陳云坤，胡春艷，張知宇，趙艷芳，曹 揮

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，山西晉中 030801）

0 引言

植物生長過程中產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物常含可抑菌、殺蟲等活性成分[1]，而植物源農(nóng)藥正是利用植物某些部位的提取物所制成的農(nóng)藥，其原藥大多為天然活性成分[2-4]。在當(dāng)前可持續(xù)發(fā)展的戰(zhàn)略背景下，推進(jìn)化學(xué)農(nóng)藥減量化以及推廣植物源農(nóng)藥的使用[5]，是貫徹由高毒到綠色、從高風(fēng)險(xiǎn)到生態(tài)安全的綠色發(fā)展理念的重要組成部分。

瑞香科是被子植物門雙子葉植物綱薔薇亞綱桃金娘目的一科，在熱帶和亞熱帶均有廣泛分布[6]，在國內(nèi)共有10屬，分別為瑞香屬(Daphne)、蕘花屬(Wikstroemia)、沉香屬(Aquilaria)、結(jié)香屬(Edgeworthia)、鼠皮樹屬(Rhamnoneuron)、毛管花屬(Eriosolena)、狼毒屬 (Stellera)、假 狼 毒 屬 (Stelleropsis)、歐 瑞 香 屬(Thymelaea)和草瑞香屬(Diarthron)，主要分布于長江流域以南，大多數(shù)種類的韌皮纖維較發(fā)達(dá)，瑞香科的10屬中瑞香屬與蕘花屬種類最多，在中國分別分布有52種和49種[7-8]。同科植物中主要成分類似主要是由于水分、光照、溫度等生長環(huán)境會(huì)對(duì)植物的形態(tài)結(jié)構(gòu)以及生理代謝造成影響[9]，在瑞香科植物中瑞香屬、狼毒屬、蕘花屬和結(jié)香屬研究較多，4屬植物中主要成分為香豆素、黃酮、萜類等化合物，且多數(shù)化合物具有顯著的生理活性[10]。

瑞香狼毒為瑞香科狼毒屬植物，在國內(nèi)已廣泛用于農(nóng)業(yè)病蟲害的防治，試驗(yàn)室前期研究表明，瑞香狼毒提取物對(duì)西瓜枯萎病原真菌以及山楂葉螨等病蟲害均有良好的生物活性，其主要成分狼毒素A對(duì)TMV的增殖擴(kuò)散也有明顯的抑制作用。筆者在瑞香科研究較多的4屬植物中，選取瑞香狼毒（狼毒屬）、南嶺蕘花（蕘花屬）、祖師麻（瑞香屬植物黃瑞香的根皮及莖皮）、芫花（瑞香屬）以及夢花（結(jié)香屬植物結(jié)香的花）5種植物作為代表，研究其乙醇提取物抑制病原真菌的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及儀器

1.1.1 儀器與試劑 氣引式粉碎機(jī)（佑崎有限公司）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀IKA（上海亞榮生化儀器廠）、超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）、恒溫培養(yǎng)箱（上海皓莊儀器有限公司）、電子天平（龍騰電子有限公司）、高壓滅菌鍋（西安儀創(chuàng)儀器設(shè)備有限公司）、葡萄糖（天津市北辰方正試劑廠）、瓊脂粉（北京索萊寶科技有限公司）。

1.1.2 供試菌株及植株 茄子枯萎(Fusarium oxysporumf.sp.)、黃瓜枯萎(Fusarium oxysporumsp.)、黃瓜炭疽(Colletotrichum orbiculare)、黃 瓜 靶 斑 (Corynesporacassiicola)、草莓紅中柱(Phytophthora fragariae)、番茄枯萎(Fusarium oxysporumf.sp.)、辣椒枯萎(Fusarium oxysporumf.sp.)所有菌種均由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理試驗(yàn)室分離鑒定并提供，供試植株名稱及部位見表1。

