宋然，孟芹

1.湖南省郴州市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心，湖南郴州 423000；2.感染性疾病及腫瘤基因診斷技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，湖南長(zhǎng)沙 410000

近年來(lái)，以核酸檢測(cè)為代表的分子生物學(xué)技術(shù)取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步并在臨床廣泛開(kāi)展。 由于其具有靈敏度高、特異性強(qiáng)，可縮短檢測(cè)窗口期并可檢測(cè)病毒變異等特點(diǎn)，成為臨床病原體感染診斷的主要手段[1]。 收集樣本、提取核酸，擴(kuò)增核酸，檢測(cè)產(chǎn)品與結(jié)果報(bào)告及解釋等均屬于臨床分子生物實(shí)驗(yàn)室中的基本操作。室內(nèi)質(zhì)控是分子生物實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量的關(guān)鍵部分，為保證每個(gè)標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性、可靠性，做好質(zhì)控是每個(gè)分子生物實(shí)驗(yàn)室日常工作的核心之一，實(shí)驗(yàn)室在標(biāo)本檢測(cè)前，要確保室內(nèi)質(zhì)控在控，當(dāng)儀器出現(xiàn)項(xiàng)目失控的情況，必須立刻查找失控的原因并進(jìn)行及時(shí)糾正，才能確保當(dāng)天各項(xiàng)核酸檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性[2-3]。而室內(nèi)質(zhì)量控制即實(shí)驗(yàn)室工作人員采取一定的方法和步驟，連續(xù)評(píng)價(jià)該實(shí)驗(yàn)室工作的可靠性程度，旨在監(jiān)測(cè)和控制本室常規(guī)工作的精密度，提高本室常規(guī)工作中批內(nèi)、批間樣本檢驗(yàn)的一致性，以確定測(cè)定結(jié)果是否可靠、可否發(fā)出報(bào)告的過(guò)程[4]。室內(nèi)質(zhì)量控制范圍覆蓋上述順序中的樣本處理、核酸擴(kuò)增和產(chǎn)物檢測(cè)步驟[5]。 施行有效的室內(nèi)質(zhì)量控制措施是保證核酸檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性和及時(shí)性的有效手段。該文通過(guò)統(tǒng)計(jì)該實(shí)驗(yàn)室2019年1月—2021年9月HBV DNA、HCV RNA檢測(cè)項(xiàng)目的室內(nèi)質(zhì)控失控?cái)?shù)據(jù)及糾正措施，探討分子生物實(shí)驗(yàn)室核酸檢測(cè)項(xiàng)目的室內(nèi)質(zhì)控關(guān)鍵點(diǎn)。 現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

核酸擴(kuò)增儀為T(mén)hermofisher，ABI 7500 擴(kuò)增儀；該儀器由擴(kuò)增檢測(cè)系統(tǒng)（半導(dǎo)體PCR 儀、鹵鎢燈光源、五色濾鏡輪和冷CCD 照相機(jī)進(jìn)行熒光檢測(cè)）、應(yīng)用軟件及配套電腦組成[5]。 試劑為圣湘生物科技股份有限公司的乙型肝炎病毒核酸測(cè)定試劑盒、 丙型肝炎核酸檢測(cè)試劑盒。使用核酸檢測(cè)試劑配套的陰性質(zhì)控品、陽(yáng)性質(zhì)控品，以及北京康徹思坦生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的高值、低值定值質(zhì)控品進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)控檢測(cè)。該研究使用的分析儀器和試劑、質(zhì)控品等經(jīng)過(guò)性能驗(yàn)證后采用到實(shí)驗(yàn)中，并符合該次研究的需要，所有試劑和質(zhì)控品均在有效期內(nèi)使用，儀器都經(jīng)過(guò)校準(zhǔn)并在正常狀態(tài)下實(shí)驗(yàn)，標(biāo)本及質(zhì)控品的檢測(cè)操作嚴(yán)格執(zhí)行實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量體系文件標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程。

1.2 方法

對(duì)該分子生物實(shí)驗(yàn)室2019年1月—2021年9月間HBV DNA、HCV RNA 檢測(cè)項(xiàng)目的質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)進(jìn)行回顧性分析。按照該實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制程序制定Lvey-Jennings（L-J）質(zhì)控圖框架，每次實(shí)驗(yàn)的質(zhì)控品檢測(cè)結(jié)果自動(dòng)計(jì)入實(shí)驗(yàn)室信息系統(tǒng)并繪制質(zhì)控圖，按照Westgard 多規(guī)則質(zhì)控程序觀察質(zhì)控結(jié)果。 設(shè)置質(zhì)控規(guī)則，以12S 為警告規(guī)則，13S、22S、R4S 為失控標(biāo)準(zhǔn)。 試劑盒陰性質(zhì)控品與陽(yáng)性質(zhì)控品質(zhì)控規(guī)則參考說(shuō)明書(shū)中規(guī)定。如有質(zhì)控失控情況則及時(shí)分析與處理，并詳細(xì)填寫(xiě)室內(nèi)質(zhì)控失控報(bào)告。 按照失控原因分類(lèi)，分別統(tǒng)計(jì)該實(shí)驗(yàn)室2019年1月—2021年9月的失控結(jié)果，數(shù)據(jù)來(lái)源于《檢驗(yàn)之星》軟件及實(shí)驗(yàn)室的日常記錄表格。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，計(jì)數(shù)資料采用百分?jǐn)?shù)（%）表示。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基本數(shù)據(jù)

