秦智 周敏 王曉昆

探討在SD大鼠NAFLD模型建造前，對其實施亞低溫狀態(tài)下游泳運動干預，實驗研究預防NAFLD的效果和機制。方法：40只SD大鼠隨機分為對照組（control，C）、高脂組（fat，F）、亞低溫游泳高脂組（hypothermia swimming fat，HS）和常溫游泳高脂組（temperature swimming fat，TS），每組各10只。第0-5周，各組統一給予普通飼料喂養(yǎng)，TH和TS組實施游泳運動干預。第6-10周，F、HS和TS組采用高脂飼料喂養(yǎng)建造NAFLD動物模型，C組繼續(xù)給予普通飼料喂養(yǎng)。第10周結束，處死各組SD大鼠，檢測肝臟組織中MDA、SOD、GSH和Caspase-3、Caspase-12、TNF-α、IL-6、HSP70的表達。MDA、Caspase-3、Caspase-12、TNF-α和IL-6五項指標，F組比C組顯著升高（p<0.05）;HS組則有顯著性降低（p<0.05）;TS組MDA、Caspase-3和Caspase-12相比F組均有降低，但是無顯著性差異（p>0.05），TNF-α和IL-6相比F組均出現顯著性降低（p<0.05）。F組GSH和SOD比C組有非常顯著性降低（p<0.01），HS組比F組顯著上升（p<0.05），TS組比F組升高，但是均無顯著性差異（p>0.05）。結論：5周亞低溫狀態(tài)下游泳干預組相比常溫游泳組SD大鼠NAFLD動物模型更具有顯著性預防或減輕非酒精性脂肪肝發(fā)生的效果。

隨著人類生活水平提高和運動的減少，非酒精性脂肪肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）在全球高發(fā)，其平均發(fā)病率20%左右。臨床上，針對NAFLD的治療仍然缺乏特效藥。21世紀，我國的衛(wèi)生服務將屬于衛(wèi)生保健型體制，突出預防為主和群眾性的自我保健，許多醫(yī)院都開設了未病科。探討預防NAFLD機制的研究是運動醫(yī)學研究領域最受關注的熱點之一。近年來，研究表明：低溫具有抗炎、鎮(zhèn)痛和提高免疫力等功能。亞低溫狀態(tài)特指：動物直腸溫度維持在33℃左右，比常溫動物直腸溫度平均相差3～4℃。整合應用亞低溫狀態(tài)聯合有氧運動或許成為預防NAFLD的有效手段。本研究采用在SD大鼠NAFLD模型建造過程前，通過觀察亞低溫狀態(tài)5周游泳運動預防非酒精性脂肪肝大鼠肝組織勻漿各項指標的變化，旨在探討研究預防NAFLD 的方法，為探尋預防NAFLD有效措施研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 NAFLD動物模型的建造

借鑒美國Charles等研究和預實驗結果，本實驗采用高脂液體飼料喂養(yǎng)SD大鼠（供給能量分別為脂肪71%，碳水化合物11%，蛋白18%），5周后取材制備肝組織切片HE染色，完成NAFLD動物造模。

1.2 實驗動物與分組

實驗動物：3月齡SPF級雄性Sprague-Dawley （SD）大鼠40只，體重200±20（g），由廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（粵）2008-0002粵監(jiān)證字2008D007。每籠4-5只，飼養(yǎng)溫度20±2℃，濕度55%左右。大鼠適應性飼養(yǎng)（普通飼料）一周后，隨機分為對照組（control，C）、高脂組（fat，F）、亞低溫游泳高脂組（hypothermia swimming fat，HS）和常溫游泳高脂組（temperature swimming fat，TS），每組各10只。第0-5周，各組統一給予普通飼料喂養(yǎng)，HS組和TS組實施游泳運動干預。第6-10周，F、TH和TS組采用高脂飼料喂養(yǎng)建造NAFLD動物模型，C組繼續(xù)給予普通飼料喂養(yǎng)。在實驗開始之前（第0周）、5周游泳干預結束之后（第5周），以及第6-10周NAFLD模型建造結束后（第10周）分別對各組大鼠進行稱重，并觀察了其運動和生活的一般狀態(tài)。

