)。

前人研究發(fā)現(xiàn)，雌、雄早期胚胎在發(fā)育速度、吸收代謝、遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)等許多方面存在明顯差異[6-8]。胚胎培養(yǎng)液作為體外胚胎發(fā)育的微環(huán)境，既給胚胎提供營養(yǎng)物質(zhì)，又容納著胚胎的代謝產(chǎn)物，因而雌、雄胚胎的培養(yǎng)液也存在差異，受到激光照射后會產(chǎn)生不同的拉曼光譜位移和譜帶強(qiáng)度，據(jù)此推斷可以利用拉曼光譜技術(shù)對胚胎的性別進(jìn)行鑒定分析。目前，這方面的報道還鮮有見到。因此，本研究利用拉曼光譜技術(shù)對豬胚胎代謝液進(jìn)行分析并構(gòu)建判別模型，預(yù)測胚胎性別，以期尋找一種快速無損的早期胚胎性別鑒定方法。

1 材料與方法

1.1 材料

豬卵巢取自廣西南寧市石埠屠宰場，采樣后置于34～37 ℃含雙抗的生理鹽水中，3 h內(nèi)運(yùn)回實驗室。

1.2 主要試劑和儀器

TCM-199、0.25%胰酶均購自Gibco公司；胎牛血清購自HyClone公司；卵泡刺激素（FSH）、促黃體生成素（LH）和表皮細(xì)胞生長因子（EGF）均購自中國科學(xué)院動物研究所；2×TaqPCR Master Mix和蛋白酶K均購自天根生化科技（北京）有限公司；卵泡液（PFF）自制；其余主要試劑均購自Sigma公司。

CO2培養(yǎng)箱（LS-CO 150）購自Thermo公司；顯微操作儀（NT-88-V3）和體視顯微鏡（SMZ 745）均購自Nikon公司；細(xì)胞融合儀（ECM 2001）購自BTX公司；梯度PCR儀（T GRADIENT）購自Biometra公司；拉曼光譜儀由廣西科學(xué)院自主搭建（主要配置：尼康TE2000倒置顯微鏡、Tiger激光器、Spec-10 CCD等）。

1.3 方法

1.3.1 豬卵母細(xì)胞的收集和成熟培養(yǎng) 剪掉卵巢周圍系膜、系帶，用37 ℃生理鹽水洗滌3次，去除血水和污物，移至層流室，置于37 ℃水浴鍋保溫。用一次性注射器抽吸直徑3～6 mm的卵泡，卵泡液置于離心管中沉淀15～20 min。去掉上清，沉淀放于有洗卵液的平皿，體視顯微鏡下挑取顆粒層細(xì)胞在3層以上的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體（COCs）。然后將COCs在預(yù)平衡的卵母細(xì)胞成熟液（含有0.01 μg/ mL EGF、0.5 μg/mL FSH、0.5 μg/mL LH和10% PFF）中洗3遍后，轉(zhuǎn)入成熟液滴中，38.5 ℃、5% CO2和100%濕度條件下培養(yǎng)20～22 h 后，轉(zhuǎn)移至不含F(xiàn)SH和LH的成熟液滴中繼續(xù)培養(yǎng)。COCs成熟40～42 h，轉(zhuǎn)移到2 mL含0.2%透明質(zhì)酸酶的洗卵液中靜置消化1 min，然后輕柔吹吸至卵丘細(xì)胞完全脫落。將卵母細(xì)胞移至干凈的洗卵液中清洗3次，體視顯微鏡下挑選胞質(zhì)均勻、卵周隙清晰、極體完整圓潤、折光度好的卵母細(xì)胞。

1.3.2 精子的清洗 取200 μL豬鮮精加入2 mL的杜爾貝科磷酸鹽緩沖液（DPBS），1 000 r/min離心5 min,重復(fù)3次。 然后加入1 mL DPBS溶液，置于超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)進(jìn)行斷尾處理，1 000 r/min離心2 min。去掉上清，將離心好的精子稀釋到106/mL備用[9]。

1.3.3 ICSI 用顯微操作液、0.25%胰酶液和7%聚乙烯吡咯烷酮（PVP）液制作顯微操作盤，礦物油封頂。 吸取10 μL精液放入PVP液中，卵母細(xì)胞放入操作液中。從PVP液中吸取一個精子移入卵母細(xì)胞液，用固定針吸住卵母細(xì)胞，然后用注射針撥動卵母細(xì)胞，使極體位于12點(diǎn)或者6點(diǎn)方向，從3點(diǎn)的位置穿過透明帶和細(xì)胞膜，將精子注入卵胞質(zhì)。隨后撤出顯微注射針，并釋放卵母細(xì)胞。

