康周才讓，劉 宇，王 敏，李 穎，畢曉昆，李媛媛，凌 遙，趙春江*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,北京 100193; 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)馬研究中心,北京 100193)

自古以來(lái)，康西草原是北京地區(qū)馬匹的主產(chǎn)區(qū),也是北京近郊的第一大草場(chǎng)。該地氣候冬冷夏涼，年平均氣溫8 ℃，是著名的避暑勝地。該地區(qū)土壤中含有豐富的礦物質(zhì)元素，土質(zhì)疏松，水源充足。當(dāng)?shù)氐牟輬?chǎng)和農(nóng)副產(chǎn)品為養(yǎng)馬提供了有利的條件。在上個(gè)世紀(jì)早期，當(dāng)?shù)伛R匹主要供農(nóng)役和軍用。隨著時(shí)間的推移，該地區(qū)旅游業(yè)逐漸發(fā)展起來(lái)，馬匹的作用也發(fā)生了變化，更多向著騎乘娛樂(lè)方向發(fā)展。本地馬多被淘汰，當(dāng)?shù)伛R主為適應(yīng)游客的需求逐漸引進(jìn)國(guó)外的騎乘型馬，但由于缺乏品種登記信息，許多馬的品種來(lái)源不明，這給該群體的資源評(píng)價(jià)、進(jìn)一步培育和開(kāi)發(fā)利用帶來(lái)了困難。近幾十年來(lái)，不斷成熟的分子生物學(xué)技術(shù)為馬品種起源分析和資源評(píng)估提供了有力的手段。本研究擬采用微衛(wèi)星DNA位點(diǎn)多態(tài)性分析技術(shù)對(duì)該地區(qū)馬匹進(jìn)行群體遺傳學(xué)研究。

微衛(wèi)星 DNA 作為多態(tài)性豐富且容易獲得的基因標(biāo)記，廣泛用于構(gòu)建物種的遺傳連鎖圖譜、基因鑒定、物種進(jìn)化、群體間親緣關(guān)系分析以及系譜鑒定等方面。該技術(shù)在馬的遺傳學(xué)研究中應(yīng)用也很廣泛，如為確定關(guān)中馬的遺傳多樣性和驗(yàn)證其系譜記錄，有學(xué)者采用8個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)67個(gè)關(guān)中馬個(gè)體進(jìn)行了基因分型；利用微衛(wèi)星DNA確定沙漠型阿位伯馬與埃及、波蘭阿拉伯馬之間的關(guān)系，并分析它們的起源和形成過(guò)程；在利用微衛(wèi)星DNA對(duì)馬爾查多馬群體結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究中揭示了群體間的基因流動(dòng)，以及與其他馬品種的遺傳關(guān)系，為該馬品種的進(jìn)一步培育打下了基礎(chǔ)。除此之外，還有利用微衛(wèi)星DNA檢測(cè)技術(shù)對(duì)吉爾吉斯馬、約納古尼馬、宮古馬、利皮贊馬、比戈拉吉馬、野馬、西班牙矮馬和委內(nèi)瑞拉克里奧羅馬等的研究。國(guó)內(nèi)外利用微衛(wèi)星DNA分子標(biāo)記技術(shù)探索馬匹來(lái)源的研究眾多，也為本研究提供了參考依據(jù)。本研究以康西草原的馬群體為研究對(duì)象，擬研究其起源及群體結(jié)構(gòu)，為遺傳資源評(píng)估和將來(lái)進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)利用打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究選擇6個(gè)馬群體，國(guó)內(nèi)品種為百色馬，國(guó)外品種包括溫血馬、阿哈捷金馬、阿拉伯馬和純血馬，分別從德國(guó)、俄羅斯(阿哈捷金馬、阿拉伯馬)、愛(ài)爾蘭引入我國(guó)，在北京周邊馬術(shù)俱樂(lè)部采集樣本。百色馬在我國(guó)的廣西省百色市采集血樣，6個(gè)馬種群的信息見(jiàn)表1。血液樣品低溫運(yùn)回于試驗(yàn)室-80 ℃冰箱保存。