表1 供試植株名稱及部位

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 植物提取物的制備方法 將各種植物材料磨碎成粉末狀，各稱量800 g，將其以每瓶200 g分裝在廣口瓶中與乙醇1:2混合放置72 h初步浸提，后在30℃的條件下進(jìn)行30 min的超聲波浸提，將混合物放入真空抽濾裝置進(jìn)行分離，收集到的液體即為植物的初提物，將粉末狀物質(zhì)進(jìn)行回收分裝后再次與乙醇混合，重復(fù)以上步驟4次，混合提取液進(jìn)行濃縮，并測定濃縮后提取液的提取率及濃度（表2）。

表2 供試植物提取物提取率以及提取物濃度

1.2.2 5種植物提取物的抑菌活性測定 在超凈工作臺(tái)中利用渦旋震蕩儀將各個(gè)提取物制作成8.0、4.0、2.0、1.0、0.5、0.25 mg/mL的含藥PDA平板，以加入等體積乙醇的平板作為空白對(duì)照，每種處理重復(fù)5次。將已活化的病原真菌的菌落邊緣打孔(0.7 cm)，挑取至平板后，放入27℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。利用十字交叉法測量不同培養(yǎng)時(shí)間的菌落直徑，當(dāng)空白對(duì)照的菌落長到平板直徑的3/4處時(shí)進(jìn)行最后一次測量，并將各處理的菌落狀態(tài)拍照備用，利用DPS軟件完成毒力分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 5種瑞香科植物提取物對(duì)7種病原真菌的抑制效果

5種瑞香科植物8 mg/mL提取物對(duì)7種病原真菌的抑制效果見表3。瑞香狼毒和夢花2種提取物生物活性較強(qiáng)，對(duì)所有病原菌的抑制效果在8 mg/mL下達(dá)到100%。所有瑞香科植物提取物在8 mg/mL時(shí)對(duì)番茄枯萎和黃瓜炭疽的抑制率都達(dá)到了100%，南嶺蕘花提取物對(duì)其余5種病原真菌的抑制率沒有達(dá)到100%，但大部分接近90%。綜合來看，瑞香科提取物對(duì)黃瓜靶斑的抑制率低，均為所有病原真菌中最差，但都不低于65%。

表3 5種瑞香科8 mg/mL提取物對(duì)7種病原菌絲生長的抑菌效果

如圖1，茄子枯萎菌在96 h時(shí)CK長到約平板的3/4處，此時(shí)夢花與瑞香狼毒提取物在8 mg/mL對(duì)菌落的抑制率為100%，祖師麻、芫花提取物在高濃度下抑制率較差，均小于90%。隨著濃度的降低各提取物對(duì)菌落的抑制效果也每況愈下，但在中濃度2 mg/mL時(shí)夢花提取物的表現(xiàn)最佳，其抑制率仍在80%以上。低濃度0.5 mg/mL時(shí)芫花和瑞香狼毒的表現(xiàn)較好，抑制率均高于20%。

圖1 不同濃度瑞香科植物提取物對(duì)茄子枯萎的菌落抑制效果

如圖2，茄子枯萎菌在120 h時(shí)CK長到約平板的3/4處，此時(shí)在高濃度8、4 mg/mL下，夢花與瑞香狼毒提取物的表現(xiàn)最好，抑制率均達(dá)到了100%，在中濃度2 mg/mL時(shí)2種提取物也保持著較好的抑制效果，但夢花提取物的抑菌表現(xiàn)略好于瑞香狼毒提取物。低濃度時(shí)夢花提取物的表現(xiàn)逐漸變差，但瑞香狼毒的抑制率在所有提取物中表現(xiàn)最佳，在0.5 mg/mL時(shí)抑制率仍接近30%。

圖2 不同濃度瑞香科植物提取物對(duì)黃瓜枯萎的菌落抑制效果

黃瓜炭疽病原菌在96 h時(shí)CK長到約平板的3/4處，此時(shí)在高濃度8 mg/mL時(shí)，所有提取物的抑菌效果均為100%，由圖3可知，隨著提取物濃度的降低，瑞香狼毒提取物的抑制率保持著較高的水平。其余4種提取物的表現(xiàn)較為均衡，都有著不錯(cuò)的抑菌效果，尤其是夢花提取物在4 mg/mL時(shí)的抑菌率仍為100%。