1.3 游泳運動強度設置方案

本研究游泳方式為無負重，游泳場地為內壁光滑的大水桶，水桶高為70cm，直徑60cm，水深55cm。每次每桶5只大鼠進行游泳運動，確保每只大鼠的游泳面積均大于500cm2。HS組水溫28±1℃，TS組水溫33±1℃。參照Iemitsu Motoyuki等的實驗模型結合預實驗結果設置本研究運動強度方案：HS和TS組大鼠第一天開始進行泳訓練15min，在1周內逐漸增加至每天1小時的游泳運動，每周6天，共計5周的游泳運動時間。訓練過程中，HS和TS組各有1只大鼠溺水死亡，解剖尸體診斷無其他疾病，故第10周末，HS和TS組的樣本量均為9只。

1.4 亞低溫設置方案與監(jiān)測設備

參照于立君等文獻結合課題組預實驗結果，設置HS組大鼠直腸溫度維持在33℃左右 ，而TS組大鼠肛溫維持在37℃左右，兩組大鼠間肛溫平均相差3～4℃。因此，設置室內溫度為30±1℃、常溫水溫度為33±1℃、亞低溫干預水溫度為28±1℃。

1.5 肝組織勻漿指標測試

第10周末，各組大鼠禁食12h后處死取材。將肝組織制成10%組織勻漿，取上清備用。按照試劑盒說明書：肝組織丙二醛（MDA）采用硫代巴比妥酸法，超氧化物歧化酶（SOD）采用黃嘌呤氧化酶法，谷胱甘肽過氧化物酶（GSH）采用比色法測試。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-12（Caspase-12）采用固相夾心法酶聯免疫吸附實驗（ELISA）測試，腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白細胞介素-6（IL-6）采用雙抗體夾心ELISA法測試。

1.6 統計學分析

實驗數據用均數±標準差（M±SD）表示，組間比較采用t檢驗，各均值用多個Independent-Samples T Test;關聯度高的反映同功能的生理指標則采用Paired-Samples T Test 處理，顯著性差異為P<0.05，非常顯著性差異為P<0.01。

2 實驗結果

2.1 各組體重的變化

第0周和第5周各組之間體重無明顯差異（見表1）。第10周，F組體重比C組明顯上升P<0.05，HS和TS組體重比F組呈顯著性下降P<0.05。各組大鼠在NAFLD造模前精神狀態(tài)和活動度均良好，且無明顯差異。第6-10周，隨著NAFLD造模進行，F組大鼠活動度明顯降低。其他生活狀態(tài)均無差異。

2.2 各組肝臟形態(tài)學變化

第10周處死各組大鼠，取肝臟進行大體進行觀察，并取相同部分進行HE染色觀察病變。如圖2所示，C組肝臟光滑完整，F組可見明顯多個散發(fā)的脂肪囊腫，HS組肝臟較為光滑，偶見個別小脂肪囊腫，TS組肝臟靠近肝門處脂肪囊腫散發(fā)。HE染色所示：C組肝小葉結構清晰完整，可見明顯有規(guī)律排列的肝細胞索;F組肝小葉與肝細胞索消失，肝細胞內可見大量（>90%視野）脂肪小空泡，伴有多發(fā)大空泡融合成大小不一的脂囊;HS組肝小葉結構尚可見，但肝細胞索結構有些紊亂。肝細胞內可見中量（>50%視野）脂肪小空泡，偶有融合性大空泡出現;TS組肝小葉結構紊亂不清，肝細胞內可見較多（>75%視野）脂肪空泡，肝細胞體積增大，胞漿疏松呈網狀、半透明。

2.3 肝組織勻漿指標的變化

如表2所示，F組肝組織MDA比C組非常明顯升高（P<0.01）;而GSH、SOD的表達則比C組顯著降低（P<0.01）。HS組肝組織MDA比F組顯著降低（P<0.05）;GSH、SOD的表達比F組顯著上升（P<0.05）。F組肝組織Caspase-3和Caspase-12比C組顯著升高（P<0.01）;而HS組肝組織Caspase-3和Caspase-12的表達比F組顯著降低（P<0.05）。TS組肝組織MDA、GSH、SOD 、Caspase-3和Caspase-12與F組相比，均無明顯性變化（P>0.05）。F組肝組織TNF-α和IL-6比C組顯著升高（P<0.01）;而HS組TNF-α和IL-6的表達比F組明顯降低（P<0.01）;TS組肝組織TNF-α和IL-6比F組顯著降低（P<0.05）。