表1 6個(gè)馬種群的來(lái)源

1.2 DNA提取與微衛(wèi)星擴(kuò)增

本研究使用血液基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司,北京)進(jìn)行DNA提取, 采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA樣品質(zhì)量；超微量核酸蛋白測(cè)定儀(OD/OD)測(cè)定DNA濃度，并將濃度調(diào)至30 ng·μL。試驗(yàn)采用國(guó)際動(dòng)物遺傳協(xié)會(huì)(International Society For Animal Genetics)和聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(The Food And Agriculture Organization)聯(lián)合推薦的馬屬動(dòng)物遺傳多態(tài)性的12個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記(HTG4、HTG10、HMS2、HMS3、HMS6、VHL20、ASB2、AHT5、AHT4、HMS7、ASB17、ASB23)。

微衛(wèi)星DNA位點(diǎn)擴(kuò)增試驗(yàn)采用 ABI公司的馬親子鑒定試劑盒來(lái)操作，具體步驟詳見(jiàn)說(shuō)明書(shū)，擴(kuò)增引物信息見(jiàn)表2。PCR-STR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳鑒定后采用毛細(xì)管電泳法測(cè)定擴(kuò)增的微衛(wèi)星片段大小。其中在自動(dòng)測(cè)序儀(ABI PRISM遺傳分析儀3730Xl)進(jìn)行的基因掃描由北京諾賽基因組研究中心有限公司完成。返回?cái)?shù)據(jù)利用PeakScannerSoftwarev1.0軟件讀取并記錄,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行校正,判斷片段大小。

表2 12個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的信息

1.3 數(shù)據(jù)分析

1.3.1 遺傳多樣性分析 利用GENALEX 6.0軟件計(jì)算各群體的等位基因數(shù)(number of alleles,)、有效等位基因數(shù)(effective number of alleles,)、期望雜合度(expected heterozygosity,)、多態(tài)信息含量(polymorphism information content,)、觀察雜合度(observed heterozygosity,)、Shannon信息指數(shù)(Shannon information index,)和等位基因豐富度等(allelic richness，)等遺傳參數(shù)。使用在線GENEPOP分析軟件的費(fèi)舍爾精確測(cè)試法求出各單位點(diǎn)的平均值，用以檢測(cè)在單位點(diǎn)水平各位點(diǎn)基因型頻率是否偏離哈迪-溫伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium,HWE)以及是否處于連鎖不平衡(linkage disequilibrium,LD)的狀態(tài)。

1.3.2 遺傳分化和瓶頸分析 利用Arlequin 3.1.0.2軟件計(jì)算遺傳分化系數(shù)(genetic differentiation coefficient，)來(lái)評(píng)估群體間的遺傳分化程度，并用Bootstrap進(jìn)行1 000次重復(fù)抽樣以檢驗(yàn)的置信水平。為探討遺傳距離與地理距離之間的相互關(guān)系，進(jìn)行了距離隔離模式分析(isolation by distance，IBD)。種群間的Nei’s遺傳距離由POPGENE3.2軟件計(jì)算獲得，地理距離則以各種群的實(shí)際經(jīng)緯度換算得到。利用SPSS軟件分析延慶地區(qū)馬群體與其他馬種群之間地理距離和遺傳距離之間的Mantel相關(guān)性分析。利用BOTTLENECK 1.2.02軟件用來(lái)分析各馬種群的瓶頸效應(yīng)。分析假設(shè)為一個(gè)無(wú)限等位基因模型(infinite allele model,IAM)，一個(gè)逐步突變模型(step-wise mutation mode,SMM)和兩階段模型(two phased model of mutation,TPM)，并使用雙尾Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)在5%的概率水平下對(duì)不同的模型進(jìn)行評(píng)估。