1.3.4 ICSI胚胎的化學(xué)激活和培養(yǎng) 先將ICSI胚胎在洗卵液中清洗2遍，轉(zhuǎn)移到平衡好的豬胚胎培養(yǎng)液（porcine zygote medium-3，PZM-3）滴中，恢復(fù)約1 h。然后移入5 μL/L的離子霉素（ionomycin）液中處理3.5 min，再轉(zhuǎn)入平衡好的2.5 mmol/L 6-二甲基氨基嘌呤（6-DMAP）液中，培養(yǎng)3.5 h。然后移入平衡好的PZM-3溶液中清洗2遍，再轉(zhuǎn)入PZM-3培養(yǎng)液滴中，每滴15～20枚胚胎，38.5 ℃、5% CO2和100%濕度條件下繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.5 單胚胎培養(yǎng)和培養(yǎng)液的收集 胚胎培養(yǎng)至第5天，將發(fā)育至早期囊胚的胚胎移入平衡好的20 μL PZM-3小滴，每滴1枚胚胎，培養(yǎng)4 h。 然后用20 μL移液槍小心吸取培養(yǎng)液至200 μL EP管，并收集對應(yīng)的囊胚，用ddH2O清洗2次后放入0.2 mL的EP管，做好標(biāo)記。收集同批次空白胚胎培養(yǎng)微滴作為對照組。收集的培養(yǎng)液放入-80 ℃、胚胎放入-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.6 巢式PCR鑒定囊胚性別 基于豬AMELx、AMELy基因內(nèi)含子3中9～10 bp的序列缺失[10]，本研究利用巢式PCR對豬單個囊胚的性別進(jìn)行判定。根據(jù)豬AMEL基因內(nèi)含子3序列（AMELx，GenBank 登錄號：AB091791；AMELy，GenBank登錄號：AB091792）設(shè)計巢式PCR引物。外引物：AMEL-Fo:5′-AAGCTACCACCTCATC-CTG-3′，AMEL-Ro:5′-GCCATCTCATACTTTC-CCTTG-3′。內(nèi)引物：AMEL-Fi:5′-GGTGGATTC-TTCATTCAGGATG-3′，AMEL-Ri:5′-AAAGA-CCAGCGAGGGAGA-3′。在內(nèi)引物Fi的5′端添加6-FAM熒光，用于PCR產(chǎn)物掃描分型，引物均由金斯瑞生物科技有限公司合成。單囊胚巢氏PCR具體步驟參見孫俊麗等[11]的研究。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送往Thermofisher Scientific公司進(jìn)行片段大小掃描。根據(jù)基因片段掃描主峰的多少來判定胚胎性別：雌性胚胎只有AMELx等位基因，在178-179 bp處出現(xiàn)1個主峰；而雄性胚胎含有AMELx和AMELy2個等位基因，在169-171 bp和178-179 bp處出現(xiàn)2個主峰。

1.3.7 拉曼光譜的收集 拉曼光譜數(shù)據(jù)收集的方法參照姚輝璐等[12]的方法。樣品池由厚4 mm的載玻片中間挖1個直徑為6 mm的孔，孔底用1個厚100 μm石英片密封而成。取20 μL解凍的單胚胎培養(yǎng)液放于樣品池上，然后將樣品池小心放置在滴有石英油的物鏡上，經(jīng)半導(dǎo)體激光器產(chǎn)生波長為785 nm的光束導(dǎo)入倒置顯微鏡，用100倍（N.A.1.25）油浸物鏡觀察聚焦測量點(diǎn)，采樣輸出功率20 mW，積分時間設(shè)為100 s，每個樣品采集3次。用同樣的激發(fā)功率和積分時間采集空白對照光譜。用培養(yǎng)液的拉曼光譜減去該批次的空白對照光譜，即得到單胚胎培養(yǎng)液的拉曼光譜。

1.3.8 拉曼光譜數(shù)據(jù)處理 在采集拉曼光譜時存在著諸多干擾源，干擾信號會掩蓋樣品光譜中的有用信息，影響光譜有效信息提取、建模以及預(yù)測效果。先采用高國明等[13]的極小極大值自適應(yīng)縮放法對原始光譜進(jìn)行預(yù)處理，去除熒光背景和噪聲，提高信噪比；再利用Origin 8.0軟件對預(yù)處理后的拉曼光譜去除頭尾中的一部分不準(zhǔn)確數(shù)據(jù)，留取600-1 800 cm-1區(qū)域內(nèi)的光譜信號。使用Matlab 2018軟件中的Libsvm程序包對拉曼數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析（PCA），提取樣品特征變量，降低數(shù)據(jù)維度，然后采用支持向量機(jī)（support vector machine，SVM）法建立分類判別模型。隨機(jī)選取樣本組成訓(xùn)練集和測試集，先將訓(xùn)練樣本放入SVM算法中進(jìn)行訓(xùn)練和建模，然后將測試樣本輸入算法中預(yù)測樣本的性別，最后利用PCR鑒定結(jié)果計算預(yù)測結(jié)果的準(zhǔn)確率。

