朱睿睿，趙玉成，秦民堅(jiān)

（中國藥科大學(xué)中藥學(xué)院，江蘇，南京211198）

黃酮類化合物是一類以二苯基色原酮為基本骨架的植物次生代謝產(chǎn)物，通常以苷與苷元的形式廣泛存在于植物體內(nèi)，可為植物的生存與繁殖提供一定的進(jìn)化優(yōu)勢［1］。此外，黃酮類化合物具有抗氧化、抗炎鎮(zhèn)痛［2］、抗心腦血管疾?。?］、抗腫瘤、保肝護(hù)肝［4］和抗病毒［5］等多種藥理活性，在醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

黃酮類化合物以2-苯基色原酮為基本母核，由兩個(gè)芳香環(huán)（A 環(huán)與B 環(huán)）通過中間三碳結(jié)構(gòu)（C 環(huán)）連接而成。如圖1 所示，黃酮類化合物可根據(jù)A 環(huán)與B環(huán)之間的三碳原子結(jié)構(gòu)是否成環(huán)、取代、氧化以及鍵飽和度等差異歸類為查爾酮、異黃酮、黃酮醇等類以及各類的二氫衍生物［6-7］。黃酮類化合物在植物中有多種生物學(xué)功能，如影響花的顏色與氣味，吸引昆蟲授粉同時(shí)提高觀賞價(jià)值［8-9］；對抗各種生物與非生物脅迫，如抵御紫外線［10］、防止微生物感染和食草動物吞食［11-12］。黃酮類化合物在人類慢性疾病方面也具有一定的治療作用，包括癌癥、糖尿病、阿爾茨海默癥等［13-17］，同時(shí)在功能食品中的應(yīng)用也越來越廣泛［18］。

圖1 黃酮類化合物基本骨架Fig.1 The structure of several flavonoids

黃烷酮是黃酮類化合物合成的直接前體，由苯丙氨酸與酪氨酸通過苯丙素途徑合成［19］。如圖2所示，葡萄糖在系列酶的催化下，生成苯丙素途徑起始底物苯丙氨酸與酪氨酸［19-20］，隨后分別在苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia-lyase，PAL）與酪氨酸解氨酶（Tyrosinase，TAL）的催化下轉(zhuǎn)化為類黃酮中間體。例如，苯丙氨酸依次在PAL、肉桂酸4-羥化酶（Cinnamate 4-hydroxylase，C4H）和4-香豆酰輔 酶A 連 接 酶（4-Coumarate：coenzyme A ligase，4CL）的作用下轉(zhuǎn)化為黃酮類化合物合成前體對香豆酰輔酶A，隨后與三分子丙二酰輔酶A（Malonyl-CoA）在查爾酮合成酶（Chalcone synthase，CHS）的作用下生成類黃酮生物合成途徑的起始底物——查爾酮［21］，進(jìn)而在一系列酶的作用下生成多種黃酮類化合物［22］。

圖2 黃酮類化合物生物合成的詳細(xì)步驟Fig.2 Detailed steps of flavonoid biosynthesis

植物提取作為黃酮類化合物的主要生產(chǎn)方式，操作工藝復(fù)雜，且產(chǎn)物常為混合體系，純化過程會增加生產(chǎn)成本，還會造成產(chǎn)品損失與活性降低［23-25］?，F(xiàn)有研究表明通過化學(xué)合成能實(shí)現(xiàn)部分黃酮類化合物的全合成［26-28］，但常伴隨極端的反應(yīng)條件，如高溫、強(qiáng)酸與強(qiáng)堿，對環(huán)境影響較大，阻礙了化學(xué)合成方法規(guī)模化和商業(yè)化應(yīng)用［28-29］。另外，通過化學(xué)合成產(chǎn)生的黃酮類化合物通常會產(chǎn)生兩種立體異構(gòu)體混合物，需經(jīng)過結(jié)構(gòu)修飾，如糖基化和手性合成以形成具有生物活性的（2S）-黃酮［30-31］。

