孫銀鳳 楊丹 白敏 宋冰 康萬榮汪永鋒*張延英*

(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué),蘭州 730000;2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)甘肅省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行業(yè)技術(shù)中心,蘭州 730000)

急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)作為病情復(fù)雜、并發(fā)癥多、病死率高的急腹癥,易合并心、腦、肺、腎、肝等臟器的損害,發(fā)生多系統(tǒng)器官功能衰竭[1]。肝是AP 最易受損器官之一,15%～60%的AP 患者會(huì)合并肝損傷[2]。大黃牡丹湯由大黃、芒硝、丹皮、桃仁、冬瓜仁5 味中藥組成,共奏瀉熱破瘀、通腑散結(jié)之效。本課題組前期研究表明該方能夠有效改善AP 模型大鼠肝腎功能損傷,降低炎性因子水平,促進(jìn)胰腺組織修復(fù)[3-6]。目前AP 肝損傷發(fā)病機(jī)制尚未明確,研究發(fā)現(xiàn)AP 肝損傷的發(fā)病進(jìn)展與炎性因子級(jí)聯(lián)效應(yīng)息息相關(guān),PI3K/Akt/NF-κB途徑與炎癥介質(zhì)密切相關(guān)。因此,本研究進(jìn)一步基于PI3K/Akt/NF-κB 信號(hào)通路關(guān)鍵分子深入探討大黃牡丹湯對(duì)AP 肝損傷的保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

96 只2 月齡SPF 級(jí)雄性Wistar 大鼠,體重(200± 20)g,購(gòu)自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SCXK(甘)2020-0001】。飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SYXK(甘)2020-0009】。飼養(yǎng)條件:飲水自由,晝夜各半循環(huán)照明,濕度恒定45%～55%,溫度維持21～25℃,常規(guī)飼養(yǎng)2 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。正式實(shí)驗(yàn)前常規(guī)飼養(yǎng)1 周,所有操作均遵守甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理原則(審批號(hào):2021-242)。

1.1.2 主要試劑與儀器

大黃牡丹湯實(shí)驗(yàn)處方[7]:大黃、桃仁、芒硝,牡丹皮,冬瓜子,常規(guī)煎煮至濃度達(dá)到1 g/mL,4℃冷藏備用。奧曲肽,國(guó)藥一心制藥有限公司,171003;牛磺膽酸鈉,北京索萊寶科技有限公司,1111J051;大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA 試劑盒,上海酶聯(lián)生物科技有限公司,05/2021;PI3K 抗體,abcam 公司,GR3192684-9;p-Akt 抗體、Bax 抗體、Bcl-2 抗體、GAPDH 抗 體,ImmunoWay 公 司,B0601、B5501、B4101、B1501;p-NF-κB p65 抗 體,GeneTex 公 司,821904930。微量注射泵(深圳圣諾醫(yī)療設(shè)備有限公司,SN-50T6,中國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型復(fù)制

采用3%戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉,按文獻(xiàn)[8-9]方法復(fù)制AP 大鼠模型,麻醉后將大鼠固定,進(jìn)行剔毛和消毒,然后于劍突下切開,充分顯露胰膽管與十二指腸,夾閉胰膽管遠(yuǎn)端,從十二指腸腸壁穿刺進(jìn)入胰膽管,用動(dòng)脈夾固定針頭。將5%?；悄懰徕c溶液使用微量泵恒速向胰膽管管內(nèi)注入,注射完成后,繼續(xù)夾閉5 min,然后取下頭皮針,等待5 min 后逐層縫合即可。

1.2.2 動(dòng)物分組及實(shí)驗(yàn)干預(yù)

大黃牡丹湯折算劑量參考《中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[10],根據(jù)人大鼠體表面積換算,大黃牡丹湯高、中、低組分別給予(14、7、3.5 g/kg)?？瞻捉M、模型組給予等體積蒸餾水灌胃。奧曲肽組予10 μg/kg奧曲肽背部皮下注射。各治療組分別于造模前1 h、造模后12、24 h 分別給藥治療。

1.2.3 樣本采集及指標(biāo)檢測(cè)

采用3%戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉,心臟采血后,離心機(jī)統(tǒng)一分離血清并凍存,取胰腺和肝組織,部分組織用4%多聚甲醛固定,部分組織-80℃冰箱凍存。