該實(shí)驗(yàn)室2019年1月—2021年9月HBV DNA、HCV RNA 項(xiàng)目質(zhì)控品檢測(cè)共1 336 次，失控14 次，總失控率為1.05%（14/1 336）。其中人為因素導(dǎo)致失控的比例較高，共10 次，占比71.43%；質(zhì)控品因素導(dǎo)致失控2 次，占比14.29%；設(shè)備因素、環(huán)境因素導(dǎo)致的失控各1 次，各占比7.14%。 見(jiàn)表1。

表1 2019年1月—2021年9月室內(nèi)質(zhì)控失控原因統(tǒng)計(jì)

2.2 失控情況處理

按統(tǒng)計(jì)學(xué)原理，由隨機(jī)誤差引起結(jié)果超出±3s 范圍的可能性為0.3%，發(fā)生的概率較低。 室內(nèi)質(zhì)控品的檢測(cè)結(jié)果超出±3s 范圍的發(fā)生，提示可能存在非隨機(jī)誤差或特殊的情況。這種情況產(chǎn)生的原因通常為：儀器、設(shè)備誤差，如儀器未按要求進(jìn)行校準(zhǔn)；實(shí)驗(yàn)環(huán)境誤差，如溫度、濕度超出范圍；過(guò)失誤差，如測(cè)量、記錄中產(chǎn)生的過(guò)失，手工操作時(shí)產(chǎn)生的失誤等。 對(duì)失控情況處理不及時(shí)，勢(shì)必影響臨床診斷和治療工作，造成不良后果。因此，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)質(zhì)量控制失控情況一旦發(fā)生，均對(duì)失控信息進(jìn)行詳細(xì)記錄、立即報(bào)告小組、科室及質(zhì)控負(fù)責(zé)人;當(dāng)天的該項(xiàng)目檢測(cè)報(bào)告不可填發(fā)；并應(yīng)盡速查清原因、采取糾正措施并記錄,必要時(shí)復(fù)測(cè)部分甚至全部標(biāo)本，重新質(zhì)控合格后方可填發(fā)報(bào)告。

2.3 室內(nèi)質(zhì)控失控原因分析

①對(duì)具體檢測(cè)過(guò)程進(jìn)行回顧分析失控后，應(yīng)對(duì)該批檢測(cè)的全過(guò)程進(jìn)行迅速仔細(xì)的回顧，分析有無(wú)特殊情況，如電壓波動(dòng)導(dǎo)致儀器運(yùn)行不穩(wěn)、試劑瓶標(biāo)簽脫落、試劑放置位置不符合要求、質(zhì)控品瓶蓋松動(dòng)、復(fù)溶過(guò)程異常等。 并應(yīng)檢查使用的移液器是否進(jìn)行定期校準(zhǔn)，移液器量程是否正確（如刻度旋鈕位置發(fā)生移動(dòng)），移液操作過(guò)程中是否有液體反沖進(jìn)入到移液器內(nèi)部，校準(zhǔn)品或試劑有無(wú)變更生產(chǎn)廠家批號(hào)、接近失效期或超出廠家建議的反復(fù)凍融次數(shù)，同批次反應(yīng)管中液體高度是否相等、管中是否有氣泡、沉淀、絮狀物等。就上述所提及的失控因素，需要在回顧分析中著重觀察。采取選擇性復(fù)查的方式來(lái)分析出現(xiàn)失控原因及其解決方案。為表明上述分析的正確性，需進(jìn)一步完善失控因素，予以標(biāo)本一個(gè)合理安排，一般應(yīng)進(jìn)行復(fù)測(cè)。 復(fù)測(cè)時(shí)，應(yīng)包括室內(nèi)質(zhì)控品及本批次標(biāo)本，以便盡量一次找出原因,及時(shí)發(fā)出患者標(biāo)本的檢測(cè)報(bào)告

