陳曉光， 潘曉峰， 王帆， 潘宋斌*

1.武漢市第一醫(yī)院（武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院）神經(jīng)內(nèi)科，武漢430022；2.武漢市第一醫(yī)院（武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院）老年病科，武漢430022

阿爾茨海默癥（Alzheimer's disease，AD）是老年人群中的常見疾病，又稱老年癡呆，臨床表現(xiàn)為記憶能力減退并伴隨反應遲鈍、理解能力下降等［1］。目前，AD 的發(fā)病機制尚未完全明確，臨床仍缺乏療效確切的治療方法及藥物。人參皂苷Rg1 是人參的有效成分，具有保護神經(jīng)功能、抗衰老等作用，其也是AD 領(lǐng)域研究最多、最具代表性的成分之一［2-3］。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)營養(yǎng)因子，可與酪氨酸激酶受體B（tyrosine kinase receptor B，TrkB）結(jié)合，調(diào)控神經(jīng)元的生長、分化及突觸的形成等過程［4］。近年來，多項研究表明，激活BDNF-TrkB 信號通路將有助于改善AD［5-6］。但目前關(guān)于Rg1改善AD的分子機制尚未統(tǒng)一，本研究旨在從BDNF-TrkB 信號通路的角度，分析人參皂苷Rg1對AD大鼠模型的保護機制，以期為人參皂苷Rg1用于治療AD奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 選取75 只雄性SPF 級6 周齡SD 大鼠作為研究對象，平均體質(zhì)量為250±30 g，均購自西安交通大學醫(yī)學部動物實驗中心，許可證號：SYXK（陜）2018-001。本試驗經(jīng)動物倫理委員會審核批準且嚴格遵循動物試驗減少（reduction）、優(yōu)化（refinement）和替代（replacement）-3R原則。

1.1.2 藥物與試劑 Aβ1-42 試劑購自美國SIGMA 公司；人參皂苷Rg1（貨號：GD-GSJ125-585；純度＞98%）購自遜希公司；乙酰膽堿（acetylcholine，Ach）試 劑 盒、5-羥 色 胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）試劑盒、乙酰膽堿酯酶（total cholinesterase，TChE）試劑盒均購自江萊生物有限公司；TUNEL染色試劑盒購自瑞士Roche 公司；切割后半胱氨酸蛋白酶-3（Cleaved Caspase-3）抗體（貨號：sc-9661）、B 淋巴細胞瘤-2 抗體（B lymphocytoma-2，Bcl-2，貨號：sc-15071）、Bcl-2 相關(guān)蛋白X 抗體（Bcl-2 associated protein X，Bax，貨號：sc-5023），腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF，抗體貨號：sc-65514）、酪氨酸激酶B抗 體（tyrosine kinase receptor B，TrkB，貨 號：sc-8058）購自美國Santa Cruz 公司；HRP 羊抗兔IgG、HRP羊抗鼠IgG等二抗購自美國Thermo公司。

1.1.3 儀器 SMZ800 光學顯微鏡購自日本Nikon 公司；離心機購自德國Eppendorf 公司；垂直電泳槽、電泳儀及相關(guān)配件均購自美國Bio-Rad 公司。

1.2 方法

1.2.1 分組 75 只雄性SD 大鼠采用隨機數(shù)字表法分為空白對照組、模型組、低劑量Rg1 組、中劑量Rg1組及高劑量Rg1組，每組15只。

1.2.2 腦片制作、模型建立[7]及給藥處理 使用150 mmol·L?1NaCl，2 mmol·L?1CaCl2，1.2 mmol·L?1MgSO4，0.5 mmol·L?1KH2PO4配制人工腦脊液，另配制加入1 mmol·L?1Aβ1-42 試劑作為人工腦脊液誘導AD 模型，0 ℃保存?zhèn)溆谩；铙w大鼠處死后立即取大腦切成厚度為400 μm的切片，挑選形態(tài)較好（含有海馬和皮層組織）的腦片放入人工腦脊液中，培養(yǎng)溫度32 ℃左右，氧氣含量為95%，二氧化碳含量為5%。除空白對照組外各組加入含有Aβ1-42 試劑的人工腦脊液制備AD 模型，作用2 h后，低劑量Rg1 組、中劑量Rg1 組及高劑量Rg1 組分別加入60、120、240 μmol·L?1Rg1處理3 h，空白對照組和模型組加入等量0.9% NaCl 溶液，上述過程均在32 ℃、95%氧氣、5%二氧化氮培養(yǎng)條件下進行。

