李尚, 呂婷婷, 張子睿, 孫嵐

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所藥物篩選中心,北京 100050)

肺動(dòng)脈高壓(pulmonary arterial hypertension, PAH)是由多種原因?qū)е碌姆窝h(huán)阻力進(jìn)行性升高的臨床和病理生理綜合征,它以肺血管重塑為特征,表現(xiàn)為血管內(nèi)皮細(xì)胞異常增殖、平滑肌肥大和內(nèi)膜增厚,最終右心功能衰竭而死亡。目前對(duì)于PAH的臨床治療主要是肺血管擴(kuò)張藥物,通過(guò)選擇性作用于PAH相關(guān)分子通路:前列環(huán)素通路、內(nèi)皮素通路與一氧化氮/環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷通路等,靶向收縮血管,促進(jìn)肺血管舒張,恢復(fù)心肺正常血流供應(yīng)[1]。肺血管擴(kuò)張劑雖然可以間接抑制細(xì)胞增殖并逆轉(zhuǎn)血管重塑來(lái)緩解癥狀,但安全性低、價(jià)格昂貴且不能完全治愈疾病。調(diào)查顯示,用藥后患者的生存率并沒(méi)有得到很大程度的提高[2]。隨著遺傳學(xué)、細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)、生物信息學(xué)等學(xué)科的不斷發(fā)展,以及對(duì)PAH發(fā)病機(jī)制的不斷深入研究,基因技術(shù)作為一門(mén)新興的技術(shù),被廣泛地應(yīng)用于生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)研究的重要領(lǐng)域,為改善甚至治愈PAH提供了新的手段。

1 PAH的基因治療

基因治療可通過(guò)對(duì)基因進(jìn)行替換、增補(bǔ)或敲除等糾正或補(bǔ)償缺陷和異?；蛞鸬募膊?達(dá)到治療效果。目前,采取基因治療的方法,通過(guò)轉(zhuǎn)移目的表達(dá)基因,在體內(nèi)生成有治療效果的產(chǎn)物如血管舒張因子、細(xì)胞生長(zhǎng)因子、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2型受體(bone morphogenic protein receptor 2,BMPR2)等是治療PAH的重要方式。此外,研究人員對(duì)非編碼RNA與PAH的病理、診斷和治療關(guān)系的研究日漸深入,利用長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long-noncoding RNA,lncRNA)與微小RNA(microRNA, miRNA)相互作用且miRNA可靶向目的基因的特性而產(chǎn)生的非編碼RNA基因療法也逐漸發(fā)展起來(lái)。PAH基因療法的相關(guān)途徑見(jiàn)圖1。

1.1 血管擴(kuò)張因子

1.1.1 一氧化氮合酶基因療法 一氧化氮(NO)是一種內(nèi)源性合成的、可擴(kuò)散的氣體信號(hào)分子,在肺循環(huán)過(guò)程中,參與調(diào)節(jié)肺血管張力、平滑肌收縮、血小板抑制以及血管重塑等多個(gè)生理過(guò)程[3]。一氧化氮合酶(NOS) 催化精氨酸氧化是NO的主要來(lái)源,其中,肺組織中的NO主要由內(nèi)皮型NOS(eNOS)催化生成[4]。NO擴(kuò)散進(jìn)入肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary arterial smooth muscle cells,PASMCs)中,促進(jìn)GTP轉(zhuǎn)化為cGMP,使平滑肌細(xì)胞舒張,降低肺動(dòng)脈壓力[3]。NOS3基因轉(zhuǎn)移對(duì)PAH的作用已在多種動(dòng)物模型中得以研究,如Somani等[5]基于大鼠血液生長(zhǎng)內(nèi)皮細(xì)胞(rat blood outgrowth endothelial cells,rBOECs),以逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體過(guò)表達(dá)eNOS,得到rBOEC/eNOS細(xì)胞,尾靜脈注射于野百合堿(monocrotatine,MCT)誘導(dǎo)大鼠PAH模型,結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,細(xì)胞注射組右心室收縮壓降低,右心室肥大、肺小動(dòng)脈肌化改善。Granton等[6]通過(guò)將NOS3基因轉(zhuǎn)染的內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells,EPCs)經(jīng)多孔肺動(dòng)脈導(dǎo)管注入7名WHO Ⅲ級(jí)以上癥狀的特發(fā)性PAH患者的右心房,發(fā)現(xiàn)其總肺阻力有改善,短期血流動(dòng)力學(xué)改善、運(yùn)動(dòng)能力持續(xù)增加。