2 結(jié) 果

2.1 巢式PCR鑒定囊胚性別

巢式PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，外引物擴(kuò)增片段長度約為530 bp，內(nèi)引物擴(kuò)增片段長度約為170 bp（圖1），與預(yù)期結(jié)果相同。本試驗收集了207個豬ICSI早期囊胚，通過巢式PCR成功獲得了199個樣品的目的片段，8個樣品擴(kuò)增失敗。然后進(jìn)行熒光標(biāo)記-半自動基因掃描（圖2），結(jié)果發(fā)現(xiàn)71個是雄性胚胎，128個是雌性胚胎。

1～10，外引物擴(kuò)增結(jié)果；M1，DL2000 DNA Marker；M2，DL1000 DNA Marker；1′～10′，內(nèi)引物擴(kuò)增結(jié)果1-10，Amplification results of outer primers;M1，DL2000 DNA Marker；M2，DL1000 DNA Marker；1′-10′，Amplification results of inner primers圖1 豬AMEL基因內(nèi)、外引物的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results of inner and outer primers of AMEL gene in porcine

單峰,雌性;雙峰,雄性Single peak,Female;Double peaks,Male圖2 擴(kuò)增產(chǎn)物的基因片段掃描Fig.2 Gene fragment scanning of amplified products

2.2 不同性別豬ICSI胚胎培養(yǎng)液拉曼光譜的比較

按照拉曼光譜采集方法獲取ICSI胚胎培養(yǎng)液的拉曼光譜，根據(jù)巢式PCR判定結(jié)果，將拉曼光譜數(shù)據(jù)分為XX（雌性）和XY（雄性）2組，分別計算2組拉曼數(shù)據(jù)的平均光譜（圖3）。然后將XY（雄性）組的平均光譜減去XX（雌性）組的平均光譜，獲得差異光譜（圖4）。由圖4可知，豬ICSI雄性胚胎培養(yǎng)液在1 082和1 360 cm-1拉曼位移處的特征峰強(qiáng)度明顯高于雌性胚胎的。

圖3 豬ICSI囊胚培養(yǎng)液原始拉曼光譜圖（A）和平均拉曼光譜圖（B）Fig.3 Primitive Raman spectra （A） and average Raman spectra （B） of cultured medium of porcine ICSI blastocysts

圖4 豬雌雄ICSI囊胚培養(yǎng)液的平均拉曼光譜圖Fig.4 Average Raman spectra on cultured medium of porcine female and male ICSI blastocysts

2.3 SVM法構(gòu)建胚胎性別分類判別模型

隨機(jī)選取經(jīng)巢式PCR鑒定的112個雌性和60個雄性胚胎培養(yǎng)液的拉曼光譜進(jìn)入訓(xùn)練集進(jìn)行建模，用Matlab軟件對拉曼光譜進(jìn)行主成分分析（PCA），獲取累計貢獻(xiàn)率達(dá)到90%以上的特征變量，以確保建模結(jié)果的可靠性，選擇高斯核函數(shù)進(jìn)行SVM算法的分類建模。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該模型對訓(xùn)練集樣品分類的準(zhǔn)確率達(dá)92.0%，雌性靈敏度89.7%，雄性靈敏度96.0%。然后利用該模型對27個測試集（雄性胚胎培養(yǎng)液16份、雌性胚胎培養(yǎng)液11份）中的樣品進(jìn)行分類預(yù)測，并與PCR性別鑒定結(jié)果對比發(fā)現(xiàn)，11個雄性胚胎中有2個被錯判為雌性胚胎，其準(zhǔn)確率為81.8%；16個雌性胚胎中有3個被錯判為雄性胚胎，其準(zhǔn)確率為81.3%；總準(zhǔn)確率為81.5%（表1）。

表1 SVM模型對胚胎性別預(yù)測結(jié)果Table 1 Prediction results of embryos gender by SVM model