1.2.3 HE染色 干預結(jié)束后取各組腦片，轉(zhuǎn)移至4%多聚甲醛溶液中固定3 h，再放至30%蔗糖溶液中浸糖至沉底，制備組織冰凍切片，常規(guī)HE 染色，光鏡下觀察大鼠腦組織病理形態(tài)變化。

1.2.4 TUNEL 染色 干預結(jié)束后取各組腦片，參照上述方法制備組織冰凍切片，滴加3%過氧化氫溶液滅活內(nèi)源性辣根過氧化物酶10 min，再加入蛋白酶K 37 ℃下消化15 min，加20 μL 標記緩沖液，再分別加入末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT）和熒光素標記的三磷酸脫氧尿甘（2'-deoxyuridine 5'-triphosphated，UTP）溶液各1 μL，37 ℃下反應2 h，然后加50 μL 封閉液，室溫下靜置30 min，滴加50 μL抗光抗體，室溫下孵育40 min，再加入抗體稀釋液1∶100 倍稀釋的鏈霉親和素-生物復合物（streptavidin-biotin complex，SABC），37 ℃下反應1 h，二氨基聯(lián)苯胺（3，3′-diaminobenzidine，DAB）顯色后，蘇木素復染，光鏡下觀察大鼠腦組織細胞凋亡情況，黃褐色為凋亡細胞陽性染色。

1.2.5 Ach、5-HT含量和TChE 活力檢測 取上述腦片，采用相關(guān)試劑盒檢測大鼠腦組織Ach、5-HT含量和TChE 活力，檢測方法嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡檢測蛋白表達水平 取上述腦片，提取總蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，并將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluorids，PVDF）上，加入脫脂奶粉，在37 ℃的條件下封閉2 h，后加入稀釋后的Cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax、BDNF及TrkB蛋白抗體（稀釋比例為1∶1 500），內(nèi)參蛋白為GAPDH（稀釋比例1∶1 000），4 ℃下孵育過夜，次日洗膜后加入HRP 羊抗兔IgG、HRP 羊抗鼠IgG 二抗（稀釋比例1∶5 000），采用顯色液顯色后進行灰度值檢測。蛋白相對表達量計算公式見式（1）。

蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/GADPH灰度值 （1）

1.3 統(tǒng)計分析

采用SPSS 22.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析，采用GraphPad Prism5 進行繪圖，多組間比較使用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD 法，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 大鼠腦片HE染色結(jié)果

如圖1 所示，HE 染色觀察大鼠腦組織病理形態(tài)變化，空白對照組未見異常，海馬神經(jīng)元細胞結(jié)構(gòu)完整；模型組海馬CA1 區(qū)細胞排列松散，損傷明顯；低劑量Rg1 組、中劑量Rg1 組及高劑量Rg1組腦組織病理損傷較模型組癥狀明顯減輕。

圖1 大鼠腦片HE染色結(jié)果Fig.1 HE staining results of brain slices in rats

2.2 大鼠腦片TUNEL染色結(jié)果

如圖2 所示，TUNEL 染色觀察大鼠海馬CA1區(qū)細胞凋亡情況，空白對照組、模型組、低劑量Rg1 組、中劑量Rg1 組及高劑量Rg1 組腦組織細胞 凋 亡 數(shù) 分 別 為（7.21±2.15）、（58.27±11.24）、（42.31±8.56）、（29.64±6.34）、（15.68±3.32）個。與空白對照組比較，模型組腦組織細胞凋亡數(shù)顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，低劑量Rg1 組、中劑量Rg1 組及高劑量Rg1 組腦組織細胞凋亡數(shù)顯著減少（P＜0.05），且具有劑量依賴性。

圖2 大鼠腦片TUNEL染色結(jié)果Fig.2 TUNEL staining results of brain slices in rats

2.3 大鼠腦片中凋亡相關(guān)蛋白檢測結(jié)果

檢測大鼠腦片中凋亡相關(guān)蛋白發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比，模型組大鼠Cleaved Caspase-3/GAPDH和Bax/Bcl-2水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，低劑量Rg1 組、中劑量Rg1 組及高劑量Rg1組Cleaved Caspase-3/GAPDH 和Bax/Bcl-2 水平顯著降低（P＜0.05），且具有劑量依賴性（圖3、表1）。

表1 大鼠腦片中凋亡相關(guān)蛋白檢測結(jié)果Table 1 Detection results of apoptosis-related proteins in brain slices of rats

圖3 大鼠腦片中凋亡相關(guān)蛋白檢測結(jié)果Fig.3 Detection results of apoptosis related proteins in rat brain slices

2.4 大鼠腦片中5-HT、Ach 含量和TChE 活力檢測結(jié)果

檢測大鼠腦片中5-HT、Ach含量和TChE水平發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比，模型組大鼠5-HT 和Ach水平顯著降低，TChE水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，低劑量Rg1 組、中劑量Rg1 組及高劑量Rg1組5-HT和Ach水平均顯著升高，TChE水平 均 顯 著 降 低（P＜0.05），且 具 有 劑 量 依 賴性（表2）。