1.3.3 群體遺傳結(jié)構(gòu)分析 利用POPGENE3.2軟件計(jì)算各群體之間的遺傳距離。Bootstrap重復(fù)抽樣1 000次，對(duì)各分支自檢，確定置信水平。使用MEGA 7.0根據(jù)群體間Nei’s標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離采用UPGMA進(jìn)行聚類分析。利用Structure 2.2軟件通過(guò)貝葉斯聚類方法分析種群遺傳結(jié)構(gòu)，采用的是馬爾科夫鏈蒙特卡洛算法(Markov chain monte car,MCMC)。K值選擇2～7，對(duì)每個(gè)值重復(fù)6次，預(yù)熱100 000次并舍棄，隨后進(jìn)行1 000 000次重復(fù)正式計(jì)算。為了進(jìn)一步描述不同地理種群間的遺傳結(jié)構(gòu)情況，使用GENETIX 4.02軟件中的相關(guān)因子分析程序(factor analysis，F(xiàn)CA)進(jìn)行群體的三維主成分聚類分析。

2 結(jié) 果

2.1 遺傳多樣性

對(duì)本研究中的6個(gè)馬群體的12個(gè)微衛(wèi)星DNA位點(diǎn)進(jìn)行多態(tài)性分析，共檢測(cè)到221個(gè)等位基因。有效等位基因數(shù)()介于3.649～5.397,平均為4.405。期望雜合度()最低為0.681，最高為0.798。觀測(cè)雜合度()介于0.632～0.780之間，多態(tài)信息含量()介于0.643～0.772,為高度多態(tài)(>0.5)。平均等位基因豐富度()為7.366，總體范圍在5.132～9.156之間。Shannon指數(shù)()在1.372～1.829之間(表3)。

表3 6個(gè)馬群體總遺傳參數(shù)

采用GENEPOP4.0 軟件通過(guò)馬爾可夫鏈方法檢測(cè)每個(gè)種群在各位點(diǎn)是否符合哈迪-溫伯格平衡(HWE)以及是否處于連鎖不平衡(LD)的狀態(tài)。6個(gè)馬匹種群 12個(gè)位點(diǎn)的哈溫平衡檢驗(yàn)結(jié)果通過(guò)Bonferroni校正過(guò)后的值為0.006 5。大多數(shù)位點(diǎn)的值都大于校正值(=0.006 5)。其中康西草原馬群體的HTG4和HMS3位點(diǎn)、純血馬的HMS7和HMS2位點(diǎn)、阿拉伯馬的HMS2等單位點(diǎn)偏離了哈溫平衡(<0.006 5,表4)。進(jìn)一步對(duì)各位點(diǎn)進(jìn)行連鎖不平衡分析，同樣通過(guò)Bonferroni方法進(jìn)行校正。結(jié)果顯示，大多數(shù)位點(diǎn)處于連鎖平衡，而只有HMS3和AHT4之間處于連鎖不平衡的狀態(tài)(表5)。

表4 微衛(wèi)星DNA位點(diǎn)的哈迪-溫伯格平衡分析

表5 微衛(wèi)星DNA位點(diǎn)連鎖不平衡分析

2.2 群體分化和瓶頸效應(yīng)分析

各群體之間的在0.061～0.145，總體來(lái)說(shuō)群體間分化程度較低(<0.15)。通過(guò)觀察康西草原馬群體與其他馬群體間的分化程度發(fā)現(xiàn),該群體與溫血馬之間的分化程度最小，為0.038，說(shuō)明兩個(gè)群體之間最有可能存在基因交流(表6)。為了進(jìn)一步了解遺傳距離與地理距離的相關(guān)性，繪制了基于Nei’s遺傳距離與地理距離之間的Mantel相關(guān)分析圖(圖1)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者之間處于正相關(guān)，但是值并不顯著。根據(jù)微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因頻率，基于3種不同的假設(shè)IAM、SMM、TPM三種模型進(jìn)行瓶頸效應(yīng)分析。結(jié)果顯示溫血馬、純血馬、百色馬以及康西草原馬種群在不同模型下都經(jīng)歷了不同程度瓶頸效應(yīng)的影響。其中康西草原馬種群在IAM模型下值極顯著(表7)，說(shuō)明該群體在歷史上數(shù)量有大幅度的減少，可能發(fā)生過(guò)大規(guī)模的遷移。

