楊文靜，王占軍，甘曉燕，何建龍，張 麗

（1寧夏農(nóng)林科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心，銀川 750002；2寧夏農(nóng)林科學(xué)院荒漠化治理研究所，銀川 750002）

0 引言

歐李(Cerasus humilis)是薔薇科櫻屬矮生櫻亞屬灌木，是中國(guó)特有的古老野生樹(shù)種。植株高0.4～1.5 m，花葉同開(kāi)，花期4—5月，果期6—10月。產(chǎn)于黑龍江、吉林、遼寧、內(nèi)蒙古等地[1]。抗干旱、耐瘠薄、適應(yīng)能力強(qiáng)，可在沙漠、荒山、鹽堿地栽植[2]；集果、仁、葉、花等綜合利用于一身，在醫(yī)藥、保健、食品、防風(fēng)固沙、美化環(huán)境等多方面具有顯著的生態(tài)、保健、藥用、觀賞價(jià)值，是將生態(tài)效益與經(jīng)濟(jì)效益有效結(jié)合的典范[3-4]。歐李果實(shí)香氣濃郁，口味獨(dú)特，不僅含有豐富的糖、蛋白質(zhì)、維生素C等活性物質(zhì)，還因其鈣含量高而被稱為“鈣果”[5-8]。果仁中含有大量具有鎮(zhèn)痛止咳和抗炎作用的苦杏仁甙而作為一種常用中藥[9]。歐李生長(zhǎng)勢(shì)旺，莖葉柔軟，葉量大，莖葉均無(wú)刺，富含糖、蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，可作為牛羊優(yōu)質(zhì)飼料的來(lái)源[10-11]。其根系發(fā)達(dá)，具抗旱、耐貧瘠的特性，是防風(fēng)固沙、保持水土的優(yōu)良樹(shù)種[12-13]。所以，歐李全株可開(kāi)發(fā)，具有很高的綜合開(kāi)發(fā)利用價(jià)值和良好的發(fā)展前景。

植物組織培養(yǎng)技術(shù)具有繁殖率高、生長(zhǎng)周期短、管理便捷以及保持母本優(yōu)良性狀等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于各大花卉生產(chǎn)基地及科學(xué)研究領(lǐng)域。歐李通常以異花授粉為主，種子育苗變異系數(shù)非常大，扦插會(huì)受到季節(jié)和溫度的影響，所以，組織培養(yǎng)是有效實(shí)現(xiàn)商業(yè)化生產(chǎn)的最佳路徑。1994年錢國(guó)珍等[14]就以嫩莖和葉誘導(dǎo)愈傷組織，愈傷組織再分化誘導(dǎo)不定芽開(kāi)始了歐李組培繁殖的研究，并分別篩選了葉和莖段誘導(dǎo)愈傷組織的最適培養(yǎng)基，認(rèn)為葉愈傷組織誘導(dǎo)以MS+1.2 mg/L NAA+0.16 mg/L BA效果最好；莖段愈傷組織誘導(dǎo)以MS+0.4 mg/L 2,4-D+0.08 mg/L ZT效果最好；誘導(dǎo)不定芽的最適培養(yǎng)基是1/4MS+2 mg/L ZT。其后，越來(lái)越多的研究者對(duì)不同品種歐李組織培養(yǎng)體系進(jìn)行優(yōu)化。杜國(guó)榮[15]以葉片為外植體、李勁等[16]以莖葉為外植體經(jīng)愈傷組織誘導(dǎo)、焦淑華等[17]以綠枝為外植體、王正德等[18]以幼莖為外植體，研究了不同外植體的再生效率，目前認(rèn)為，新生帶有腋芽的幼嫩莖段作為外植體能夠獲得較好的再生效率。賈海燕等[19]以‘京歐1號(hào)’、‘京歐2號(hào)’為材料的研究認(rèn)為，誘導(dǎo)最適培養(yǎng)基為MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA；最適繼代擴(kuò)繁培養(yǎng)基‘京歐1號(hào)’為MS+0.5 mg/L6-BA+0.1 mg/LNAA，‘京歐2號(hào)’為MS+0.1 mg/L6-BA+0.1 mg/LNAA；較適宜生根培養(yǎng)基‘京歐1號(hào)’為1/2MS+0.2 mg/L NAA+0.5 mg/L IAA，‘京歐2號(hào)’為1/2MS+0.1 mg/L NAA+1.0 mg/L IAA。孫曉麗[20]以‘歐李2號(hào)’增殖培養(yǎng)階段試管苗為試材，篩選認(rèn)為最適增殖培養(yǎng)基為MS+0.2 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA+6 g/L瓊脂+40 g/L蔗糖。劉天牧等[21]以歐李‘大磨盤(pán)’為材料的研究認(rèn)為，適宜啟動(dòng)培養(yǎng)的生長(zhǎng)素為IBA，并篩選得到最佳叢生芽培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA+0.2 mg/L IBA，最佳分化培養(yǎng)基是MS+0.5 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA+0.2 mg/L IBA，最佳生根培養(yǎng)基是1/2MS+0.5 mg/L IBA+0.1 mg/L NAA。這些研究都表明，在歐李分化和增殖階段6-BA是關(guān)鍵的激素。其中，劉天牧等[22]篩選的擴(kuò)繁培養(yǎng)基將歐李繁育速度提高了20倍，并申報(bào)科技成果，為歐李推廣應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。本研究針對(duì)目前歐李種苗品種混雜、質(zhì)量良莠不齊等現(xiàn)狀，人工繁育存在再生頻率低、生根難、移栽成活率低等技術(shù)瓶頸，通過(guò)外植體的處理、分化、生根等階段的培養(yǎng)，篩選最適基本培養(yǎng)基、激素配比和濃度，確定歐李3個(gè)品種（系）的再生體系，以期為歐李高效快速規(guī)?；敝程峁┘夹g(shù)性支持。