1.2.4 各組大鼠一般狀態(tài)。

觀察大鼠的精神和活動(dòng)狀態(tài)、扭體反應(yīng)、弓背反應(yīng)及便質(zhì)改變等情況。

1.2.5 各組大鼠胰腺、肝組織病理學(xué)改變

取用甲醛固定的胰腺組織和肝組織,進(jìn)行HE染色,脫蠟→覆水→蘇木精染色→乙酸分化→伊紅染色→脫水→封片等步驟,然后選取合適的放大倍數(shù)觀察胰腺、肝組織病理形態(tài)變化,肝組織HE 染色完畢后,參照Camargo 等[11]病理組織評(píng)分法對(duì)肝組織鏡下病理進(jìn)行評(píng)分(見表1)。

表1 肝組織鏡下病理評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Pathological scoring criteria of liver tissue under microscope

1.2.6 血清生化指標(biāo)檢測(cè)

取凍存血清,用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)AMS、ALT、AST、ChE、CRP 含量。

1.2.7 ELISA 法檢測(cè)各組大鼠肝組織TNF-α、IL-1β、IL-6 含量

將肝組織制備成勻漿液,用ELISA 試劑盒進(jìn)行檢測(cè)各組大鼠肝組織TNF-α、IL-1β、IL-6 含量,一切操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行,依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算肝組織勻漿樣本中各個(gè)指標(biāo)的含量。

1.2.8 Western Blot 法檢測(cè)各組大鼠肝組織PI3K、p-Akt、p-NF-κB p65、Bcl-2、Bax 蛋白表達(dá)水平

各組大鼠干預(yù)24 h 后,將肝組織勻漿后,提取總蛋白并測(cè)定濃度,然后電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉,分別經(jīng)過一抗過夜、二抗孵育和曝光等步驟,用Image J 軟件進(jìn)行掃描并分析條帶。以GAPDH 為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié)果用平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差()表示。采用SPSS 24.0 軟件處理所有數(shù)據(jù),組間均數(shù)差異的比較用方差分析,方差齊用LSD 法比較,方差不齊用Tamhane′s T2 法比較。以P＜0.05 表示差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 大黃牡丹湯對(duì)各組大鼠一般體征的影響

空白組大鼠一切體征正常,無異常反應(yīng)出現(xiàn);而模型組大鼠在造模后出現(xiàn)精神倦怠,瞇眼,毛色雜亂,弓背、紐體反應(yīng)明顯;各治療組在藥物干預(yù)后觀察到上述體征均有不同程度改善,其中大黃牡丹湯高劑量組大鼠的改善作用最為明顯。

2.2 大黃牡丹湯對(duì)各組大鼠胰腺組織HE 染色觀察

如圖1 所示,空白組大鼠的胰腺組織病理切片未見異常改變,模型組大鼠可見胰腺腺泡間隙擴(kuò)張,間質(zhì)水腫和充血,部分腺泡細(xì)胞壞死,內(nèi)含大量炎細(xì)胞浸潤(rùn);各治療組大鼠可見部分腺泡細(xì)胞水腫、出血及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)均有不同程度減輕,尤以大黃牡丹湯高劑量組胰腺組織損傷程度最輕。

圖1 各組大鼠胰腺組織病理變化Figure 1 Pathological changes of pancreatic tissue of rats in each group

2.3 大黃牡丹湯對(duì)各組大鼠肝組織HE 染色觀察

如圖2 所示,空白組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整,肝細(xì)胞大小均勻,無變性、壞死等病理改變,無炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);模型組大鼠局部可見肝細(xì)胞點(diǎn)狀壞死,明顯充血、水腫,胞質(zhì)內(nèi)可見微小的圓形脂肪空泡,并伴有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn);各治療組大鼠血管充血、水腫明顯減輕,偶見點(diǎn)狀壞死,少量炎細(xì)胞浸潤(rùn),肝組織炎癥明顯改善,未發(fā)現(xiàn)片狀壞死等情況,以大黃牡丹湯高劑量組肝組織損傷程度最輕。

圖2 各組大鼠肝組織病理變化Figure 2 Pathological changes of liver tissue of rats in each group

2.4 大黃牡丹湯對(duì)各組大鼠肝組織病理學(xué)評(píng)分的影響

空白組大鼠基本處于0 分區(qū)域,模型組大鼠6只處于3 分區(qū)域,2 只處于2 分區(qū)域,奧曲肽組大鼠1、2、3 分區(qū)域均散見,大黃牡丹湯高劑量組大鼠集中散于1、2 分區(qū)域,中劑量組超過半數(shù)散于2 分區(qū)域,低劑量組多處于2、3 分區(qū)域,大黃牡丹湯組大鼠明顯呈劑量依賴性,提示大黃牡丹湯能夠有效改善大鼠肝損傷(見表2)。