②原因分析人為因素：檢測(cè)人員操作不當(dāng)導(dǎo)致的質(zhì)控品檢測(cè)結(jié)果失控現(xiàn)象共10 次， 占比71.43%（10/14）。其中因?yàn)樾逻M(jìn)人員使用移液器不熟練，檢測(cè)孔內(nèi)質(zhì)控品回吸導(dǎo)致的加樣量不足3 次，失控率為21.43%（3/14）；操作人員混勻質(zhì)控品時(shí)進(jìn)行劇烈搖晃而產(chǎn)生氣泡，然后使用移液器吸取質(zhì)控品導(dǎo)致加樣量不足1 次，失控率為7.14%（1/14）；在加樣時(shí)發(fā)現(xiàn)提前準(zhǔn)備的質(zhì)控品量不足1次，失控率為7.14%（1/14）；吸取定量標(biāo)準(zhǔn)品的槍頭誤伸入提取試劑導(dǎo)致污染1 次， 失控率為7.14%（1/14）；加PCR 反應(yīng)液試劑的槍頭觸碰到處理好的核酸物質(zhì)1 次，失控率為7.14%（1/14）；質(zhì)控品未充分解凍，儀器吸取到的質(zhì)控品濃度不均勻3 次，失控率為21.43%（3/14）。 質(zhì)控品因素：質(zhì)控品儲(chǔ)存條件不當(dāng)導(dǎo)致，通常質(zhì)控品分裝后儲(chǔ)存于-20℃以下，反復(fù)凍融次數(shù)過(guò)多會(huì)因溫度變化會(huì)導(dǎo)致質(zhì)控品的變質(zhì)，檢測(cè)結(jié)果失控1 次，占比7.14%（1/14）；質(zhì)控品更換批號(hào)導(dǎo)致的失控1 次，占比7.14%（1/14）。 設(shè)備因素：移液器未定期校準(zhǔn)導(dǎo)致的加樣誤差，引起室內(nèi)質(zhì)控失控1 次，占比7.14%（1/14）。

3 討論

醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)結(jié)果的好壞與醫(yī)療質(zhì)量有著密切的聯(lián)系，室內(nèi)質(zhì)量控制的主要工作為監(jiān)測(cè)及評(píng)價(jià)本室工作質(zhì)量，及實(shí)驗(yàn)報(bào)告是否發(fā)出實(shí)施一種檢查手段，其核心內(nèi)容為檢測(cè)與控制及提高常規(guī)工作的質(zhì)量與準(zhǔn)確度。并且注重其準(zhǔn)確度所發(fā)生的變化，以此來(lái)增加日常工作中批間的日間標(biāo)本檢測(cè)均相同，無(wú)任何差錯(cuò)[7-8]。 控制標(biāo)本檢測(cè)的精準(zhǔn)度為室內(nèi)控制的目的，同時(shí)觀察其精準(zhǔn)度發(fā)生變化的因素，確保檢測(cè)結(jié)果的相同性，這便要求檢驗(yàn)人員在工作中增加自身的工作能力，統(tǒng)一接受系統(tǒng)化、高端的培訓(xùn)，嚴(yán)格遵守質(zhì)控規(guī)章制度等；在儀器使用方面，需定期檢查儀器并且對(duì)其進(jìn)行校準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)室依照實(shí)際情況來(lái)制訂選擇定值質(zhì)控物和非定值質(zhì)控物，對(duì)此，嚴(yán)格要求質(zhì)控物與患者標(biāo)本的檢查需在同一條件，同一溫度下執(zhí)行，遵守質(zhì)控物檢查制度予以保存，同時(shí)及時(shí)在保質(zhì)期內(nèi)使用，且對(duì)質(zhì)控結(jié)果予以合理有效的分析[9-10]。 就此而言室內(nèi)質(zhì)控失控的因素為多種，但是均要經(jīng)過(guò)不斷的實(shí)驗(yàn)來(lái)對(duì)質(zhì)控中每個(gè)環(huán)節(jié)，進(jìn)行細(xì)致的觀察，記錄，調(diào)整等，明確每個(gè)儀器與試劑的使用，才可在質(zhì)控工作中大幅度降低失誤率，在短時(shí)間內(nèi)找出失控因素且予以相對(duì)應(yīng)的糾正，確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性[11-12]。分子生物實(shí)驗(yàn)室需要建立一套全面的質(zhì)量管理體系，以期獲得及時(shí)、準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果。 室內(nèi)質(zhì)量控制的實(shí)施涉及到實(shí)驗(yàn)室的每個(gè)人、每個(gè)工作環(huán)節(jié)，是保證日常檢驗(yàn)質(zhì)量必不可少的措施。 該實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)顯示，室內(nèi)質(zhì)控失控的原因通常為人為因素、試劑因素、設(shè)備因素和環(huán)境因素等。 實(shí)驗(yàn)室應(yīng)保證室內(nèi)質(zhì)控品的檢測(cè)結(jié)果在控，出現(xiàn)失控時(shí)應(yīng)及時(shí)查找原因并糾正失控，及時(shí)分析失控原因?qū)?shí)驗(yàn)室內(nèi)質(zhì)量改進(jìn)工作具有重要意義。