AAV:腺病毒；MSCs:間充質(zhì)干細(xì)胞；HVJ:副流感病毒；PECs:肺內(nèi)皮細(xì)胞；VEGF:血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；VEGFR2:血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2；c-Src:c-Src激酶；TGF-β:β轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子；BMPR1/2:骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體；HGF:肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子；Met:Met酪氨酸激酶；L-arginine:L-精氨酸；eNOS:內(nèi)皮型一氧化氮合酶；L-citrulline:L-瓜氨酸；SMAD:SMAD蛋白；AA:花生四烯酸；COX:環(huán)氧合酶；PGG2:前列腺素G2；PTGs:前列腺素合酶；PGH2:前列腺素H2；PGIs:前列環(huán)素合酶；PGI2:前列環(huán)素；PSMCs:肺平滑肌細(xì)胞；AC:腺苷酸環(huán)化酶；CGRP:降鈣素基因相關(guān)肽；GTP:三磷酸鳥(niǎo)苷；cGMP:環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷；ATP:三磷酸腺苷；cAMP:環(huán)磷酸腺苷

1.1.2 降鈣素基因相關(guān)肽基因療法 降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene-related peptide, CGRP)是高效的血管擴(kuò)張劑,可以在受體介導(dǎo)下作用于上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞,激活腺苷酸環(huán)化酶生成cAMP,從而舒張血管[7],并可通過(guò)抑制肺動(dòng)脈膠原的積累減緩PAH的進(jìn)程和肺血管重構(gòu)[8],在病理生理?xiàng)l件下具有調(diào)節(jié)肺循環(huán)的作用。在多種實(shí)驗(yàn)性PAH模型中,CGRP的基因轉(zhuǎn)移治療都被證明是有效的。在體外實(shí)驗(yàn)中,Li等[9]分離、體外擴(kuò)增大鼠PASMCs后用含CGRP的腺病毒進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo),表明CGRP的分泌可抑制PASMCs增殖。Zhao等[10]對(duì)腹主動(dòng)脈-下腔靜脈分流術(shù)誘導(dǎo)的大鼠PAH模型靜脈注射表達(dá)CGRP的EPCs,發(fā)現(xiàn)表達(dá)CGRP的EPCs移植可有效改善PAH并逆轉(zhuǎn)肺血管重構(gòu)。Champion等[11]在小鼠慢性缺氧模型氣管內(nèi)注射表達(dá)CGRP前體的腺病毒,發(fā)現(xiàn)小鼠肺血管阻力降低,右心室腫大、肺血管重塑得到改善。

1.1.3 前列環(huán)素合酶基因療法 前列環(huán)素(prostacyclin, PGI2)是一種由血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的高效的內(nèi)源性血管舒張因子,具有強(qiáng)大的舒張血管、抑制血小板黏附以及抗增殖特性[12]。PGI2是前列環(huán)素合酶(PGIs)和環(huán)氧合酶(COX)催化內(nèi)源性花生四烯酸產(chǎn)生的。PGI2可以通過(guò)影響PASMCs的增殖和凋亡,逆轉(zhuǎn)肺血管重構(gòu)[13],進(jìn)而阻止PAH的發(fā)展。研究證實(shí),在重度PAH患者肺毛細(xì)血管中PGIs的表達(dá)水平明顯降低[14]。日本研究人員[15]以腺相關(guān)病毒(AAV)為載體,通過(guò)大腿注射AAV-PGIs,將PGIs轉(zhuǎn)染到小鼠體內(nèi),小鼠肺血管阻力和肺動(dòng)脈壓降低。同時(shí),小鼠副流感病毒(HVJ)包膜載體系統(tǒng)也應(yīng)用于PAH大鼠的基因治療,采用HVJ-脂質(zhì)體法將PGIs轉(zhuǎn)染到MCT誘導(dǎo)的PAH大鼠氣管內(nèi),1周后PGI2的代謝產(chǎn)物顯著增加,大鼠模型PAH顯著改善。Wang等[16]利用超聲波輔助基因轉(zhuǎn)移在大鼠頜下腺表達(dá)Cox1-PGIs,數(shù)據(jù)顯示循環(huán)PGI2顯著升高,大鼠模型PAH同樣得到改善。