表2 大黃牡丹湯對(duì)AP 大鼠模型肝損傷病理分級(jí)的影響(n=8)Table 2 Effects of Dahuang Mudan Decoction on the pathological grading of liver injury in AP rat model(n=8)

2.5 大黃牡丹湯對(duì)各組大鼠生化指標(biāo)的影響

與空白組比較,模型組大鼠AMS、ALT、AST、CRP 含量顯著性升高,而ChE 含量顯著性降低(P＜0.05);在各治療組大鼠中AMS、ALT、AST、CRP 含量均有下降趨勢(shì),而ChE 含量有上升趨勢(shì),其中尤以大黃牡丹湯高劑量組顯著(P＜0.05)(見表3)。

表3 大黃牡丹湯對(duì)AP 大鼠肝組織AMS、ALT、AST、ChE、CRP 含量的影響(,n=6)Table 3 Effects of DaHuang MuDan Decoction on the contents of AMS,ALT,AST,ChE and CRP liver tissues of AP rats(,n=6)

表3 大黃牡丹湯對(duì)AP 大鼠肝組織AMS、ALT、AST、ChE、CRP 含量的影響(,n=6)Table 3 Effects of DaHuang MuDan Decoction on the contents of AMS,ALT,AST,ChE and CRP liver tissues of AP rats(,n=6)

注:與空白組比較,#P ＜0.05;與模型組比較,*P ＜0.05;與低劑量組比較,△P ＜0.05。(下表同)Note.Compared with blank group,#P ＜0.05.Compared with model group,*P ＜0.05.Compared with low-dose group,△P ＜0.05.(The same in the following tables)

2.6 大黃牡丹湯對(duì)各組大鼠肝組織TNF-α、IL-1β、IL-6 含量水平的影響

與空白組比較,模型組大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6含量顯著升高(P＜0.05);與模型組比較,各治療組大鼠上述指標(biāo)均呈下降趨勢(shì),其中尤以大黃牡丹湯高劑量組顯著(P＜0.05)(見表4)。

表4 大黃牡丹湯對(duì)AP 大鼠肝組織TNF-α、IL-1β、IL-6 含量的影響(,n=6)Table 4 Effects of DaHuang Mudan Decoction on the contents of TNF-α,IL-1β and IL-6 in liver tissues of AP rats(,n=6)

表4 大黃牡丹湯對(duì)AP 大鼠肝組織TNF-α、IL-1β、IL-6 含量的影響(,n=6)Table 4 Effects of DaHuang Mudan Decoction on the contents of TNF-α,IL-1β and IL-6 in liver tissues of AP rats(,n=6)

2.7 大黃牡丹湯對(duì)各組大鼠肝組織PI3K、p-Akt、p-NF-κB p65、Bcl-2、Bax 蛋白表達(dá)的影響

與空白組相比,模型組大鼠肝組織PI3K、p-Akt、p-NF-κB p65、Bax 蛋白表達(dá)顯著升高,而Bcl-2 蛋白表達(dá)呈下降趨勢(shì)(P＜0.05);與模型組比,各治療組大鼠PI3K、p-Akt、p-NF-κB p65、Bax 蛋白表達(dá)均不同程度下降,而Bcl-2 蛋白表達(dá)不同程度上升,其中尤以大黃牡丹湯高劑量組顯著(P＜0.05)(見表5、圖3)。

圖3 大黃牡丹湯對(duì)各組大鼠肝組織PI3K、p-Akt、p-NF-κB p65、Bcl-2、Bax 蛋白表達(dá)電泳Figure 3 Protein expression electrophoresis of PI3K,p-Akt,p-NF-κB p65,Bcl-2 and Bax in liver tissues of rats in each group treated by Rhubarb Mudan Decoction

表5 大黃牡丹湯對(duì)各組大鼠肝組織PI3K、p-Akt、p-NF-κB p65、Bcl-2、Bax 蛋白表達(dá)水平的影響(,n=3)Table 5 Effects of DaHuang Mudan Decoction on the protein expression levels of PI3K,p-Akt,p-NF-κB p65,Bcl-2 and Bax in liver tissues of rats in each group(,n=3)