圖3 不同濃度瑞香科植物提取物對(duì)黃瓜炭疽的菌落抑制效果

如圖4，黃瓜靶斑病原菌在120 h時(shí)CK長到約平板的3/4處，在高濃度8 mg/mL下瑞香狼毒與夢花提取物的抑制率均為100%，但隨著濃度的降低，夢花提取物的抑制效果大幅減弱。芫花與祖師麻提取物在高濃度時(shí)表現(xiàn)不太理想，但是濃度的降低并未對(duì)其抑菌率產(chǎn)生大幅影響，在最低濃度時(shí)2種提取物的抑菌率仍大于30%。所有提取物中，南嶺蕘花的表現(xiàn)較差，在低濃度時(shí)基本沒有抑菌效果。

圖4 不同濃度瑞香科植物提取物對(duì)黃瓜靶斑的菌落抑制效果

草莓紅中柱病原菌在120 h時(shí)CK長到約平板的3/4處，由圖5可明顯看出南嶺蕘花提取物的抑菌效果不佳，在高濃度4 mg/mL下的抑制率僅為30%。最低濃度時(shí)瑞香狼毒和祖師麻提取物的抑菌率較高，均高于20%，夢花提取物雖然在低濃度時(shí)表現(xiàn)不理想但在高濃度時(shí)的抑菌效果較好，僅次于瑞香狼毒提取物。

圖5 不同濃度瑞香科植物提取物對(duì)草莓紅中柱的菌落抑制效果

由圖6可知，辣椒枯萎病菌在120 h時(shí)CK長到約平板的3/4處，除南嶺蕘花外其余提取物在8 mg/mL時(shí)的抑制率均為100%，中濃度1 mg/mL時(shí)，夢花、祖師麻提取物的抑菌效果迅速變差，但瑞香狼毒提取物的抑菌率仍在較高水平，當(dāng)濃度降低至0.5 mg/mL時(shí)，僅瑞香狼毒提取物的抑菌率達(dá)到30%以上。

圖6 不同濃度瑞香科植物提取物對(duì)辣椒枯萎的菌落抑制效果

由圖7可知，番茄枯萎在96 h時(shí)CK長到約平板的3/4處，在高濃度時(shí)夢花與瑞香狼毒提取物的表現(xiàn)最佳，隨著濃度的降低瑞香狼毒提取物仍有著較好的表現(xiàn)，而夢花提取物的抑制效果出現(xiàn)斷崖式下跌，芫花提取物在低濃度0.5、0.25 mg/mL時(shí)的抑制效果僅次于瑞香狼毒。

圖7 不同濃度瑞香科植物提取物對(duì)番茄枯萎的菌落抑制效果

2.2 5種瑞香科植物提取物對(duì)7種病原真菌的毒力測定

由表4～8綜合來看，在對(duì)茄子枯萎菌、黃瓜炭疽和番茄枯萎的毒力測定中，瑞香狼毒與夢花在所有提取物中效果最好，EC50值均小于0.81 mg/mL，祖師麻提取物對(duì)黃瓜靶斑與草莓紅中柱的抑制率在所有提取物中最強(qiáng)，EC50值為0.92 mg/mL左右，夢花對(duì)草莓紅中柱的抑制活性次之，其EC50值為0.983 mg/mL。芫花提取物對(duì)黃瓜靶斑的抑制作用僅次于祖師麻，但對(duì)茄子枯萎與黃瓜枯萎的抑制效果在所有提取物中最弱，EC50值分別為1.141、2.259 mg/mL。對(duì)于黃瓜枯萎和辣椒枯萎來說，抑制作用最強(qiáng)的分別是夢花與瑞香狼毒的提取物，EC50值為0.754、0.736 mg/mL。南嶺蕘花相對(duì)于其他提取物來說表現(xiàn)不佳，對(duì)黃瓜靶斑、草莓紅中柱、番茄枯萎、辣椒枯萎4種菌的抑制活性均為所有提取物中最弱，EC50值分別為2.182、2.710、1.065、1.950 mg/mL。