3 討論

本研究歸納認為：現在廣大研究者廣泛認可的NAFLD致病機制是“二次打擊假說”。第一次打擊是脂肪蓄積在肝中，這個過程的發(fā)生和胰島素抵抗有著緊密的聯系，這也是為什么許多研究者并沒有在脂肪肝患者中發(fā)現大量或嚴重的炎癥改變。第二次打擊是源于氧化應激誘導的級聯反應促線粒體細胞凋亡與內質網應激，再加上細胞因子的異常分泌從而導致了NAFLD炎癥反應的發(fā)生和發(fā)展以及壞死、纖維化最終演變?yōu)镹ASH。

諸多研究初步證明，有氧運動（aerobic exercise）可通過減少機體受自由基損傷的程度來增強機體抗氧化防御功能;從“適宜運動”理論來看，20分鐘有氧運動組的運動強度在各運動組中最為合適，這種適宜的運動形式產生積極的運動效應的機理與運動誘導細胞凋亡的機制正相反，表現為：①適宜的運動促進bcl-2基因表達、抑制bax基因表達、使bcl-2/bax比值發(fā)生優(yōu)化，②適宜的運動可以減少自由基的生成，并通過提高SOD等抗氧化酶活性加大對自由基清除的力度 ，③使線粒體體積和數目的同時增加，酶合成增加，增強活性和線粒體氧化磷酸化能力，④減少機械損傷的發(fā)生;在國內文獻中，鮮有相關報道。關于有氧運動介導的抗炎癥反應機制，大多集中在IL-6和TNF-α兩種細胞因子。

低溫醫(yī)學集組織學、工程學、醫(yī)學之大成，發(fā)展成為一門新興邊緣學科。低溫具有抗炎、鎮(zhèn)痛、散熱及提高機體免疫力等廣泛、綜合生物學效應，已廣泛應用于各項運動訓練后的康復治療。它還應用于治療炎癥，肌肉痙攣和疼痛。

本研究結果顯示，HS組肝組織MDA的表達比F組顯著降低（P<0.05）;HS組肝組織GSH、SOD同F組比較，有顯著性升高（P<0.05）。在建造NAFLD動物模型前，預先實施亞低溫狀態(tài)下聯合有氧運動干預措施，可以明顯增強肝細胞抗氧化應激能力。這可能是由于有氧運動能增加機體SOD等抗氧化酶的數量和活性，亞低溫狀態(tài)使得機體生成氧自由基的數量減少，而實施亞低溫狀態(tài)下聯合有氧運動干預措施，可能會使得NAFLD肝細胞抗氧化應激能力產生疊加效應。

本研究結果顯示，HS組肝組織Caspase-3和Caspase-12的表達比F組明顯降低（P<0.05）。在建造NAFLD動物模型前，預先實施亞低溫狀態(tài)下聯合有氧運動干預措施，可以明顯減少NAFLD肝細胞線粒體凋亡與內質網應激的發(fā)生。這些可能與上述NAFLD血清FFA減少和肝細胞抗氧化應激能力的提高有關。

本研究結果顯示，HS組肝組織TNF-α和IL-6的表達比F組顯著降低（P<0.01）。在建造NAFLD動物模型前，預先實施亞低溫狀態(tài)下聯合有氧運動干預措施可以明顯減少NAFLD肝細胞炎癥因子的生成，達到預防NAFLD炎癥的形成。

4 結語

在SD大鼠NAFLD模型建造前，實施亞低溫狀態(tài)下游泳運動干預5周，可以減少肝細胞線粒體凋亡與內質網應激的發(fā)生、增強肝細胞抗氧化應激能力和減少肝細胞炎癥因子的生成，從而達到預防NAFLD的發(fā)生的效果。

本文系2018年度湖北省教育廳科學研究計劃資助項目“不同運動形式對非酒精性脂肪肝的干預作用及機理”（B2018226）。

通訊作者：王曉昆

（作者單位：1.武漢體育學院運動醫(yī)學院;2.武漢航海職業(yè)技術學院）