1 材料與方法

1.1 材料

寧夏農(nóng)林科學(xué)院枸杞所田間種植的3個(gè)歐李優(yōu)良種質(zhì)資源SN6、SN7、YC24。

1.2 方法

1.2.1 材料表面消毒和接種 田間剪取歐李苗木上部嫩枝，流水沖洗10 min，置于無(wú)菌操作臺(tái)，75%乙醇浸泡30 s后，立刻用無(wú)菌水漂洗3～4次；0.1%升汞浸泡8 min，再用無(wú)菌水漂洗5～6次；接著用無(wú)菌濾紙吸干嫩枝多余水分，剪成含有2個(gè)腋芽以上的莖段（莖段長(zhǎng)為2～5 cm），最后接種到培養(yǎng)基上，在貫流組培箱培養(yǎng)。

1.2.2 培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基制備 培養(yǎng)溫度為(25±2)℃，光照條件16 h黑暗/8 h光照，光照強(qiáng)度2000 lx。

（1）分化培養(yǎng)基。4.42 g/LMS、30 g/L蔗糖、4.5 g/L瓊脂，添加4種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑構(gòu)成4種不同分化培養(yǎng)基，如表1，調(diào)節(jié)pH 5.8左右。每個(gè)處理重復(fù)3次，40天后觀察分化情況并統(tǒng)計(jì)分化率[式(1)]和分化系數(shù)[式(2)]。

表1 分化培養(yǎng)基激素組合

（2）生根培養(yǎng)基。4.42 g/L1/2MS、30 g/L蔗糖、4.5 g/L瓊脂，添加3種不同的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和1種附加物，配制11種生根培養(yǎng)基，如表2，調(diào)節(jié)pH 5.8左右。每個(gè)處理重復(fù)3次，40天后觀察生根情況并統(tǒng)計(jì)生根率[式(3)]。

表2 生根培養(yǎng)基激素組合

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 選用SPSS 13.0 One-Way ANOVE程序完成數(shù)據(jù)采集，用Duncan檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗生素濃度對(duì)歐李外植體內(nèi)生菌的影響

植物組織培養(yǎng)中，內(nèi)生菌造成的污染是影響植物再生體系建立的重要限制因素。為有效消除歐李外植體內(nèi)生菌，提高成活率，減少污染率，在培養(yǎng)基中添加4種不同濃度的頭孢霉素。如表3，隨著頭孢霉素濃度的提高，外植體的污染率逐漸降低，成活率顯著提高。頭孢霉素濃度為100 mg/L時(shí)，外植體成活率最高，污染率最低。

表3 頭孢霉素濃度對(duì)歐李外植體內(nèi)生菌的影響

2.2 歐李的分化培養(yǎng)