表4 瑞香狼毒提取物對(duì)7種病原真菌的毒力測定

表5 南嶺蕘花提取物對(duì)7種病原真菌的毒力測定

表6 祖師麻提取物對(duì)7種病原真菌的毒力測定

3 結(jié)論與討論

中國有著十分悠久的中藥文化，在人們對(duì)綠色食品日益增長的需求中以及國家政策等力量的推動(dòng)下，利用植物中活性成分制成的植物源農(nóng)藥，已成為當(dāng)今熱門的研究[11]。

本試驗(yàn)所選取的瑞香科植物為落葉或常綠灌木或小喬木，其中許多植物均有藥用價(jià)值。在中藥中，瑞香狼毒、狼毒大戟或月腺大戟的干燥根均可作為狼毒入藥，具有止痛、抗病毒、抗癲癇等多種功效[12]，對(duì)大腸桿菌、同心性毛癬菌等人源細(xì)菌、真菌也有良好的抑制效果[13]。且瑞香狼毒提取物對(duì)番茄晚疫病菌、玉米大斑病菌、辣椒疫霉菌[14]、小麥赤霉病菌和黃瓜枯萎菌[15]等多種植物病原真菌有良好的生物活性，研究表明黃酮和香豆素類化合物為其主要的抑菌活性物質(zhì)[16]。本試驗(yàn)中，瑞香狼毒在5種瑞香科植物提取物中表現(xiàn)良好，在8、4 mg/mL時(shí)的抑制效果大多都達(dá)到了100%，對(duì)茄子枯萎、番茄枯萎和辣椒枯萎3種枯萎菌的抑制中濃度均小于0.90 mg/mL。

表7 芫花提取物對(duì)7種病原真菌的毒力測定

表8 夢花提取物對(duì)7種病原真菌的毒力測定

南嶺蕘花又名了哥王，耐干旱，生于山坡的路旁或荒草地中[17]，黃酮類、香豆素類等為其主要次生代謝成分[18]。有學(xué)者研究表明，了哥王乙酸乙酯提取部位具有廣譜的抑制細(xì)菌活性[19]，且具有較好的鎮(zhèn)痛抗炎效果[20]。此外，了哥王中分離的許多活性成分（如西瑞香素、芫花素等）具有明顯的抗腫瘤活性，對(duì)消炎、抗病毒以及改善心肌血流量等也有良好的功效[21]。查閱資料發(fā)現(xiàn)，南嶺蕘花對(duì)真菌，尤其是對(duì)病原真菌的抑制效果及機(jī)理方面的研究較少，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)南嶺蕘花在5種瑞香科植物提取物中表現(xiàn)最差，但對(duì)番茄枯萎和黃瓜炭疽的抑制效果良好，在高濃度下抑制率達(dá)到了100%，且EC50值均小于1.10 mg/mL，具有一定的研究價(jià)值。

祖師麻主要由瑞香科植物黃瑞香、陜甘瑞香及凹葉瑞香的根皮及莖皮組成，長白瑞香及結(jié)香均可作中藥祖師麻入藥[22]，主要成分為香豆素類、黃酮類、木脂素類等化合物[23]，在民間被廣泛用于治療跌打損傷、風(fēng)濕和支氣管炎等癥狀[24]，也具有較好的抗炎、鎮(zhèn)痛以及抗腫瘤活性[25-26]。有研究表明，黃瑞香的水提物對(duì)小麥條銹病菌的抑制作用良好[27]，其乙醇提取物對(duì)小麥紋枯病菌和小麥赤霉菌有顯著的抑制效果，且具有良好的熱穩(wěn)定性[28]。本試驗(yàn)中祖師麻的抑菌效果良好，尤其是對(duì)黃瓜靶斑和草莓紅中柱2種病原菌的抑制作用尤為顯著，EC50值均小于0.93 mg/mL，但對(duì)枯萎菌的生物活性在5種瑞香科植物提取物中沒有明顯的優(yōu)勢。