該實(shí)驗(yàn)室失控原因中人為因素占較大比例，應(yīng)加強(qiáng)操作人員的專(zhuān)業(yè)培訓(xùn)與考核工作。要求操作人員熟練掌握實(shí)驗(yàn)操作、質(zhì)量控制等一系列程序，具備生物安全防護(hù)意識(shí)及防污染意識(shí)，嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)室操作規(guī)范進(jìn)行操作與記錄。所有標(biāo)本處理、核酸提取、核酸擴(kuò)增設(shè)備均應(yīng)按照實(shí)驗(yàn)室相關(guān)規(guī)則以及操作規(guī)程進(jìn)行操作。

質(zhì)控品參與核酸提取與擴(kuò)增過(guò)程，是核酸檢測(cè)質(zhì)量控制的關(guān)鍵手段之一。質(zhì)控品一般由含有檢測(cè)靶標(biāo)的陽(yáng)性質(zhì)控與不含有檢測(cè)靶標(biāo)的陰性質(zhì)控組成[13]，質(zhì)控品的檢測(cè)與標(biāo)本檢測(cè)同時(shí)進(jìn)行。除試劑盒中含有的陽(yáng)性對(duì)照品與陰性對(duì)照品作為批內(nèi)檢測(cè)質(zhì)控品外，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)采購(gòu)或制備室內(nèi)質(zhì)控品用以監(jiān)測(cè)批間檢測(cè)差異。質(zhì)控品在使用過(guò)程中，應(yīng)注意保存、反復(fù)凍融等條件，使用前應(yīng)充分混勻。另外，試劑質(zhì)量是影響核酸檢測(cè)質(zhì)量的重要因素，而試劑盒質(zhì)量受原料、生產(chǎn)、包裝、運(yùn)輸和貯存等條件影響較大，應(yīng)嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書(shū)使用和貯存。

實(shí)驗(yàn)室設(shè)備應(yīng)按期進(jìn)行維護(hù)、校準(zhǔn)和性能驗(yàn)證，做好設(shè)備使用及檢查記錄，保證設(shè)備處于良好運(yùn)行狀態(tài)。另外，設(shè)備應(yīng)定期進(jìn)行清潔，防止陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品或陽(yáng)性標(biāo)本污染設(shè)備導(dǎo)致出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果[14]。 操作人員一旦發(fā)現(xiàn)質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)有異常情況，一定要及時(shí)進(jìn)行回顧性分析，初步估計(jì)失控原因，然后檢查試劑及質(zhì)控品的批號(hào)，逐步進(jìn)行排除[15-16]。盡量避免人為誤差，重視對(duì)儀器的日常維護(hù)也尤為重要。 并且室內(nèi)質(zhì)控是檢驗(yàn)質(zhì)量的重要保證，要從每一次的失控中總結(jié)經(jīng)驗(yàn)，吸取教訓(xùn)，進(jìn)一步提高檢驗(yàn)質(zhì)量[17-18]。

規(guī)范的實(shí)驗(yàn)室是保證檢測(cè)工作順利進(jìn)行的前提。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)按照試劑配制、核酸提取、擴(kuò)增等環(huán)節(jié)嚴(yán)格分區(qū)管理，規(guī)范場(chǎng)地和設(shè)備的布局[19]；制定實(shí)驗(yàn)室操作、清潔、消毒操作規(guī)范與記錄文件；保持良好通風(fēng)條件，避免出現(xiàn)陽(yáng)性標(biāo)本、氣溶膠、產(chǎn)物污染等因素導(dǎo)致的核酸檢測(cè)假陽(yáng)性。

臨床實(shí)驗(yàn)室要獲得可靠的測(cè)定結(jié)果，需要建立一個(gè)全面的質(zhì)量管理體系。在全面質(zhì)量管理體系中，實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制是一個(gè)重要的環(huán)節(jié)，對(duì)各實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制情況，不斷進(jìn)行質(zhì)量改進(jìn)，才能達(dá)到理想的質(zhì)量控制結(jié)果[20]。

綜上所述，分子生物實(shí)驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)量控制應(yīng)體現(xiàn)在核酸檢測(cè)的每一個(gè)具體環(huán)節(jié)中，保證各個(gè)環(huán)節(jié)的有效運(yùn)行，才能完善室內(nèi)質(zhì)量控制工作，充分發(fā)揮核酸檢測(cè)技術(shù)優(yōu)勢(shì)的同時(shí)保證核酸檢測(cè)結(jié)果的及時(shí)性、準(zhǔn)確性和有效性。