劉大凱, 鄭希福, 李安石

(1. 大連市第二人民醫(yī)院關節(jié)外科,遼寧 大連 116011； 2. 大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院骨外科,遼寧 大連 116011)

膝骨性關節(jié)炎(knee osteoarthritis,KOA)是一種臨床常見的慢性、進行性膝關節(jié)軟骨疾病[1]。研究認為在膝關節(jié)損傷過程中,炎癥因子如白細胞介素1β (IL-1β)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)在軟骨細胞及細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的分解代謝中發(fā)揮重要作用,從而導致KOA的發(fā)展[2]。然而,炎癥因子如何將信號轉導到軟骨細胞并調(diào)節(jié)炎癥基因仍不清楚。鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱδ(calcium/calmodulin-dependent protein kinaseⅡdelta,Camk2d)與ECM分解和軟骨降解密切相關[3]。蛋白磷酸酶3調(diào)節(jié)亞基2(protein phosphatase 3 regulates subunit 2,Ppp3r2)可以特異性地抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metallo proteinase, MMP)的活性,維持健康軟骨內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[4]。軟骨細胞在受促炎因子刺激后,合成并分泌大量的Camk2d,同時抑制Ppp3r2的表達[5]。非甾體抗炎藥可減輕KOA的相關癥狀,但長期使用會導致某些不良反應,替代藥物仍需進一步研究[6]。目前,植物源藥物作為一種可靠、有效的KOA替代藥物已經(jīng)引起了廣泛的關注。黃芩總黃酮是從中藥黃芩中提取的主要有效成分,可以減輕炎癥反應來改善類風濕關節(jié)炎[7],但其對KOA的作用研究較少。因此,本研究觀察黃芩總黃酮對大鼠KOA軟骨組織中Camk2d和Ppp3r2表達的影響,探討黃芩總黃酮治療KOA的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠購自大連醫(yī)科大學實驗動物中心,動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(遼)2021-0010,體重(220±20)g,在環(huán)境溫度(23±2)℃、相對濕度60%～70%、光照12 h明暗交替的環(huán)境中適應性喂養(yǎng)1周后進行實驗。

1.2 主要試劑與儀器

黃芩總黃酮(南京澤郎醫(yī)藥科技有限公司)；塞來昔布(美國輝瑞制藥公司)；注射用戊巴比妥(上海上藥新亞藥業(yè)有限公司)；木瓜蛋白酶(上海藍季生物有限公司)；蘇木素染色液(上海碧云天生物技術研究所)；TNF-α、IL-1β和IL-6 ELISA試劑盒(欣博盛生物科技有限公司)；RIPA裂解液(上海生工生物工程有限公司)；Camk2d、Ppp3r2和β-肌動蛋白抗體(美國Santa Cruz公司)；HRP標記親和純化山羊抗鼠IgG二抗(武漢艾美捷科技有限公司)；ECL化學發(fā)光試劑(美國GE公司)；EG1150型包埋機、ASP300S型組織脫水機和RM2255型全自動輪轉切片機等病理配套設備(德國Leica公司)；奧林巴斯CX43顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；HBS-1096B型酶標儀(南京德鐵實驗設備有限公司)；Bio-Rad垂直電泳儀(美國BD公司)；電泳儀(北京市六一儀器廠)；MicroPublisher 成像系統(tǒng)(美國Q-IMAGING 公司)。

1.3 分組及造模

將大鼠均分為陰性對照組、模型組、黃芩總黃酮低劑量組、黃芩總黃酮中劑量組、黃芩總黃酮高劑量組和陽性對照組,每組10只。陰性對照組大鼠在第1天、第4天和第7天向膝關節(jié)腔內(nèi)注射生理鹽水(0.3 mL/只),其他組大鼠分別在相同時點向膝關節(jié)腔內(nèi)注射4%木瓜蛋白酶(0.3 mL/只)制備KOA模型。造模2周后,陰性對照組和模型組大鼠灌胃給予生理鹽水(1 mL/100 g),黃芩總黃酮低劑量組、中劑量組和高劑量組大鼠灌胃給予黃芩總黃酮,劑量分別為12.5、25和50 mg/kg[8],陽性對照組大鼠灌胃給予塞來昔布(10 mg/kg)[9],1次/d,連續(xù)14 d后進行相關檢測。

1.4 病理學觀察

麻醉處死大鼠,切開左側膝關節(jié)皮膚及皮下組織,不打開關節(jié)囊,剔除周圍的肌肉組織,通過保留脛骨端近端和股骨遠端以截取整個膝關節(jié),進行甲醛固定24 h,用乙二胺四乙酸脫鈣4周,經(jīng)脫水、包埋、切片(3 μm),進行蘇木素-伊紅(HE)染色,用顯微鏡觀察組織病理改變。按 Makin′s評分標準對膝關節(jié)病理變化進行評分,評分得分越高,病變越嚴重。