芫花在國內(nèi)分布廣泛，常用作中藥，有治療痰飲積聚、氣逆喘咳之效，其化學(xué)成分結(jié)構(gòu)多變，具有極大的研究意義[29]。現(xiàn)代藥理試驗(yàn)顯示芫花具有抗腫瘤、抗炎等多種活性[30-31]。Tadataka等[32]從芫花中分離出4種黃酮類化合物，其中木犀草素和芹菜素2種化合物具有很強(qiáng)的抗氧化活性。賈俐莉[33]通過流式細(xì)胞技術(shù)發(fā)現(xiàn)，了哥王、芫花和黃芫花的醇提物均對(duì)HIV-1潛伏感染有再激活作用。研究表明芫花的乙醇提取物對(duì)小麥全蝕病菌、辣椒疫霉病菌和番茄灰霉病表現(xiàn)出較好的持續(xù)抑菌效果[34]。本試驗(yàn)中芫花對(duì)4種枯萎病的抑制活性較差，但對(duì)其余3種病原菌的抑制中濃度均小于1.1 mg/mL。

結(jié)香與其他樹種相比，易種植且有很強(qiáng)的抗病蟲害能力，目前尚未發(fā)現(xiàn)被病蟲危害現(xiàn)象[35]。據(jù)目前國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道，從結(jié)香的根莖及花中分離的化合物主要包括有機(jī)酸、黃酮類、香豆素類及香氣化合物等[36]。結(jié)香花蕾與中藥材密蒙花的性狀以及藥用價(jià)值較為相似，所以常被作為密蒙花的替代品。韓佳[37-38]通過乙醇浸泡回流，后經(jīng)石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取后，發(fā)現(xiàn)各萃取物對(duì)大腸桿菌、金色葡萄球菌、產(chǎn)氣桿菌、枯草芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌均有不同程度的抑制作用，且結(jié)香花的提取物具一定的抗氧化活性，與其總黃酮含量呈顯著的濃度依賴性。近年來，隨著人們對(duì)結(jié)香化學(xué)成分的提取、分離與結(jié)構(gòu)鑒定，以及對(duì)其提取物的藥理藥效試驗(yàn)研究的深入，結(jié)香在醫(yī)藥、食品、化妝品等領(lǐng)域已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展[39]，但與南嶺蕘花、祖師麻、芫花類似，在抑制病害真菌方面的研究較少。本試驗(yàn)中，夢花提取物對(duì)茄子枯萎、黃瓜枯萎、番茄枯萎的抑制效果最佳，且在較高的濃度下對(duì)7種病原菌的抑制作用都接近100%。綜上所述，夢花與瑞香狼毒在供試的5種植物材料中抑菌效果最佳，尤其是在抗枯萎病方面，夢花有著極高的研究價(jià)值。

本試驗(yàn)采用菌絲生長速率法研究了瑞香狼毒、南嶺蕘花、祖師麻、芫花以及夢花5種瑞香科植物提取物對(duì)7種病原真菌的抑菌活性，旨在尋找出一類有潛力的植物資源用以防治植物病害。結(jié)果表明5種瑞香科提取物針對(duì)不同病原真菌普遍都有較好的抑菌活性，其中夢花與瑞香狼毒的提取物在針對(duì)各種枯萎菌的抑制中，有著突出的表現(xiàn)。雖然南嶺蕘花在所有供試提取物中表現(xiàn)最差，但除了抑制黃瓜靶斑、草莓紅中柱兩種病原菌的效果欠佳，對(duì)其余5種病原真菌的抑制中濃度均小于2 mg/mL。瑞香科植株生境相似，其次生代謝活性成分也普遍為黃酮類、香豆素類等，甚至有些同科植物在中藥學(xué)中可以同等入藥，結(jié)合本試驗(yàn)結(jié)果表明，瑞香科植物有成為防治植物病原真菌的新型植物源農(nóng)藥的潛力。