1 微生物合成體系

1.1 大腸桿菌合成體系

隨著合成生物學(xué)與代謝工程的發(fā)展，利用微生物細(xì)胞工廠生產(chǎn)黃酮類產(chǎn)物已引起廣泛關(guān)注［25，32-33］。通過重組宿主構(gòu)建異源體系合成黃酮類化合物與其他方法相比生長周期短、易培養(yǎng)、廢棄物少、能耗低、可批量生產(chǎn)。其中，釀酒酵母與大腸桿菌的各種遺傳操作與代謝修飾已得到充分的研究，被認(rèn)為是目前最成熟的真核表達(dá)系統(tǒng)與原核表達(dá)系統(tǒng)。

大腸桿菌作為微生物細(xì)胞工廠具有高培養(yǎng)密度、高生長速率、以及易實(shí)施性等優(yōu)勢，是目前微生物生產(chǎn)平臺的首選［32-34］。Huwang 等人［35］將來自三個(gè)不同物種的PAL、4CL與CHS基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌宿主中，成功生成了柚皮素與喬松素，首次實(shí)現(xiàn)黃酮類化合物在微生物中的合成。該研究發(fā)現(xiàn)天藍(lán)色鏈霉菌中的4CL，能催化肉桂酸與4-香豆酸分別生成肉桂酰輔酶A與4-香豆酰輔酶A［35］。后續(xù)的研究中，利用大腸桿菌成功生成了多種黃酮類化合物，包括圣草酚、柚皮素、喬松素、黃芩素和野黃芩素等，表1 總結(jié)了近五年在大腸桿菌中合成黃酮類化合物的相關(guān)研究。

表1 大腸桿菌合成黃酮類化合物的相關(guān)研究Tab.1 Research on the synthesis of flavonoids production in E. coli

由于大腸桿菌缺乏真核生物特有的膜系統(tǒng)，無法滿足細(xì)胞色素P450 單加氧酶（CYP450s）的膜定位要求，也不能對蛋白進(jìn)行翻譯修飾和正確折疊，因此需要氧化還原搭檔負(fù)責(zé)電子轉(zhuǎn)移［50］。大腸桿菌從頭合成黃酮類化合物時(shí)，涉及多種CYP450 酶，這些酶活性較低，選擇性較差［51］。為解決CYP450家族基因在大腸桿菌中表達(dá)困難的問題，研究人員嘗試多種方法試圖提高其催化活性與特異性，如融合工程［52］、定向進(jìn)化方法［19］、蛋白工程［41］和底物工程［53］，雖然在一定程度上解決了低效率的問題，但效果甚微［29］。在后續(xù)研究中，引入來自細(xì)菌非P450的加氧酶和羥化酶取代植物細(xì)胞色素P450酶，可能是解決該問題的方法之一。

1.2 酵母合成體系

釀酒酵母作為一種公認(rèn)的安全菌株，適合大規(guī)模生產(chǎn)，在制藥和生物技術(shù)行業(yè)已得到廣泛的應(yīng)用［54-55］。釀酒酵母作為一種有完整膜結(jié)構(gòu)和多個(gè)細(xì)胞器的真核生物，能為生物合成提供不同環(huán)境，且能對蛋白進(jìn)行翻譯修飾與正確折疊。此外，釀酒酵母對惡劣的工業(yè)條件還具有很高的耐受性［56］。RO和Douglas 首次證實(shí)了對香豆酸是通過PAL、C4H與CPR基因共表達(dá)實(shí)現(xiàn)在重組酵母中的生產(chǎn)［57-58］，但產(chǎn)率較低。之后的研究中，酪氨酸和來自Rhodos?pidrium toruloides中的TAL基因被用來代替苯丙氨酸和C4H基因，使對香豆酸的產(chǎn)率有所提高［59］。Ro?driguez 等 人［60］引 入Flavobacterium johsoniaeu中 的TAL基因并敲除苯基丙酮酸脫羧酶ARO10基因和丙酮酸脫羧酶PDC5基因，通過過表達(dá)DHAP 合成酶ARO4基因、分支酸變位酶ARO7基因和莽草酸激酶AroL基因，減少了對香豆酸合成過程中副產(chǎn)物的生成，使對香豆酸的產(chǎn)量達(dá)到1.93 ± 0.26 g/L，為生產(chǎn)黃酮類化合物提供了一個(gè)有力的平臺宿主［60-61］。