3 討 論

光譜分析技術(shù)是基于物質(zhì)分子的振動變化來分析物質(zhì)結(jié)構(gòu)和組成的方法，其中紅外光譜技術(shù)和拉曼光譜技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究領(lǐng)域，特別是在代謝組學(xué)研究方面展現(xiàn)了其獨(dú)特的優(yōu)勢。早在2007年，Seli等[14]利用拉曼光譜和近紅外光譜技術(shù)分析了人體外受精（IVF）第3天胚胎的培養(yǎng)液，并預(yù)測胚胎發(fā)育潛能，發(fā)現(xiàn)拉曼光譜技術(shù)預(yù)測的靈敏度和特異性分別為86%和76.5%，紅外光譜技術(shù)預(yù)測的分別為75%和83.3%。2008年也發(fā)表了3篇類似的報道[15-17]，發(fā)現(xiàn)基于胚胎代謝液的拉曼光譜預(yù)測人胚胎發(fā)育潛能的靈敏度和特異性最高分別達(dá)到100%和90%。所以作者認(rèn)為基于培養(yǎng)液的代謝組學(xué)光譜分析技術(shù)可作為胚胎移植前的一種快速、無損的胚胎發(fā)育潛能評估方法。2013年，Zhao等[18]利用拉曼光譜技術(shù)分析人胚胎培養(yǎng)液時發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)液中含有相對濃度低于0.012的丙酮酸鈉和高于-0.00085的苯基丙氨酸的胚胎具有更好的發(fā)育潛能，分類準(zhǔn)確率為85.7%。2015年，Santos等[19]利用拉曼光譜技術(shù)對牛體外胚胎培養(yǎng)液的代謝組學(xué)進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)有無胚胎的培養(yǎng)液的拉曼光譜間存在明顯差異。隨后基于拉曼光譜和紅外光譜技術(shù)分析胚胎培養(yǎng)液、卵母細(xì)胞培養(yǎng)液的研究陸續(xù)報道，認(rèn)為光譜技術(shù)可以作為一種非侵入性、無損的、微量的代謝組學(xué)分析技術(shù)，具有很強(qiáng)的實用性[5,20]。

在胚胎早期發(fā)育過程中，性別差異基因的不同表達(dá)會影響表觀調(diào)控和代謝應(yīng)答，因而可能會導(dǎo)致不同物種間的早期胚胎發(fā)育代謝存在差異，不同性別間的早期胚胎代謝液也會出現(xiàn)差異。Gardner等[21]提出，利用蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)對胚胎培養(yǎng)液進(jìn)行分析來鑒定胚胎性別。隨后，Gardner等[22]通過對胚胎培養(yǎng)液中葡萄糖消耗的研究，對人胚胎性別進(jìn)行了鑒定。Gerald等[23]利用紅外光譜成像技術(shù)鑒定受精未孵化雞蛋的性別，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雄性胚盤細(xì)胞中DNA含量高于雌性，其鑒定結(jié)果與PCR鑒定結(jié)果一致。Munoz等[24]利用傅里葉紅外光譜技術(shù)通過對牛胚胎培養(yǎng)液的代謝組學(xué)分析來鑒定胚胎性別，擴(kuò)張囊胚的準(zhǔn)確率為86%，早期囊胚準(zhǔn)確率為74.9%。目前，基于胚胎培養(yǎng)液的光譜技術(shù)來鑒定胚胎性別方面的研究主要是利用紅外光譜技術(shù)，利用拉曼光譜技術(shù)的還少有報道。隨著拉曼光譜技術(shù)的快速發(fā)展，利用拉曼光譜來分析代謝液或者培養(yǎng)液比紅外光譜效果更好：①拉曼光譜對組織或生物樣品中微小的生化和分子變化很敏感[25]；②水在生命體系中是重要的介質(zhì)，而水的拉曼光譜較弱，特征簡單[26]，相比紅外光譜技術(shù)更有利于對溶液類樣品的分析檢測；③拉曼光譜分析無需對樣品進(jìn)行標(biāo)記；④拉曼光譜分析對樣品的需要量少（僅幾微升），幾乎不需要前處理[18]；⑤拉曼光譜技術(shù)操作簡單，檢測時間短。本研究是以單個早期囊胚短時間內(nèi)的培養(yǎng)液為研究對象，樣品量少、胚胎代謝物質(zhì)微量，且水為主要組分，因此選擇拉曼光譜技術(shù)采集豬早期囊胚培養(yǎng)液的光譜圖，然后用SVM法構(gòu)建分類判別模型，用于樣本的訓(xùn)練和預(yù)測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同性別豬胚胎培養(yǎng)液在1 082和1 360 cm-1特征峰強(qiáng)度存在明顯差異，且雄性胚胎的峰值明顯高于雌性胚胎的。對照拉曼特征峰物質(zhì)歸屬表發(fā)現(xiàn)，1 082 cm-1歸屬DNA對稱磷酸離子O-P-O-伸縮振動，該特征峰強(qiáng)度的改變預(yù)示DNA發(fā)生單、雙鏈的斷裂[27]，1 360 cm-1歸屬N-乙酰基葡萄糖的CH3彎曲振動[28]。確定豬ICSI雄性和雌性胚胎培養(yǎng)液的拉曼光譜間存在明顯不同，依此利用SVM法構(gòu)建豬ICSI早期囊胚性別分類判別模型，其雄性胚胎的分類準(zhǔn)確率為81.8%，雌性胚胎的分類準(zhǔn)確率為81.3%，總分類準(zhǔn)確率為81.5%，高于紅外光譜技術(shù)鑒定牛早期囊胚的準(zhǔn)確率（74.9%）[24]，低于紅外光譜技術(shù)鑒定擴(kuò)張囊胚的準(zhǔn)確率（86%）[24]。擴(kuò)張囊胚時期的分類準(zhǔn)確率高于早期囊胚的，原因可能是擴(kuò)張囊胚時期的代謝更為旺盛，性別間的代謝差異更大，因而性別鑒定的分類準(zhǔn)確率較高。