1.2 細(xì)胞生長(zhǎng)因子

1.2.1 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子基因療法 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)具有促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、提高血管通透性以及誘導(dǎo)新生血管和小動(dòng)脈形成等作用[17]。VEGF在肺中含量豐富,可作為肺結(jié)構(gòu)的維持因子來(lái)發(fā)揮作用。VEGF還可以通過(guò) flk-1、KDR 信號(hào)通路激活c-Src激酶,誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生NO和PGI2,從而促進(jìn)血管舒張[18]。實(shí)驗(yàn)研究證明,急性和慢性缺氧會(huì)導(dǎo)致肺中VEGF及其受體VEGFR1和VEGFR2表達(dá)增加[19],基因?qū)隫EGF可減輕實(shí)驗(yàn)動(dòng)物PAH的發(fā)生。尚峰等[20]將VEGF165轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)移植入MCT誘導(dǎo)的大鼠PAH模型中,觀察到肺內(nèi)損傷血管修復(fù)和血管新生現(xiàn)象。Farkas等[21]通過(guò)腺病毒載體介導(dǎo)VEGF治療繼發(fā)性PAH大鼠,其血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡減少,血管生成增加,PAH顯著改善。

1.2.2 肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因療法 肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)是目前已知生物活性最廣泛的生長(zhǎng)因子之一,能刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移,且HGF具有減弱炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),降低炎癥因子表達(dá),從而減少 PAH 中肺血管壁損傷的功能[22]。HGF通過(guò)降低肺動(dòng)脈壓,減少肺內(nèi)膜顆粒,繼而延緩右心室肥大、促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù),最終抑制PAH的發(fā)生發(fā)展[23-24]。Wang等[25]氣管內(nèi)滴注HGF腺病毒(Ad-HGF)轉(zhuǎn)染MCT-PAH大鼠,轉(zhuǎn)染3周后測(cè)定血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo),HGF能顯著降低PAH、右心室收縮壓、血清血管緊張素Ⅱ和腦鈉肽水平,還明顯減輕了右心室肥大和膠原沉積。此外,Guo等[26]通過(guò)BMSCs移植過(guò)表達(dá)HGF與粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)聯(lián)合治療MCT-PAH大鼠,給藥3周后,聯(lián)合治療組的大鼠右心室肥厚和平均肺動(dòng)脈壓明顯降低,血管肌化及膠原沉積也明顯減少,提示移植HGF-BMSCs聯(lián)合G-CSF可協(xié)同治療PAH。劉珍君等[24]于MCT誘導(dǎo)的大鼠模型PAH組中氣管滴注攜帶HGF的腺病毒,結(jié)果顯示模型組肺動(dòng)脈壓較大程度降低,肺內(nèi)膜顆粒減少繼而延緩右心室肥大,促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù)。