Koopman 等人［62］結(jié)合產(chǎn)物途徑優(yōu)化、密碼子優(yōu)化、改善前體供給和減少副產(chǎn)物生成等方法，證明了釀酒酵母菌株可以利用葡萄糖從頭生產(chǎn)柚皮素。在批量培養(yǎng)體系中，柚皮素的含量超過了400 μmol/L，相較于之前的大腸桿菌菌株，產(chǎn)量增長了4 倍以上［61-63］。Rodriguez等人［64］在前期香豆酸生產(chǎn)菌株的研究基礎(chǔ)上，通過過表達(dá)4CL、CHS、CHI與CHR等基因，實(shí)現(xiàn)了柚皮素、甘草素、山奈酚、5-去氫山奈素、槲皮素和非瑟酮的從頭合成。因此，構(gòu)建高產(chǎn)的酵母菌株是進(jìn)一步合成黃酮類化合物的重要途徑，表2 總結(jié)了近幾年來黃酮類化合物在酵母菌株中的合成進(jìn)展。

表2 釀酒酵母合成黃酮類化合物的相關(guān)研究Tab.2 Research on the synthesis of flavonoids production inS. cerevisiae

2 微生物合成黃酮類化合物的優(yōu)化策略

隨著合成生物學(xué)與代謝工程的迅速發(fā)展，已實(shí)現(xiàn)了多種黃酮類化合物的微生物合成，但生產(chǎn)效率低、規(guī)模小，無法實(shí)現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物的高效合成。本文將從前體與輔因子優(yōu)化、關(guān)鍵酶高效與靶向表達(dá)、代謝通道構(gòu)建與微生物共培養(yǎng)技術(shù)等方面進(jìn)行討論，為黃酮類化合物的高效生產(chǎn)提供優(yōu)化策略。

2.1 黃酮類化合物生物合成前體的優(yōu)化

代謝通量不平衡是難以實(shí)現(xiàn)微生物高效合成黃酮類化合物的主要因素之一。作為黃酮類化合物合成前體，酪氨酸、苯丙氨酸與丙二酰輔酶A，同時(shí)也是維持細(xì)胞生長的必需前體［72］，因此目標(biāo)產(chǎn)物合成常受到前體供給不足的限制［73-74］。通過合理改造代謝途徑，平衡細(xì)胞生長和產(chǎn)物合成之間的碳通量，并引導(dǎo)其流向黃酮類化合物合成途徑是實(shí)現(xiàn)其高效合成的重要前提條件。

通過直接添加前體化合物作為初始底物在一定程度上能夠提高目標(biāo)黃酮類化合物產(chǎn)量［43，45-46，75］，但無法避免內(nèi)源性途徑的競爭消耗，且中間產(chǎn)物積累對微生物宿主也有毒性。通過基因缺失、過度表達(dá)與基因組整合等方法，調(diào)控微生物代謝網(wǎng)絡(luò)，將碳源轉(zhuǎn)化為黃酮類化合物合成前體，可提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量［48-49，76-78］。例如，過表達(dá)或突變乙酰輔酶A合酶和乙酰輔酶A羧化酶增加酶活性來提高丙二酰輔酶A含量［41，79-80］。此外，可添加脂肪酸抑制劑淺藍(lán)菌素（Cerulenin）或抑制β-酮脂酰ACP 合成酶FabB和FabF基因的表達(dá)，延緩丙二酰輔酶A 的自然降解，抑制脂肪酸合成過程對丙二酰輔酶A的消耗［81］。