表6 各群體間群體分化系數(shù)(Fst)

表7 6個(gè)馬匹種群瓶頸效應(yīng)分析

圖1 基于Nei’s遺傳距離與地理距離之間Mantel相關(guān)性檢驗(yàn)

2.3 群體結(jié)構(gòu)分析

利用MEGA 7.0軟件構(gòu)建基于Nei’s標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離的UPGMA樹(shù)狀圖。通過(guò)樹(shù)狀圖發(fā)現(xiàn)6個(gè)馬群體分為3組。其中溫血馬、康西草原地區(qū)馬群體以及純血馬聚為一類，阿拉伯馬和阿哈捷金馬聚為一類，百色馬單獨(dú)聚為一類(圖2)?；赟tructure的貝葉斯聚類分析結(jié)果表明，經(jīng)過(guò) 6 次重復(fù)的分群測(cè)試，結(jié)果顯示當(dāng) K=3時(shí)，Delta K出現(xiàn)明顯拐點(diǎn)且取得最大值(圖3)，說(shuō)明 6個(gè)種群可劃分3個(gè)亞群。第一個(gè)亞群為溫血馬、康西草原地區(qū)馬群體和純血馬；第二個(gè)亞群為阿拉伯馬和阿哈捷金馬；第三個(gè)亞群為百色馬(圖4)，這與UPGMA的結(jié)果相同。因子相關(guān)分析(FCA)顯示了與UPGMA樹(shù)狀圖和Structure貝葉斯聚類分析一致的結(jié)果(圖5)。

圖2 基于Nei’s標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離UPGMA樹(shù)狀圖

圖3 Delta K在K=3時(shí)得到最大值

每個(gè)矩形代表一個(gè)群體

圖5 FCA因子分析定義的各群體空間表現(xiàn)圖示

3 討 論

微衛(wèi)星標(biāo)記已被證明是對(duì)遺傳多樣性和群體遺傳學(xué)研究有效的方法之一。目前，微衛(wèi)星DNA標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)成為檢測(cè)物種多樣性的重要手段，大量的微衛(wèi)星數(shù)據(jù)用于牛、羊、馬等物種的遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)分析。通過(guò)遺傳多樣性的評(píng)估可了解品種的遺傳結(jié)構(gòu)以及分析其進(jìn)化的歷史和潛力。動(dòng)物種群的遺傳多樣性可以通過(guò)每個(gè)基因座的等位基因數(shù)量、等位基因豐富度和雜合度等參數(shù)來(lái)估計(jì)。當(dāng)然微衛(wèi)星的方法也用于解決其他問(wèn)題。在本研究中通過(guò)12個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的多態(tài)性檢測(cè)，在6個(gè)種群中共檢測(cè)到221個(gè)等位基因。所有被測(cè)的6個(gè)馬種群遺傳多樣性水平都較高，各遺傳參數(shù)都略高于以往的一些馬品種上的研究，這可能與所采樣品的代表性有關(guān)。多態(tài)信息含量()是評(píng)價(jià)微衛(wèi)星位點(diǎn)的重要參考標(biāo)準(zhǔn), 若>0.5表明該位點(diǎn)具有高度多態(tài)性,若0.25<<0.5表明該位點(diǎn)具有中度多態(tài)性, 若<0.25表明該位點(diǎn)具有低度多態(tài)性。6個(gè)馬種群多態(tài)信息含量都在0.6以上。評(píng)價(jià)遺傳多樣性另一個(gè)最重要參數(shù)是等位基因雜合性，該參數(shù)提供有關(guān)種群結(jié)構(gòu)的信息，高值意味著等位基因多樣性更大。本研究中各群體觀測(cè)雜合度及期望雜合度均具有較高水平(>0.6,>0.6)。這些遺傳參數(shù)明顯高于之前的研究。導(dǎo)致遺傳參數(shù)都較高的原因與群體間的分化系數(shù)()有關(guān)系，較大基因流導(dǎo)致了群體內(nèi)基因的雜合度上升。