本研究的分類準(zhǔn)確率不是很理想，分析有以下幾點(diǎn)原因：①原始拉曼光譜的預(yù)處理方面。實測的拉曼光譜中存在著諸多干擾源，如激光及拉曼散射光的發(fā)射噪聲、CCD探測器的各種噪聲、樣品及樣品容器的熒光背景等，這些干擾信號會淹沒樣品的光譜信息，影響光譜有效信息獲得和模型建立及其效果預(yù)測。為了消除干擾因素的影響，通過查閱文獻(xiàn)，選擇了與本研究對象相近案例的預(yù)處理方法，即采用高國明等[13]的極小極大值自適應(yīng)縮放法進(jìn)行預(yù)處理，而沒有開發(fā)針對本研究的拉曼光譜的預(yù)處理方法，有可能會造成其他有用信號的丟失，進(jìn)而影響分類模型的構(gòu)建和預(yù)測。②建模算法及其參數(shù)的選擇方面。本研究利用拉曼光譜技術(shù)采集豬胚胎培養(yǎng)液的光譜圖并進(jìn)行分析，然后用SVM法構(gòu)建分類判別模型，用于樣本的訓(xùn)練和預(yù)測。拉曼光譜的原始數(shù)據(jù)過多，如果全部用于SVM建模，數(shù)據(jù)計算難度太大，模型也過于復(fù)雜。為了降低數(shù)據(jù)計算難度和模型復(fù)雜度，先用PCA對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行降維；同時為了提高分類準(zhǔn)確率，選擇累計貢獻(xiàn)率達(dá)到90%以上的維數(shù)。在用SVM法構(gòu)建分類判別模型時，首先要選擇合適的核函數(shù)。高斯核函數(shù)性能優(yōu)異并且穩(wěn)定，不但收斂域較寬，而且能夠適用于很多不同特征的樣本，其參數(shù)也相對簡單，因而選擇高斯核函數(shù)進(jìn)行分類。高斯核函數(shù)需要的懲罰因子和核函數(shù)的寬度等參數(shù)，使用Matlab軟件進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化。SVM算法所用的參數(shù)主要是利用Matlab軟件自行優(yōu)化，針對性的調(diào)整優(yōu)化可能做得不好，故而導(dǎo)致分類準(zhǔn)確率不高。③構(gòu)建模型的樣本量小，可能造成抽樣誤差，需要增加樣本量來提高準(zhǔn)確率。因此，需要進(jìn)一步深入的研究來完善優(yōu)化上述問題，從而建立一種無損的胚胎性別鑒定方法，這對畜牧業(yè)的體外胚胎生產(chǎn)和人類的輔助生殖等方面具有重要的科學(xué)研究價值和廣闊的應(yīng)用前景。

4 結(jié) 論

本研究利用拉曼光譜技術(shù)對豬ICSI胚胎培養(yǎng)液進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)豬ICSI雄性胚胎培養(yǎng)液在1 082和1 360 cm-1拉曼位移處特征峰強(qiáng)度明顯高于雌性的；然后結(jié)合SVM算法構(gòu)建分類模型，對測試樣本進(jìn)行預(yù)測的分類準(zhǔn)確率為81.5%，雌性和雄性胚胎的分類準(zhǔn)確率分別為81.3%和81.8%。