構(gòu)建動態(tài)調(diào)控元件微調(diào)細(xì)胞生長和產(chǎn)物合成之間的碳通量是提高微生物合成效率的另一種思路［42，82-84］。Wu 等人［82］通過反義RNA 對大腸桿菌脂肪酸通路進(jìn)行調(diào)控，使黃酮類化合物合成通路中丙二酰輔酶A含量增加，結(jié)果（2S）-柚皮素的生產(chǎn)效價(jià)提高了431%。通過CRISPR 干擾敲除脂肪酸生物合成基因fabB、fabI和fabF，增加細(xì)胞內(nèi)丙二酰輔酶A 的濃度，使白藜蘆醇的產(chǎn)量提高到188.1 mg/L，相比對照菌株提高了6倍［83］。此外，選擇耶氏酵母屬、念珠菌屬、油脂酵母屬和紅酵母屬等可積累大量丙二酰輔酶A 的微生物作為黃酮合成的宿主［29，85-87］，也可以在一定程度上改善前體供應(yīng)不足的問題。

2.2 黃酮類化合物生物合成輔因子優(yōu)化

輔因子的供應(yīng)對黃酮類化合物合成途徑關(guān)鍵酶的活性表達(dá)有重要影響，從而進(jìn)一步影響目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)率。細(xì)胞自身產(chǎn)生的腺嘌呤核苷三磷酸（Ade?nosine triphosphate，ATP）能夠保證細(xì)胞自身各項(xiàng)生命活動，但異源黃酮合成途徑對ATP 的需求會超過細(xì)胞原有的產(chǎn)出。因此，增加黃酮生物合成通路中的ATP 供應(yīng)十分重要。在Tao 等人［32，88］的研究中采用CRISPR 干擾技術(shù)篩選了與ATP 合成相關(guān)的候選基因，發(fā)現(xiàn)上調(diào)metK基因和proB基因能增加ATP含量，使喬松素產(chǎn)量提高至165.31 mg/L，比對照菌株高10.2倍。另外，還原型輔酶Ⅱ（NADPH）輔因子作為合成代謝的供氫體，不僅參與細(xì)胞體內(nèi)羥化反應(yīng)，也是Ⅱ類P450酶重要輔助因子［89］。通過加強(qiáng)戊糖磷酸途徑代謝通量，改善細(xì)胞內(nèi)的NADPH 水平，能夠提高P450 酶的活性。Zhao 等人［90］將生產(chǎn)兒茶酸菌株中的pgi基因（編輯葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶）和ppc基因（編碼PEP 羧化酶）敲除，提高細(xì)胞內(nèi)NADPH 的水平，使兒茶酸的產(chǎn)量比對照菌株相比高出943%。根據(jù)黃酮類化合物合成途徑酶活性表達(dá)的條件，優(yōu)化FAD（黃素腺嘌呤二核苷酸）［91］、亞鐵血紅素［92］等輔助因子的供應(yīng)［32］，均可在一定程度上提升黃酮類化合物的產(chǎn)量。

2.3 優(yōu)化途徑酶的高效表達(dá)與靶向性

過度表達(dá)黃酮類化合物合成途徑酶增加代謝通量，不僅會導(dǎo)致低效碳利用，還會給細(xì)胞帶來代謝負(fù)擔(dān)［93-94］。因此，提高限速酶活性實(shí)現(xiàn)目標(biāo)化合物高效合成的同時(shí)平衡基因表達(dá)保持最佳細(xì)胞生長狀態(tài)也十分重要。例如，為篩選較高活性的4CL，通過TtgR 調(diào)控系統(tǒng)設(shè)計(jì)感知4CL 產(chǎn)物積累量的生物傳感器［94-95］，識別體內(nèi)定向進(jìn)化后活性增強(qiáng)的4CL突變體，使柚皮素的產(chǎn)量有所增加［95］。

此外，在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)黃酮類化合物高效合成，需改善合成途徑中與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的植物細(xì)胞色素P450 單加氧酶的功能表達(dá)。通過對宿主大腸桿菌進(jìn)行改造、優(yōu)化反應(yīng)體系以及利用來自細(xì)菌的非P450 單加氧酶和羥化酶對P450 酶進(jìn)行替換，可改善黃酮類化合物生物合成途徑的限速反應(yīng)。對于其他異源基因在宿主菌中的低效表達(dá)，通過選擇合適的啟動子、優(yōu)化密碼子以及通過優(yōu)化UTR（mRNA降解過程中發(fā)揮作用）提高mRNA 穩(wěn)定性等方法，均能在一定程度上提高基因的表達(dá)率。