Wright認(rèn)為，當(dāng)<0.05 時(shí)，兩種群幾乎無(wú)分化；當(dāng) 0.05 <<0.15 時(shí)，種群中度分化；當(dāng)0.15<<0.25 時(shí)，種群發(fā)生明顯分化；當(dāng)>0.25 時(shí)，種群極度分化?？滴鞑菰貐^(qū)馬群體與其他各種群間的分化程度集中在0.038～0.145之間?？傮w上處于低分化的狀態(tài)(<0.05)，這與先前的研究利比贊品種、阿爾及利亞馬、印度品種和波蘭原始馬的值還要略低。分化低意味著有基因流存在。在品種培育過(guò)程中，從阿拉伯馬到純血馬、從純血馬到溫血馬都有過(guò)顯著的基因流，這與本研究的結(jié)果相符。延慶馬與溫血馬和純血馬分化程度也很低，表明了它們之間可能存在密切的遺傳關(guān)系。通過(guò)Mantel相關(guān)性分析揭示了地理距離和遺傳距離之間的關(guān)系，兩者處于正相關(guān)的關(guān)系(=0.502)。但兩者之間的關(guān)系不顯著性(>0.1)。這就說(shuō)明地理距離并沒(méi)有成為康西草原馬群體與其他群體間的基因流動(dòng)的阻礙，這可能與該地區(qū)馬主常年進(jìn)口大量國(guó)外馬息息相關(guān)。瓶頸效應(yīng)分析顯示康西草原馬群體在IAM模型下表現(xiàn)出了顯著性雜合子過(guò)剩的情況發(fā)生。當(dāng)?shù)芈糜螛I(yè)的發(fā)展導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)性能欠佳的本地品種逐漸失去用武之地，而性能優(yōu)良的國(guó)外騎乘馬受到當(dāng)?shù)氐臍g迎。這樣地方品種被馬主售賣，馬匹數(shù)量在歷史上有大幅度的減少，這可能是造成康西草原馬群體瓶頸效應(yīng)的主要原因。

UPGMA樹(shù)狀圖、相關(guān)因子分析(FCA)以及Structure貝葉斯聚類分析都顯示6個(gè)群體分為3大類。其中康西草原馬群體與溫血馬和純血馬聚為一類，說(shuō)明他們之間的血緣關(guān)系最近。這就表明了這些馬的來(lái)源與溫血馬、純血馬這類騎乘馬密切相關(guān)。但這并不能認(rèn)為該馬群體與地方馬之間無(wú)血緣關(guān)系。通過(guò)群體分化系數(shù)()顯示百色馬與康西草原馬群體之間分化程度較低，說(shuō)明該群體與地方馬之間也有基因交流存在，即該地區(qū)馬群體中有地方馬的血統(tǒng)。馬種群的遺傳結(jié)構(gòu)反映了包括長(zhǎng)期進(jìn)化歷史在內(nèi)的各種過(guò)程的相互作用，一般地理隔離是造成群體分化的主要原因。地理距離與遺傳距離的Mantel相關(guān)分析顯示正相關(guān)表明了這一點(diǎn)。雖然由于交通運(yùn)輸?shù)谋憷沟眠z傳距離與地理距離關(guān)系并不顯著，但是地理距離遠(yuǎn)的馬之間也有可能存在一定的基因流動(dòng)。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，康西草原馬群體具有較高的遺傳多樣性，該群體的來(lái)源與溫血馬和純血馬等國(guó)外優(yōu)良騎乘型馬品種的引入密切相關(guān)。本研究的結(jié)果對(duì)于延慶地區(qū)馬的育種具有重要的參考價(jià)值。

感謝北京市延慶區(qū)康西草原各大馬場(chǎng)馬主對(duì)采樣工作的支持。如上資助來(lái)源于家養(yǎng)動(dòng)物種質(zhì)資源庫(kù)。