將消毒滅菌后的莖段外植體接種于不同激素組合的培養(yǎng)基中分化培養(yǎng)。10天后腋芽部形成幼小再生株系，40天后形成叢生芽（圖1）。統(tǒng)計(jì)不同品種在不同激素組合上的分化率，結(jié)果如圖2。激素組合1和2在3個(gè)品種中的分化率都較好，其中2號(hào)組合表現(xiàn)最佳。就品種而言，YC24的分化率最高，SN6次之，SN7最低。根據(jù)結(jié)果，認(rèn)為2號(hào)激素組合是適宜本地種植的3個(gè)優(yōu)良種質(zhì)的最佳分化培養(yǎng)基。

圖1 分化培養(yǎng)過(guò)程

圖2 3個(gè)歐李品種在不同激素組合培養(yǎng)基上的分化情況

2.3 分化周期對(duì)歐李增殖的影響

將歐李繼代培養(yǎng)于篩選出的分化培養(yǎng)基中，培養(yǎng)時(shí)間設(shè)置為20、25、30、35、40、45天，各處理連續(xù)繼代5次，觀察統(tǒng)計(jì)繼代周期對(duì)歐李增殖分化影響。結(jié)果（圖3）表明，隨著繼代周期的延長(zhǎng)，叢生芽苗的生長(zhǎng)勢(shì)增強(qiáng)，繼代周期為30～35天的芽苗的生長(zhǎng)分化速度最快。繼代超過(guò)40天，芽的生長(zhǎng)速度明顯減慢。因此，確定芽苗在增殖過(guò)程中繼代周期以30～35天為宜。

圖3 不同繼代周期對(duì)增殖培養(yǎng)影響

2.4 歐李的生根培養(yǎng)

將分化培養(yǎng)所得的組培苗接種于生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，10天左右可觀察到白色不定根，40天左右根系較發(fā)達(dá)、分支多（圖4）。各培養(yǎng)基的生根率如表4，激素組合6號(hào)和7號(hào)在3個(gè)品種中的生根率較其他組合有顯著差異。其中SN6的最高生根率可達(dá)67.0%，SN7和YC24最高生根率為33.1%、30.0%。因此，認(rèn)為3號(hào)激素組合培養(yǎng)基是SN6的最適生根培養(yǎng)基，但SN7和YC24生根效果不理想。

圖4 生根培養(yǎng)過(guò)程

表4 3個(gè)歐李品種在不同激素組合培養(yǎng)基上的生根率 %

2.5 矮壯素對(duì)歐李生長(zhǎng)的影響

針對(duì)優(yōu)良品系SN7和YC24組培過(guò)程中生根速度慢、生根率低、苗細(xì)弱等問(wèn)題，以生根率較高的6號(hào)激素組合生根培養(yǎng)基為對(duì)照，設(shè)計(jì)添加3種不同濃度的矮壯素(CCC)處理，30天后觀察統(tǒng)計(jì)不同處理對(duì)優(yōu)良品種（系）生根情況。結(jié)果表明，添加CCC后，歐李株高顯著降低，莖稈表現(xiàn)較未加CCC粗壯，葉片顯著增大（圖5）；隨著CCC濃度的增加，生根率呈現(xiàn)先提高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)CCC濃度達(dá)到15 mg/L時(shí)，對(duì)歐李生根具有顯著的促進(jìn)作用，YC24、SN7生根率分別達(dá)到53.3%和46.7%，分別較對(duì)照提高了23.3和13.7個(gè)百分點(diǎn)（表5）。綜上，初步篩選獲得了適合歐李優(yōu)良品種（系）壯苗與生根一步培養(yǎng)的培養(yǎng)基。

圖5 矮壯素對(duì)生長(zhǎng)的影響

表5 矮壯素對(duì)歐李優(yōu)良品種組培苗生長(zhǎng)指標(biāo)的影響

3 結(jié)論

研究明確了不同抗菌素濃度對(duì)3個(gè)歐李優(yōu)良品種（系）內(nèi)生菌的抑制效果，有效降低了外植體污染率。篩選獲得適宜歐李分化與增殖培養(yǎng)的激素組合和分化周期，3個(gè)優(yōu)良品種（系）分化系數(shù)均達(dá)14以上。在明確11種激素組合對(duì)歐李生根培養(yǎng)影響的基礎(chǔ)上，針對(duì)YC24等優(yōu)系生根率低、速度慢等問(wèn)題，篩選獲得了生根壯苗一步培養(yǎng)基，使組培苗生根率由25.0%提高至53.3%。