微調(diào)關(guān)鍵酶基因不同組成成分（如啟動子強(qiáng)度、核糖體結(jié)合位點(diǎn)強(qiáng)度）可以有效平衡基因表達(dá)水平［96］，但當(dāng)目標(biāo)黃酮類產(chǎn)物合成通路涉及多條靶基因時(shí)，實(shí)現(xiàn)關(guān)鍵酶基因平衡表達(dá)耗時(shí)耗力［32］。在一項(xiàng)研究中，通過構(gòu)建基因啟動子的所有組合，通過迭代高通量篩選，徹底調(diào)整微生物中柚皮素的生物合成途徑，最終柚皮素的產(chǎn)量可達(dá)到191.9 mg/L［42］。除了要考慮途徑酶的平衡表達(dá)，還要考慮酶的催化環(huán)境和靶向性。例如，利用酵母菌株生產(chǎn)淫羊藿苷時(shí)，若在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，通路中甲基轉(zhuǎn)移酶GmOMT2 會因細(xì)胞質(zhì)pH 低而失活，將該酶重新定位至釀酒酵母線粒體（pH高于細(xì)胞質(zhì)）后，首次實(shí)現(xiàn)了以葡萄糖為原料合成淫羊藿苷［71］。

2.4 優(yōu)化黃酮類化合物合成代謝通道

天然黃酮類化合物是植物為抵抗外源刺激與微生物侵染而產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，對微生物宿主細(xì)胞存在一定的毒性。因此，通過采用代謝通道技術(shù)，將反應(yīng)物從一個(gè)活性位點(diǎn)直接轉(zhuǎn)移至另一個(gè)活性位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)底物向黃酮類化合物的高效轉(zhuǎn)化，可有效降低細(xì)胞代謝負(fù)擔(dān)、毒性中間體積累以及防止底物擴(kuò)散［97-98］。設(shè)計(jì)蛋白支架，控制酶促反應(yīng)的空間區(qū)域，可實(shí)現(xiàn)底物的充分利用和酶的高效表達(dá)［99］。例如，在Zhao 等人［90］的研究中，采用組合策略，將兒茶素合成途徑中的F3H、DFR 和LAR 等酶的結(jié)構(gòu)域構(gòu)建成特定的合成蛋白支架，實(shí)現(xiàn)代謝通道結(jié)構(gòu)，使兒茶素的產(chǎn)量增加了155.6%。在甲戊酸、葡糖二酸等物質(zhì)生物合成過程中引入蛋白支架，也在一定程度上提高了產(chǎn)量［99］。然而，目前合成蛋白支架在黃酮類化合物生物合成方面鮮有應(yīng)用，但與其相似的方法卻已有所涉及。將黃酮類化合物合成途徑酶組裝為復(fù)合體，雖然不是真正的支架復(fù)合體，但原理都是將酶強(qiáng)制靠近，減少中間體的積累，消除路徑瓶頸［100］。例如，通過開發(fā)黃芩素兩個(gè)途徑酶的序列自組裝酶反應(yīng)器，在大腸桿菌中成功實(shí)現(xiàn)了蛋白-肽相互作用［101］，優(yōu)化了黃芩素的生物合成途徑，使黃芩素和野黃芩素等產(chǎn)物產(chǎn)率都有所提升［101］。