1.5 ELISA法檢測大鼠膝關節(jié)軟骨組織中TNF-α、IL-1β和IL-6含量

分離右側膝關節(jié),剪取部分關節(jié)軟骨組織,用預冷生理鹽水沖洗3次,制成勻漿,超低溫冷凍后,高壓成粉末,按1 mL/100 mg的比例加入生理鹽水,離心取上清液,然后將相應一抗稀釋至10 μg/mL,加入到96孔板中(0.1 mL/孔),4 ℃孵育過夜,洗滌3次,加上清液0.1 mL于上述反應孔中,37 ℃孵育1 h；加入新配置相對應的二抗(0.1 mL/孔),孵育1 h；加入新配置的3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺底物溶液(0.1 mL/孔)進行顯色20 min；加入0.05 mL硫酸終止反應,于450 nm處測各孔光密度(D)值,計算軟骨組織中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量。

1.6 蛋白質(zhì)印跡法檢測膝關節(jié)軟骨組織中Camk2d和Ppp3r2的蛋白表達

剪取部分關節(jié)軟骨組織,用預冷生理鹽水沖洗3次,制成勻漿,按1 mL/100 mg的比例加入RIPA裂解液,離心后取上清液,調(diào)整蛋白濃度,加入1/5體積的5×緩沖液,沸水變性,進行電泳(20 μg/孔),蛋白質(zhì)經(jīng)8% SDS-PAGE分離后轉移到PVDF膜上,然后用5%脫脂牛奶封閉,將膜與Camk2d和Ppp3r2抗體4°C孵育過夜,洗膜后與HRP標記親和純化山羊抗鼠IgG二抗孵育30 min,顯色后用MicroPublisher 成像系統(tǒng)分析蛋白條帶的灰度強度(以β-肌動蛋白作為內(nèi)參對照)。

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 各組大鼠膝關節(jié)軟骨組織HE染色結果

陰性對照組大鼠膝關節(jié)結構完整, 軟骨表面光滑；模型組大鼠膝關節(jié)軟骨纖維結締組織增生,結構不清,伴炎癥細胞浸潤；黃芩總黃酮低劑量組大鼠關節(jié)軟骨纖維結締組織增生,細胞排列無規(guī)則,炎癥細胞浸潤,但較模型組明顯改善,隨著黃芩總黃酮劑量的增加,病變改善越明顯；其中黃芩總黃酮高劑量組和陽性對照組大鼠關節(jié)軟骨結構、層次明顯改善,炎癥細胞顯著減少。見圖1。

A:陰性對照組；B:模型組；C:黃芩總黃酮低劑量組；D:黃芩總黃酮中劑量組；E:黃芩總黃酮高劑量組；F:陽性對照組

2.2 各組大鼠膝關節(jié)Makin′s評分比較

與陰性對照組比較,模型組大鼠膝關節(jié)軟骨組織Makin′s評分明顯升高(P<0.05)；與模型組相比,黃芩總黃酮各劑量組及陽性對照組大鼠軟骨組織Makin′s評分明顯降低,且黃芩總黃酮各劑量組效應呈劑量依賴性(P<0.05)；黃芩總黃酮高劑量組和陽性對照組Makin′s評分差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖2。

2.3 各組大鼠膝關節(jié)軟骨組織中TNF-α、IL-1β和IL-6含量比較

與陰性對照組比較,模型組大鼠膝關節(jié)軟骨組織中TNF-α、IL-1β和IL-6含量明顯升高(P均<0.05)；與模型組相比,黃芩總黃酮各劑量組及陽性對照組大鼠膝關節(jié)軟骨組織中TNF-α、IL-1β和IL-6含量明顯降低,且黃芩總黃酮各劑量組效應呈劑量依賴性(P<0.05)；黃芩總黃酮高劑量組和陽性對照組間各指標差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見表1。

a: P<0.05,與陰性對照組比較；b: P<0.05,與模型組比較；c: P<0.05,與黃芩總黃酮低劑量組比較；d: P<0.05,與黃芩總黃酮中劑量組比較