表2 大鼠腦片中5-HT、Ach含量和TChE活力檢測結(jié)果（x±s）Table 2 Detection results of 5-HT,Ach levels and TChE activity in brain slices of rats(x±s)

2.5 大鼠腦片中BDNF-TrkB 信號通路相關(guān)蛋白檢測結(jié)果

檢測大鼠腦片中BDNF-TrkB 信號通路相關(guān)蛋白發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比，模型組BDNF 和TrkB 蛋白表達量均顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，低劑量Rg1 組、中劑量Rg1 組及高劑量Rg1 組BDNF 和TrkB 蛋白表達量均顯著升高（P＜0.05），且具有劑量依賴性（圖4、表3）。

圖4 大鼠腦片中BDNF-TrkB信號通路相關(guān)蛋白檢測結(jié)果Fig.4 Detection results of BDNF-TrkB signal pathway related proteins in rat brain slices

表3 大鼠腦片中BDNF-TrkB信號通路相關(guān)蛋白檢測結(jié)果（x±s）Table 3 Detection results of BDNF-TrkB signaling path ways related proteins in brain slices of rats(x±s)

3 討論

AD 的主要病理特征為多種因素誘導神經(jīng)細胞凋亡［8］。細胞凋亡可引起AD 腦內(nèi)皮質(zhì)皺縮，基底前腦膽堿能神經(jīng)元的減少及海馬膽堿能纖維和突觸的丟失，會導致記憶認知障礙［9］。本研究病理觀察顯示，采用Aβ1-42 培育后，大鼠腦組織損傷明顯，且存在大量的凋亡細胞，促凋亡蛋白Cleaved Caspase-3 表達明顯升高，Bax/Bcl-2 平衡也偏向促凋亡（Bax）水平，經(jīng)不同劑量人參皂苷Rg1 處理后，腦組織損傷表現(xiàn)出不同程度的減輕，凋亡細胞也明顯減少，Cleaved Caspase-3 和Bax/Bcl-2 水平明顯降低，表明人參皂苷Rg1 可抑制腦組織細胞凋亡，從而發(fā)揮保護AD 的作用。許彤等［10］研究也顯示，人參皂苷Rg1 可抑制過氧化氫誘導的海馬神經(jīng)元凋亡。

Ach 是與學習和記憶密切相關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)，主要由突觸前膜釋放，與突觸后膜上乙酰膽堿受體結(jié)合開放離子通道，引起神經(jīng)元興奮的傳遞［11］。膽堿被激活后可以易化由齒狀回成熟神經(jīng)元形成的長時程增強效應［12］。5-HT 也是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要神經(jīng)遞質(zhì)，主要參與學習與記憶［13］。TChE是生物神經(jīng)傳導中的一種關(guān)鍵性酶，其可以降解乙酰膽堿終止神經(jīng)遞質(zhì)對突觸后膜的興奮，保持神經(jīng)間信號正常傳遞［14］。本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，使用人參皂苷Rg1 各組5-HT、Ach水平顯著升高，TChE水平顯著降低。表明人參皂苷Rg1 可以有效改善神經(jīng)元功能。Liu 等［15］研究表明，人參皂苷Rg1 可以有效改善神經(jīng)元Ach、5-HT的表達情況，與本研究結(jié)果一致。

目前關(guān)于Rg1改善AD的分子機制研究較多，據(jù)報道，Rg1可通過MAPK/ERK、PI3K/Akt和PKA/CREB 等信號通路改善AD 癥狀［16］，說明Rg1 對人體的作用可能是多途徑、多方式和多靶點的。BDNF 是一種神經(jīng)營養(yǎng)因子，主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達，具有神經(jīng)保護功能［17］。據(jù)報道，提高海馬體內(nèi)的BDNF 水平，可以有效促進新突觸形成并顯著提高學習和記憶能力［18］。TrkB是BDNF 的特異性受體，BDNF可以與細胞膜上的TrkB結(jié)合，激活細胞內(nèi)BDNF-TrkB 信號通路，通過調(diào)節(jié)鈣離子對神經(jīng)的生長和發(fā)育發(fā)揮促進作用，同時TrkB可以參與調(diào)節(jié)谷氨酸和γ-氨基丁酸突觸后神經(jīng)遞質(zhì)受體的數(shù)量和分布，從而調(diào)節(jié)突觸可塑性，顯著改善學習和記憶能力［19-20］。本研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rg1 處理后可有效逆轉(zhuǎn)AD 導致的BDNF 和TrkB蛋白表達降低。說明人參皂苷Rg1可以通過激活BDNF-TrkB 信號通路，調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)受體的數(shù)量和分布，改善神經(jīng)受損后突觸可塑性，加快大鼠神經(jīng)功能的恢復。

綜上所述，人參皂苷Rg1可有效保護AD模型大鼠腦組織損傷，抑制神經(jīng)細胞凋亡，其作用機制可能與激活BDNF-TrkB信號通路相關(guān)。