2.5 微生物共培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)黃酮類化合物

黃酮類化合物合成菌株代謝途徑復(fù)雜，傳統(tǒng)的微生物代謝工程主要使用單一的菌株構(gòu)建黃酮類化合物生產(chǎn)平臺，使菌體負(fù)荷過大，目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量也受到限制。因此，可通過共培養(yǎng)技術(shù)構(gòu)建高效的合成通路，提高生產(chǎn)性能［102］。例如，Jones 等人將花青素合成途徑涉及的15 個(gè)外源基因整合到4 個(gè)不同的大腸桿菌菌株中，獲得的混合菌株培養(yǎng)體系能夠從葡萄糖從頭生成阿福豆素和翠菊苷。共培養(yǎng)可以克服單一物種的固有限制，同時(shí)利用大腸桿菌和釀酒酵母生產(chǎn)黃酮類化合物［102］。P450 酶在大腸桿菌中很難實(shí)現(xiàn)功能表達(dá)，Wang等人［71］將淫羊藿苷合成途徑分為釀酒酵母部分與大腸桿菌部分，不僅可以發(fā)揮大腸桿菌快繁的優(yōu)勢，同時(shí)也能利用釀酒酵母完整的胞內(nèi)酶系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)膜蛋白酶的成功表達(dá)。微生物共培養(yǎng)體系在緩解菌體代謝負(fù)擔(dān)、避免中間產(chǎn)物負(fù)反饋?zhàn)饔靡约盀椴煌拿笭I造適宜生長環(huán)境等方面均優(yōu)于單一菌株培養(yǎng)體系，但仍然無法避免不同菌株之間無親和性、底物競爭性、代謝中間體轉(zhuǎn)運(yùn)困難等問題［103］。代謝產(chǎn)物運(yùn)輸?shù)南拗坪碗y以保持穩(wěn)定可靠的共培養(yǎng)體系是該方法廣泛應(yīng)用的主要挑戰(zhàn)［38］。因此，進(jìn)一步優(yōu)化現(xiàn)有的共培養(yǎng)體系或?qū)で笮碌牟呗詠砜朔@一問題十分重要。

2.6 其他問題

近20年來，多種代謝工程技術(shù)和策略已用于黃酮類化合物的微生物合成，然而部分相關(guān)酶功能尚不清晰，已知功能的酶數(shù)量有限。隨著研究的不斷深入，已有研究通過對現(xiàn)有的酶進(jìn)行定向進(jìn)化，以期獲得特定活性的酶。例如，Wu 等人［104］通過計(jì)算機(jī)快速測試蛋白空間序列，篩選出具有預(yù)期活性的酶突變體，為新酶的發(fā)現(xiàn)提供了新的方法，但實(shí)現(xiàn)對蛋白質(zhì)從頭設(shè)計(jì)還是具有一定的挑戰(zhàn)性。在最近的研究中，通過調(diào)節(jié)分子間和分子內(nèi)相互作用，開發(fā)出了酶從頭合成的新方法，極大地促進(jìn)了生物合成新途徑的構(gòu)建［105］。

3 總結(jié)與展望

黃酮類化合物作為一種在人類健康與醫(yī)療領(lǐng)域具有巨大應(yīng)用潛力的植物次生代謝產(chǎn)物，對其進(jìn)行微生物合成途徑的研究具有重要科研意義與經(jīng)濟(jì)價(jià)值。但傳統(tǒng)生產(chǎn)方法成本高、提取工藝復(fù)雜，產(chǎn)品效價(jià)與收率低，難以大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用。隨著黃酮類化合物合成途徑酶的鑒定與驗(yàn)證，以及分子生物學(xué)與合成生物學(xué)的快速發(fā)展，黃酮類化合物微生物合成途徑得到了深入的研究，并取得大量成果，但仍然無法滿足工業(yè)化需求。為進(jìn)一步優(yōu)化現(xiàn)有合成體系，需要不斷尋找新的策略以及技術(shù)克服黃酮化合物微生物合成中面臨的問題與挑戰(zhàn)。

黃酮類化合物的從頭合成途徑較長，因此，微生物共培養(yǎng)技術(shù)與動態(tài)調(diào)控技術(shù)可能是今后研究中提高產(chǎn)率的主要策略。通過擴(kuò)大共培養(yǎng)技術(shù)中微生物的種類，并根據(jù)各種微生物的生理生化特點(diǎn)與培養(yǎng)特性，對代謝途徑進(jìn)行合理分工，均能在一定程度上提高黃酮類產(chǎn)物的產(chǎn)量。利用高通量篩選與動態(tài)調(diào)控技術(shù)，調(diào)控菌株間的相互作用與各反應(yīng)步驟之間的動態(tài)平衡，有望實(shí)現(xiàn)從頭高效合成黃酮類化合物。我們相信，隨著研究逐漸深入與技術(shù)不斷發(fā)展，終能實(shí)現(xiàn)微生物合成黃酮類化合物的工業(yè)化生產(chǎn)。