表5 大黃牡丹湯對(duì)各組大鼠肝組織PI3K、p-Akt、p-NF-κB p65、Bcl-2、Bax 蛋白表達(dá)水平的影響(,n=3)Table 5 Effects of DaHuang Mudan Decoction on the protein expression levels of PI3K,p-Akt,p-NF-κB p65,Bcl-2 and Bax in liver tissues of rats in each group(,n=3)

3 討論

AP 發(fā)生時(shí),PI3K/Akt 通路活化,可以誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子(如TNF-α、IL-6、IL-1β)的趨化和表達(dá),導(dǎo)致“炎癥級(jí)聯(lián)風(fēng)暴反應(yīng)”,進(jìn)一步損傷其他器官,肝與胰腺毗鄰,AP 發(fā)生時(shí)產(chǎn)生的炎癥因子可通過局部擴(kuò)散或門靜脈血流進(jìn)入肝直接損傷肝細(xì)胞,使得肝損傷成為AP 發(fā)生時(shí)重要的并發(fā)癥[12-13]。

大黃牡丹作為張仲景的經(jīng)方之一,出自《金匱要略》,主治濕熱蘊(yùn)結(jié),氣血凝滯所致腸癰。方中大黃與丹皮二者合用,共瀉腸腑濕熱瘀結(jié),為方中君藥。芒硝和桃仁俱為臣藥,其中芒硝助大黃蕩滌實(shí)熱,促其速下;桃仁破血逐瘀,協(xié)君藥以通淤滯。冬瓜仁清理利濕,排膿消癰,滌蕩濕熱,是為佐藥。本方瀉熱與逐瘀并用,使瘀結(jié)濕熱速下,痛隨利減,癰腫得消,諸癥自愈。

在AP 炎癥期間,炎性細(xì)胞因子使PI3K/Akt/NF-κB 通路活化,活化的NF-κB 轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)入細(xì)胞核,恢復(fù)其轉(zhuǎn)錄激活活性。NF-κB 的活化可以誘導(dǎo)促炎因子的表達(dá),進(jìn)而趨化大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、聚集到炎癥部位,最終導(dǎo)致炎癥反應(yīng)[12]。

AP 在發(fā)展過程中,炎癥級(jí)聯(lián)效應(yīng)的爆發(fā),使大量炎癥因子進(jìn)入肝,引起肝細(xì)胞的異常凋亡。Lapierre 等[14]發(fā)現(xiàn),AP 發(fā)生時(shí)肝細(xì)胞的異常凋亡與肝的損傷程度密切相關(guān),且組織損傷情況與病理改變相符合。劉宏等[15]研究發(fā)現(xiàn),AP 肝損傷大鼠肝細(xì)胞異常凋亡數(shù)量與凋亡指數(shù)呈正相關(guān)。Bcl-2 蛋白家族包括抗凋亡蛋白(Bcl-2) 和促凋亡蛋白(Bax),Bax/Bcl-2 比率的升高是細(xì)胞凋亡的原因之一,因此,可通過降低Bax/Bcl-2 的比率來減輕肝損傷[16]。

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)凋亡相關(guān)蛋白(Bcl-2 和Bax)的檢測(cè),發(fā)現(xiàn)蛋白表達(dá)含量治療前后有差異變化,但在病理切片上并未明確改變,以待后續(xù)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,模型組AP 大鼠一般生存狀態(tài)相對(duì)較差,肝組織中PI3K、p-Akt、p-NF-κB p65 蛋白表達(dá)顯著升高,炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β 的分泌水平顯著升高。與模型組比較,各治療組AP 大鼠的一般生存狀態(tài)不同程度緩解,肝組織病理損傷不同程度修復(fù),ELISA 結(jié)果表明TNF-α、IL-1β、IL-6含量呈下降趨勢(shì),肝組織中PI3K、p-Akt、p-NF-κB p65、Bax 蛋白表達(dá)水平均呈下降趨勢(shì),其中大黃牡丹湯高劑量干預(yù)效果最為顯著。這可能與高劑量大黃牡丹湯有效抑制了PI3K/Akt/NF-κB 信號(hào)通路的活化,進(jìn)而抑制TNF-α、IL-1β、IL-6 等炎性因子的異常分泌,減輕了由此產(chǎn)生的炎性風(fēng)暴級(jí)聯(lián)放大反應(yīng),提高了肝的防御功能,進(jìn)而減輕了肝損傷。