1.3 骨形態(tài)發(fā)生蛋白2型受體基因療法

BMPR2是受體 TGF-β 超家族 “2 型”成員。其常染色體顯性突變存在于大多數(shù)可遺傳和家族性 PAH 病例中[27]。磷酸化的BMPR2受體促使1型受體磷酸化,后者又通過(guò)經(jīng)典和非經(jīng)典信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)受體蛋白SMAD 1/5/8以及細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶 (ERK)等的磷酸化,進(jìn)而促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)并激活MAPK、Notch等信號(hào)通路,從而影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、增殖和凋亡[28-29]。多項(xiàng)研究表明將野生型 BMPR2 遞送至 MCT誘導(dǎo)缺氧大鼠模型的肺血管內(nèi)皮可改善 PAH 相關(guān)的肺血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)并逆轉(zhuǎn)肺血管系統(tǒng)的重塑,如Harper等[30]以腺病毒為載體,將BMPR2遞送進(jìn)入MCT誘導(dǎo)的大鼠肺高壓模型中,與對(duì)照動(dòng)物相比,大鼠右心室收縮壓和平均肺動(dòng)脈壓力顯著降低；Harper等[31]在大鼠MCT模型中靜脈注射 BMPR2 表達(dá)增強(qiáng)的EPCs,結(jié)果顯示該細(xì)胞主要在肺部積聚,并釋放表達(dá) BMPR2 的外泌體,PAH導(dǎo)致的右心室肥大、右心室收縮壓以及平均肺動(dòng)脈壓的升高得到了改善。

1.4 其他目的基因轉(zhuǎn)移療法

除以上所轉(zhuǎn)移的目的基因外,近年來(lái),隨著對(duì)PAH發(fā)病機(jī)制及其相關(guān)基因通路的不斷深入研究,越來(lái)越多的目的基因被用于PAH的基因治療,并在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型上取得了良好的治療效果。如Ad5-Kv1.5 經(jīng)口氣管霧化可以恢復(fù)大鼠 PASMCs 對(duì) O2敏感的 K+電流并降低肺血管阻力、改善右心室肥大[32]；骨膜素可以通過(guò)NF-кB誘導(dǎo)iNOS基因的表達(dá),并抑制人肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(HPAECs)、人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(HPASMCs)和PAH實(shí)驗(yàn)小鼠模型中生長(zhǎng)因子和HIF-1α的釋放以及肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(PAECs)中BMPR2的表達(dá)[33-34]；在缺氧誘導(dǎo)的大鼠PAH模型中,選擇性敲低 PAEC-Tph1,抑制了與血管重塑相關(guān)的血清素的釋放,逆轉(zhuǎn)了PAH的發(fā)展[35]。除此之外,心房鈉尿肽(ANP)[36]、5-脂氧酶(5-LO)[37]、載脂蛋白A5(ApoA5)[38]、生存素(survivin)[39]、超氧化物歧化酶(SOD)[40]、基質(zhì)金屬蛋白酶1抑制劑(TIMP-1)等[41]的基因轉(zhuǎn)移均可減輕大鼠等嚙齒類(lèi)動(dòng)物PAH的發(fā)生。

1.5 非編碼RNA與PAH

1.5.1 MiRNA與PAH miRNA大多數(shù)是由真核細(xì)胞RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄形成的內(nèi)源性非編碼RNA,既可以通過(guò)直接與靶基因信使RNA(mRNA)結(jié)合,也可以與靶基因mRNA的3′端非編碼區(qū)結(jié)合,影響基因的翻譯,在生物的蛋白質(zhì)合成過(guò)程中起到重要的調(diào)節(jié)作用[42]。近年研究表明,在PAH的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中,miRNA可以通過(guò)靶向TGF-β、HIF-1、c-myc等重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白影響肺部平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的增殖、遷移和凋亡,以及PAH引起的右心室重構(gòu)[43-45]。在體外細(xì)胞模型中,miR-181a-5p、miR-324-5p在HPAECs中的過(guò)表達(dá)抑制了細(xì)胞的增殖[46]；miR-143-5p直接靶向HIF-1α促進(jìn)缺氧條件下PASMCs的表型轉(zhuǎn)換、增殖和遷移[47]。在PAH動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?miR-145敲低的慢性缺氧小鼠模型右心室收縮壓和右心室肥厚顯著降低[48]；慢病毒介導(dǎo)的 miR-150過(guò)表達(dá)抑制了缺氧誘導(dǎo)的大鼠右心室收縮壓增加和心排出量減少[49]。表1是近5年部分miRNA的靶點(diǎn)及其在PAH中的功能。