表1 各組大鼠膝關節(jié)軟骨組織中TNF-α、IL-1β和IL-6含量

2.4 各組大鼠膝關節(jié)軟骨組織中Camk2d和Ppp3r2蛋白表達比較

與陰性對照組比較,模型組大鼠膝關節(jié)軟骨組織中Camk2d表達水平明顯升高(P<0.05),Ppp3r2表達水平明顯降低(P<0.05)；與模型組相比,黃芩總黃酮各劑量組及陽性對照組大鼠膝關節(jié)軟骨組織中Camk2d表達水平明顯降低,Ppp3r2表達水平明顯升高,且黃芩總黃酮各劑量組效應呈劑量依賴性(P<0.05)；黃芩總黃酮高劑量組和陽性對照組間Camk2d和Ppp3r2表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖3和表2。

①:陰性對照組；②:模型組；③:黃芩總黃酮低劑量組；④:黃芩總黃酮中劑量組；⑤:黃芩總黃酮高劑量組；⑥:陽性對照組

表2 各組大鼠膝關節(jié)軟骨組織中Camk2d和Ppp3r2蛋白相對表達

3 討論

KOA是一種慢性關節(jié)炎,其特點是關節(jié)軟骨退行性變和缺乏,軟骨下骨和關節(jié)邊緣骨質(zhì)增生,表現(xiàn)為生化代謝紊亂和關節(jié)軟骨結構的損傷,局部結構軟骨損傷合并滑膜炎癥和關節(jié)囊纖維增生,最終導致膝關節(jié)疼痛、腫脹和功能障礙,可能導致殘疾[10-11]。本研究中病理結果和Makin′s評分結果均顯示,黃芩總黃酮對大鼠KOA具有治療作用,且黃芩總黃酮治療效果與塞來昔布相當,表明黃芩總黃酮對臨床治療KOA具有一定的潛力。

核轉錄因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)是一種重要的轉錄因子,在靜止狀態(tài)下,NF-κB與NF-κB抑制蛋白(nuclear factor-kappa B inhibitor,IκB)結合后以非激活狀態(tài)存在于細胞質(zhì)中。當細胞受到各種因素如IL-1β和TNF-α的刺激時,所產(chǎn)生的信號級聯(lián)反應迅速激活了細胞質(zhì)中IκB激酶的磷酸化,最終導致IκB的泛素化和隨后的降解。抑制因子IκB的降解可導致NF-κB的活化,NF-κB易位至細胞核。這一過程最終導致MMP-13的激活,這被認為是KOA治療的潛在靶點[12]。IL-1β在軟骨細胞中誘導miR-146a表達[13],同時,機械壓力損傷和滑膜或半月板分泌的促炎細胞因子可能參與了miR-146a在KOA軟骨中的誘導。 miR-146a被認為是炎癥的負調(diào)控因子,通過促進miR-146a的表達可抑制小鼠的關節(jié)破壞,而Camk2d和Ppp3r2是miR-146a的調(diào)控靶點[14]。ECM降解是導致KOA發(fā)生和發(fā)展的關鍵過程。Camk2d對軟骨ECM降解作用巨大,Camk2d與軟骨膠原溶解密切相關,軟骨膠原溶解是關節(jié)疾病中關鍵的蛋白水解事件,本質(zhì)上是不可逆的[15]。Camk2d可以通過細胞外間隙的蛋白水解來激活MMP-13。MMP-13是最有效的膠原Ⅱ降解酶,其過表達會導致關節(jié)軟骨損傷。進一步的實驗表明,骨關節(jié)炎模型大鼠膝關節(jié)軟骨組織中Camk2d水平升高[16]。體外實驗表明,IL-1β可顯著提高人軟骨肉瘤SW1353細胞中MMP-13的mRNA和蛋白水平[17]。Ppp3r2是Camk2d的抑制劑,在正常軟骨中,Camk2d和Ppp3r2之間的平衡至關重要。Ppp3r2的降低可以增加Camk2d的活性,加速ECM的降解。Ppp3r2/Camk2d平衡可被軟骨組織中的炎癥因子破壞,最終導致骨關節(jié)炎[18]。Ppp3r2在骨關節(jié)炎軟骨細胞中表達降低,導致軟骨細胞的Ppp3r2/Camk2d平衡失調(diào),Ppp3r2表達增加可緩解骨關節(jié)炎模型大鼠膝關節(jié)軟骨的病理變化[19]。本研究結果顯示,黃芩總黃酮增加KOA模型大鼠膝關節(jié)軟骨組織中Ppp3r2的蛋白表達,降低Camk2d的蛋白表達,對KOA發(fā)揮治療作用。

綜上所述,黃芩總黃酮對KOA大鼠具有治療作用,其機制可能是黃芩總黃酮增加軟骨組織中Ppp3r2表達,降低Camk2d表達,抑制了軟骨組織的炎癥反應。研究結果為黃芩總黃酮治療KOA提供了理論基礎。