試驗(yàn)通過(guò)探索外植體表面消毒、分化和生根的最適培養(yǎng)基和濃度，建立了歐李嫩枝快速繁殖體系，確定了適宜本地種植的3個(gè)優(yōu)良種質(zhì)的最適培養(yǎng)基和激素濃度。為優(yōu)良種質(zhì)的后續(xù)練苗移栽、擴(kuò)大培養(yǎng)和推廣應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

4 討論

利用植物組織培養(yǎng)與快繁技術(shù)，可以在很短時(shí)間內(nèi)建立高效的快速繁殖體系，但是在離體快繁過(guò)程中，特別是初代啟動(dòng)培養(yǎng)過(guò)程中，外植體的帶菌狀況會(huì)直接影響培養(yǎng)體系的建立，所以有必要對(duì)采自田間的外植體消毒滅菌。目前關(guān)于外植體的消毒研究主要集中在消毒劑的選擇與消毒時(shí)間探索[23-25]，本試驗(yàn)在結(jié)合前人探索的基礎(chǔ)上，在初代培養(yǎng)過(guò)程中加入100 mg/L頭孢霉素，進(jìn)一步降低了污染率、提高了成活率，為無(wú)菌培養(yǎng)體系奠定了基礎(chǔ)。

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)植物細(xì)胞的分裂、分化產(chǎn)生影響。一定濃度配比的細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素對(duì)叢生芽的誘導(dǎo)、增殖和生根發(fā)揮著重要作用[26]。分化培養(yǎng)階段，細(xì)胞分裂素IBA的存在較生長(zhǎng)素NAA有更高的分化率，說(shuō)明細(xì)胞分裂素在歐李外植體分化階段起著至關(guān)重要的作用。而較高濃度的細(xì)胞分裂素ZT與IBA的組合使用，能夠獲得更高的分化率。IBA濃度與梁偉玲[27]的結(jié)果相同，不同之處在于本試驗(yàn)添加ZT獲得了更高的分化率。生根培養(yǎng)階段，較低濃度的IBA有利于根形成，這與杜艷豐[28]1.0 mg/L IBA是最適生根濃度的結(jié)果不同。這可能是由于歐李品系不同，枝條生長(zhǎng)特性有差異。適當(dāng)濃度的生長(zhǎng)素NAA能夠促進(jìn)生根率提高，表明生長(zhǎng)素有利于根的生成，這與邢一帆[29]在其研究中生根培養(yǎng)階段NAA具有關(guān)鍵作用的結(jié)論一致。生根培養(yǎng)時(shí)加入少量活性炭，能夠防止褐變，并通過(guò)創(chuàng)造黑暗環(huán)境和吸附非極性物質(zhì)和色素等有害物質(zhì)而有利于生根[30]。但活性炭的濃度加入超過(guò)1.0 g/L時(shí)，會(huì)使外植體變黃，逐漸枯死。許建蘭[31]在以Damas1869李腋芽為材料的研究中，加入0.05%活性炭獲得了最佳的生根效率。本試驗(yàn)中加入0.2 g/L獲得了較好的生根率。趙文魁[32]的研究表明，適量濃度的矮壯素對(duì)馬鈴薯脫毒試管苗有較好的生根壯苗效果。在木本植物楊樹(shù)的組培過(guò)程中添加適量濃度的矮壯素能夠促進(jìn)其生根并提高移栽成活率[33]。本試驗(yàn)中篩選得出歐李優(yōu)良品種的最適矮壯素添加濃度為15 mg/L。

本試驗(yàn)以引進(jìn)和自育的歐李優(yōu)良品種（品系）為研究對(duì)象，通過(guò)系統(tǒng)研究芽誘導(dǎo)、增殖、生根等組織培養(yǎng)中關(guān)鍵環(huán)節(jié)，建立高效的組培快繁技術(shù)體系，為歐李快速規(guī)?；庇峁┘夹g(shù)支撐。其中歐李組培苗生根培養(yǎng)是工廠化種苗繁育的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，針對(duì)歐李生根速度慢、生根率的問(wèn)題，通過(guò)調(diào)整生根培養(yǎng)基中生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素配比，添加附加物等方法，篩選獲得了生根壯苗一步培養(yǎng)法，有效縮短了生根時(shí)間，大幅提高了生根率，為歐李組培高效快繁體系的建立提供了參考。