表1 miRNA在PAH模型中的靶點(diǎn)基因以及功能

1.5.2 LncRNA與PAH lncRNA與miRNA同屬于非編碼RNA家族,由真核細(xì)胞RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄形成,在PAH的發(fā)展過(guò)程中,其可以與miRNA結(jié)合,發(fā)揮分子海綿的作用,產(chǎn)生lncRNA-miRNA-mRNA互作網(wǎng)絡(luò),調(diào)控細(xì)胞周期以及蛋白合成,進(jìn)而調(diào)控PASMCs的增殖和凋亡。研究表明,lncRNA-Tug1與 miR-374c 結(jié)合上調(diào) Foxc1[61],沉默Tug1可以下調(diào) Foxc1從而抑制PASMCs增殖和遷移,同時(shí)促進(jìn)其凋亡；lncRNA-SMILR可以靶向miR-141[62],敲除SMILR顯著抑制MCT誘導(dǎo)的大鼠Rho/ROCK 活化和血管重塑；lncRNA-H19與miRNA let-7b結(jié)合[63]上調(diào)AT1R,發(fā)揮分子海綿作用,敲除H19可抑制小鼠PASMCs增殖,改善MCT誘導(dǎo)的肺血管重塑。除此之外,lncRNA還可以直接調(diào)節(jié)p53[64]、BRG1[65]、HOXA3[66]等的基因表達(dá),發(fā)揮改善PAH的作用。

2 問(wèn)題和展望

盡管PAH的發(fā)病相關(guān)基因通路已經(jīng)得到了廣泛研究,基因治療也在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭腥〉昧艘欢ǖ闹委熜Ч?但在臨床應(yīng)用上,基因治療仍具有巨大的挑戰(zhàn)。

2.1 基因傳遞系統(tǒng)

將非病毒載體和腺病毒或腺相關(guān)病毒載體高效率地通過(guò)肺上皮氣管或肺內(nèi)皮血管輸送到肺部的準(zhǔn)確部位,提高靶向性和安全性,克服可能誘發(fā)的炎癥和免疫反應(yīng),是仍需解決的一大問(wèn)題。因此,開(kāi)發(fā)高效安全的基因傳遞系統(tǒng)是非常有必要的。

2.2 基因聯(lián)合治療

近年來(lái),疾病的聯(lián)合用藥發(fā)展迅速,用于治療PAH的曲前列環(huán)素與ETRA(內(nèi)皮素受體拮抗劑)、PDE5i(5型磷酸二酯酶抑制劑)或sGC(可溶性鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶)刺激劑合用可大大降低心血管意外的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[67]；與單藥治療相比,安立生坦和他達(dá)拉非的前期聯(lián)合治療可將臨床失敗的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)降低 50%[68]；波生坦(口服內(nèi)皮素受體拮抗劑)和依前列醇(前列腺素)的聯(lián)合治療,使患者的血流動(dòng)力學(xué)、運(yùn)動(dòng)能力和功能等級(jí)都有所改善[69]?？蓪⒙?lián)合用藥的思路應(yīng)用到基因治療中。通過(guò)兩種或多種基因的轉(zhuǎn)移,可以充分利用不同基因產(chǎn)物的特性,在減少相關(guān)不良反應(yīng)發(fā)生的同時(shí)產(chǎn)生協(xié)同治療效果。

總而言之,隨著基因治療技術(shù)的不斷發(fā)展,其在PAH治療中的價(jià)值是不可忽視的,如何進(jìn)一步解決現(xiàn)有的各種問(wèn)題并開(kāi)展后續(xù)的臨床試驗(yàn),是研究工作的當(dāng)務(wù)之急。相信在不久的將來(lái),基因技術(shù)在PAH治療中的運(yùn)用能取得突破性的進(jìn)展。